Semi-automatisk avbildning av vävnad-specifika fluorescens i Zebrafish embryon

Summary

Beskrivet här är ett protokoll för halvautomatiserad avbildning av vävnadsspecifik fluorescens i zebrafiskembryon.

Abstract

Zebrafiskembryon är ett kraftfullt verktyg för storskalig screening av små molekyler. Transgen zebrafisk som uttrycker fluorescerande reporterproteiner används ofta för att identifiera kemikalier som modulerar genexpression. Kemiska skärmar som analys fluorescens i levande zebrafisk är ofta beroende dyra, specialutrustning för hög halt screening. Vi beskriver ett förfarande med en vanlig epifluorescensmikroskop med en motoriserad scen till automatiskt bildzebrafisk embryon och upptäcka vävnadsspecifik fluorescens. Med hjälp av transgena zebrafisk som rapporterar östrogenreceptoraktivitet via uttryck av GFP, utvecklade vi en halvautomatisk förfarande för att screena för östrogenreceptorligander som aktiverar reportern i ett vävnadsspecifikt sätt. I denna video beskriver vi förfaranden för grupperande zebrafiskembryon vid 24-48 timmar efter befruktning (HPF) i en 96-brunnsplatta och tillsats av små molekyler som binder östrogenreceptorer. Vid 72-96 HPF, bilder av varje brunn frånhela plattan automatiskt samlas in och manuellt inspekteras för vävnadsspecifik fluorescens. Detta protokoll demonstrerar förmågan att detektera östrogener som aktiverar receptorer i hjärtklaffar, men inte i lever.

Introduction

Transgen zebrafisk har utvecklats som gör det möjligt att direkt visualisering av aktivitet i signalvägar, exempelvis fibroblasttillväxtfaktörer ^1, retinoinsyra ² och östrogener ^3, i levande embryon. Sådana verktyg möjliggör screening för kemikalier som stör signalvägar (analyserade som förändring i fluorescensintensiteten) eller för kemikalier som modulerar signalering i ett vävnadsspecifikt sätt (förändring i fluorescens lokalisering) ^4. Automatisk bildtagning ökar genomströmningen av kemiska skärmar dramatiskt ^5,6. Skärmar som automatiskt analys fluorescens i levande zebrafisk litar ofta på dyra, specialutrustning. Så kallade high-halt screening ger fördelen med hög upplösning, kvantitativ avbildning men till priset av att använda specialiserade plattläsare utrustade för konfokalmikroskopi ^7,8. Målet med denna metod är att automatiskt analysvävnadsspecifika fluorescens i zebrafisk embryoni en 96-brunnars platta med användning av en standard-epifluorescensmikroskop. Tissue-specifik fluorescens kan urskiljas med hjälp av denna teknik och kan vara en rimlig strategi för laboratorier som saknar tillgång till specialiserade plattläsare eller hög halt screening utrustning.

I detta protokoll använder vi automatiserad bildbehandling för att upptäcka vävnadsspecifik östrogenreceptorn (ER) agonister i levande zebrafisk på 3 dagar efter befruktningen (DPF). Den transgena linje Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 innehåller fem tandemöstrogenresponselement-DNA-sekvenser (ERE) uppströms från grönt fluorescerande protein (GFP) ^3. I frånvaro av ligand, ER är normalt inaktiva. Ligandbindning utlöser en konformationsförändring, vilket gör receptorer att binda ERE DNA och reglerar transkriptionen ^9. 5xERE: GFP fisk kan användas för att screena kemiska bibliotek för ER-modulatorer och kan användas för att screena prover omgivningsvatten för östrogena föroreningar.

Protocol

OBS: Detta protokoll godkändes av University of Alabama i Birmingham Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Zebrafish Avel och ägg samlingar Tre dagar innan kemisk exponering, montera avelstankar med avdelare till separata män och kvinnor. Fyll varje tank halvvägs med vattenbruk systemet vatten. Med hjälp av ett nät, överföra Tg (5xERE: GFP) c262/c262 fisk till avelstankar, placera 2 hanar och 3 honor i varje tank åtskilda av en avdel…

Representative Results

Fig. 1 visar sammansatta bilder från enskilda brunnar i en 96-brunnsplatta. Varje sammansatt bild är sammansatt av 59 enskilda bilder med 5% bild överlappning. Observera att levande zebrafisk är orienterade slumpmässigt inom varje brunn, men vi kan urskilja fluorescens i hjärtat från levern. Brightfield bilder är användbara som referenser för att bedöma zebrafisk orientering och visualisera morfologiska abnormiteter (figurerna 1A och 1C). Automatiserad avbildning med en 10x m…

Discussion

Detta protokoll beskriver en enkel metod för att automatiskt bildvävnadsspecifika fluorescens i zebrafisk embryon. Det protokoll som har utvecklats med hjälp av en Zeiss Axio Observer. Z1 med Zen Blue 2011 programvara, men den teknik som kan anpassas för användning av någon inverterat mikroskop med en motoriserad scen och programvara mikroskop kontroll som kan utföra plattsättning för att skapa sammansatta bilder. Att utrusta ett inverterat mikroskop med en motoriserad skede kan ge en praktisk, billigare altern…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35mm paltes	Fisher	08-757-100D
35 x 60mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricane methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    – 17.2 grams KCl                       – 0.76 grams CaCl2-2H2O     – 2.9 grams MgSO4-7H2O  – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150mls 2% methylene blue     100μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water