Beskrivet här är ett protokoll för halvautomatiserad avbildning av vävnadsspecifik fluorescens i zebrafiskembryon.
Zebrafiskembryon är ett kraftfullt verktyg för storskalig screening av små molekyler. Transgen zebrafisk som uttrycker fluorescerande reporterproteiner används ofta för att identifiera kemikalier som modulerar genexpression. Kemiska skärmar som analys fluorescens i levande zebrafisk är ofta beroende dyra, specialutrustning för hög halt screening. Vi beskriver ett förfarande med en vanlig epifluorescensmikroskop med en motoriserad scen till automatiskt bildzebrafisk embryon och upptäcka vävnadsspecifik fluorescens. Med hjälp av transgena zebrafisk som rapporterar östrogenreceptoraktivitet via uttryck av GFP, utvecklade vi en halvautomatisk förfarande för att screena för östrogenreceptorligander som aktiverar reportern i ett vävnadsspecifikt sätt. I denna video beskriver vi förfaranden för grupperande zebrafiskembryon vid 24-48 timmar efter befruktning (HPF) i en 96-brunnsplatta och tillsats av små molekyler som binder östrogenreceptorer. Vid 72-96 HPF, bilder av varje brunn frånhela plattan automatiskt samlas in och manuellt inspekteras för vävnadsspecifik fluorescens. Detta protokoll demonstrerar förmågan att detektera östrogener som aktiverar receptorer i hjärtklaffar, men inte i lever.
Transgen zebrafisk har utvecklats som gör det möjligt att direkt visualisering av aktivitet i signalvägar, exempelvis fibroblasttillväxtfaktörer 1, retinoinsyra 2 och östrogener 3, i levande embryon. Sådana verktyg möjliggör screening för kemikalier som stör signalvägar (analyserade som förändring i fluorescensintensiteten) eller för kemikalier som modulerar signalering i ett vävnadsspecifikt sätt (förändring i fluorescens lokalisering) 4. Automatisk bildtagning ökar genomströmningen av kemiska skärmar dramatiskt 5,6. Skärmar som automatiskt analys fluorescens i levande zebrafisk litar ofta på dyra, specialutrustning. Så kallade high-halt screening ger fördelen med hög upplösning, kvantitativ avbildning men till priset av att använda specialiserade plattläsare utrustade för konfokalmikroskopi 7,8. Målet med denna metod är att automatiskt analysvävnadsspecifika fluorescens i zebrafisk embryoni en 96-brunnars platta med användning av en standard-epifluorescensmikroskop. Tissue-specifik fluorescens kan urskiljas med hjälp av denna teknik och kan vara en rimlig strategi för laboratorier som saknar tillgång till specialiserade plattläsare eller hög halt screening utrustning.
I detta protokoll använder vi automatiserad bildbehandling för att upptäcka vävnadsspecifik östrogenreceptorn (ER) agonister i levande zebrafisk på 3 dagar efter befruktningen (DPF). Den transgena linje Tg (5xERE: GFP) c262/c262 innehåller fem tandemöstrogenresponselement-DNA-sekvenser (ERE) uppströms från grönt fluorescerande protein (GFP) 3. I frånvaro av ligand, ER är normalt inaktiva. Ligandbindning utlöser en konformationsförändring, vilket gör receptorer att binda ERE DNA och reglerar transkriptionen 9. 5xERE: GFP fisk kan användas för att screena kemiska bibliotek för ER-modulatorer och kan användas för att screena prover omgivningsvatten för östrogena föroreningar.
Detta protokoll beskriver en enkel metod för att automatiskt bildvävnadsspecifika fluorescens i zebrafisk embryon. Det protokoll som har utvecklats med hjälp av en Zeiss Axio Observer. Z1 med Zen Blue 2011 programvara, men den teknik som kan anpassas för användning av någon inverterat mikroskop med en motoriserad scen och programvara mikroskop kontroll som kan utföra plattsättning för att skapa sammansatta bilder. Att utrusta ett inverterat mikroskop med en motoriserad skede kan ge en praktisk, billigare altern…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Susan Farmer och personalen på UAB zebrafisk forskningsanläggning för zebrafisk vård. Finansieringen tillhandahålls av startpeng från Institutionen för farmakologi och toxikologi.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |