Summary
제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.
Abstract
제브라 피쉬 배아는 작은 분자의 대규모 스크리닝을위한 강력한 도구입니다. 형광 리포터 단백질을 표현 형질 전환 지브라 피쉬 자주 유전자 발현을 조절하는 물질을 식별하는 데 사용된다. 라이브 제브라 피쉬에서 형광을 분석 실험 화학의 화면은 종종 높은 콘텐츠 심사를 위해 고가의 전문 장비에 의존하고 있습니다. 우리는 모터 단계 자동으로 이미지 제브라 피쉬 배아에 함께 표준 표면 형광 현미경을 사용하여 프로 시저를 설명하고 조직 특이 형광을 감지합니다. GFP의 발현을 통해 에스트로겐 수용체의 활동을보고 형질 전환 제브라 피쉬를 사용하여, 우리는 조직 특정 방식으로 기자를 활성화 에스트로겐 수용체 리간드에 대한 화면으로 반 자동화 된 절차를 개발했다. 이 비디오에서 우리는 96 - 웰 플레이트에 24-48시간 포스트 수정 (HPF)에서 제브라 피쉬 배아으로 배열 및 에스트로겐 수용체를 바인딩 작은 분자를 추가하는 절차에 대해 설명합니다. 72-96 HPF에서, 각각의 이미지를 잘에서전체 판을 자동으로 수집 및 수동으로 조직 특이 형광을 위해 검열된다. 이 프로토콜은 아니지만 간에서의 심장 판막의 수용체를 활성화 에스트로겐을 감지하는 능력을 보여준다.
Introduction
형질 전환 제브라 피쉬는 섬유 아세포 성장 1, 레티노 산 2 인자 라이브 배아, 3 에스트로겐과 같은 경로를, 신호의 활동의 직접적인 시각화 수 있도록 개발되었다. 이러한 도구는 (형광 강도의 변화로 정량) 신호 전달 경로를 교란 화학 물질 또는 조직 특이하게 4 (형광 현지화의 변화)에 신호를 변조 화학 물질에 대한 검사를 가능하게합니다. 자동 이미지 캡처는 크게 5,6 화학 화면의 처리량을 증가시킨다. 라이브 제브라 피쉬의 자동 분석 형광 종종 고가의 전문 장비에 의존 화면. 소위 높은 콘텐츠 심사는 높은 해상도, 양적 이미징하지만, 공 초점 현미경 7,8에 장착 된 특수 플레이트 리더를 사용하는 비용의 혜택을 제공합니다. 이 방법의 목적은 제브라 피쉬 배아 자동 분석 조직 특이 형광하다표준 표면 형광 현미경을 사용하여 96 - 웰 플레이트에. 조직 특이 형광이 기술을 사용하여 구분할 수 있습니다 전문 플레이트 리더 또는 높은 콘텐츠 검사 장치에 대한 액세스를 부족 실험실을위한 합리적인 방법이 될 수 있습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 3 일 포스트 수정 (DPF)에서 조직 특정 에스트로겐 수용체 (ER) 라이브 제브라 피쉬의 효능을 감지하는 자동화 이미징을 사용합니다. 유전자 변형 라인의 Tg (5xERE : GFP) c262/c262 녹색 형광 단백질 (GFP)의 상류에 5 탠덤 에스트로겐 반응 요소의 DNA 시퀀스 (ERE)을 포함 3. 리간드의 부재에서, ER로는 일반적으로 비활성이다. 리간드 결합은 수용체가 ERE DNA를 결합하여 전사 9를 조절 할 수 있도록 구조적 변화를 트리거합니다. 5xERE : GFP 물고기 ER 변조기 화학 라이브러리를 화면으로 사용할 수 있으며, 에스트로겐 오염 물질에 대한 환경 물 샘플을 선별하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
참고 :이 프로토콜은 버밍엄 기관 동물 관리 및 사용위원회에 위치한 앨라배마 대학에 의해 승인되었습니다.
1. Zebrafish의 사육 및 계란 컬렉션
- 사흘 화학 물질 노출을 시작하기 전에, 별도의 남성과 여성에 대한 분할을 사육 탱크를 조립합니다. 양식 시스템 물을 각 탱크의 중간을 입력합니다. 칸막이로 구분하여 각각의 탱크에 2 명의 남성과 3 명의 여성을 배치, 사육 탱크에 c262/c262 물고기 : 그물을 사용하여,의 Tg (GFP 5xERE)을 전송합니다. 각각의 탱크에 뚜껑을 배치하고 날짜와 교차하는 긴장과 레이블.
- 다음날 아침, 모든 장벽을 제거하고 기울기는 사육 수조의 한쪽 끝에서 얕은 지역을 만들기 위해 배플. 제브라 피쉬의 정확한 발달 준비를하기 위해 10 분 간격으로 배아를 수집, 짝짓기를 할 수 있습니다. 배양 접시에 E3B 매체 부드럽게 세척 배아를 사용하여 차 여과기를 세척하여 청소 계란. 영구적으로 성인 물고기를 반환탱크.
- 해부 현미경을 사용하여, 정렬, 계산, 및, 미 수정의 이상 또는 손상 배아를 제거합니다. 어두운주기 : 14시 10분 빛으로 28.5 ° C에서 E3B 매체와 집에있는 페트리 접시에있는 장소의 배아. 배아 밀도 발달에 영향을 미칠 수있다. 60 X 15mm 접시에 100 × 35mm 접시에 더 이상 100 이상의 배아를 더 이상 50 이상의 배아를 놓습니다.
- 24 HPF으로, 200 μM 1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU)를 포함 E3B와 미디어를 교체합니다. PTU는 색소 형성을 방지하고, 제브라 피쉬 배아 및 향상된 이미지 선명도에 대한 투명한 애벌레를 유지합니다. 주의 : 집중 PTU 주식은 위험합니다; E3B + PTU 솔루션을 할 때 장갑을 착용하십시오.
- 일일 포스트 수정에 (DPF), 수동으로 미세 집게를 사용하여 각 배아에서 융모막을 제거합니다. 융모막은 에스트로겐의 침투에 영향을 나타나지 않습니다, 그러나 제거는 이미지 선명도를 향상시킵니다. 미디어 chorions를 제거 할 필요는 없다. 참고 : 수동 dechorionation에 대한 대안으로, 배아의 일괄 체 할 수 있습니다이전 11 설명한대로 mically, 1 ㎎ / ㎖ 프로 나제 치료를 사용하여 dechorionated.
태아의 2. 화학 처리
- 치료 전날, 1,000 배의 DMSO의 농도 (또는 적당한 용매)에 각 화학 물질의 재고 솔루션을 준비합니다. 예를 들면, 10 μM의 비스페놀 A (BPA)으로 배아를 노출 100 % DMSO에 10mM의 BPA의 스톡 용액을 제조 하였다. 이는 각 처리에 균일 DMSO 농도를 보장하고 DMSO의 무독성 1:1,000 희석 차량 제어의 역할을 할 수있다. -20 ° C에서 매장 재고 솔루션 이 프로토콜의 경우, 태아는 1 μM과 10 μM BPA, 18.5 ㎚, 1.85 μM의 genistein, 367 nm의 에스트라 디올 (양성 대조군)와 자동차 (0.1 % DMSO, 음성 대조군)에 노출 될 것입니다.
주의 : 같은 BPA 및 에스트라 디올과 같은 화학 약품이 위험하고 인간의 태아에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 주의 호르몬을 처리하고 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. - 치료의 날, 해동 재고 화학 솔루션을 준비했다. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 1 ㎖ E3B + PTU를 피펫 및 주식 화학 용액 1 μl를 추가하여 1:1,000 희석. 소용돌이 적극적으로. 차량 제어로 E3B + PTU에 DMSO 1:1,000 희석. 처리되지 않은 대조군으로 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 1 ㎖의 E3B + PTU를 사용합니다.
- 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 큰 구멍 플라스틱 전송 피펫, 페트리 접시에서 전송 배아를 사용하여 당 3 배아 아니라, 조건 당 3 우물. 장기간의 치료 기간 동안 증발을 방지하기 위해 판의 바깥 쪽 행과 열 (행 A와 E, 열 1, 12)에서 배아를 생략합니다. 외부 우물 E3B + PTU 300 μL로 채워질 수있다. 적절 플레이트 뚜껑을 레이블.
- 뾰족한 플라스틱 전송 피펫으로 각 우물에서 용지를 제거합니다. 배아를 건조 방지하기 위해 신속하게 작업 할 수 있습니다.
- 잘 대응에 처리 액 200 μl를 추가합니다. unde 뚜껑을 놓습니다적절한 우물에 치료의 추가를 확인하기 위해 가이드로 판을 rneath. 와동 각 튜브 용액에 화학 물질을 분배하기 위해 피펫 팅에 앞서. 시각 각 배아 처리 액에 확인. 배아 웰의 측면에있는 경우, 처리 용액에 잘들을 세척하는 클린 전송 피펫을 사용한다.
- 28.5 ℃에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다 태아는 72 HPF에서 형광 분석됩니다.
96 - 웰 플레이트에있는 태아의 3. 자동 영상
- 각 웰에 4 ㎎ / ㎖ tricaine의 10 μl를 추가하여 태아를 마취.
참고 : 이전 영상에 태아를 마취. 24-96 HPF에서 제브라 피쉬는 자발적 움직임과 이미지를 캡처하는 동안 변화하는 광원에 깜짝 놀라는 반응을 나타냅니다. 배아를 마취하는 것은 이미징 동안 운동을 감소시킨다. - 자동화 된 단계에서 96 - 웰 플레이트를 놓고 무대를 보정합니다. 혈구 선 블루 현미경 자동 2011 소프트웨어를 사용하여과 제어, 샘플 캐리어 옵션을 선택하고 멀티 웰 (96)을 선택합니다. 보정을 선택합니다. 무대를 보정하는 단계별 지시 사항을 따르십시오.
참고 :이 단계 이후에 타일 버튼의 선택을 취소하지 마십시오. 타일 버튼을 선택하지 않으면 보정 설정이 손실 될 수 있으며, 96 - 웰 플레이트는 재 교정해야합니다. - 설정 (BF) 및 10X 대물 시야를 사용하여, 양성 대조군 배아를 식별하고 형광 신호는 카메라가 포화되지 않는 것을 확인하고, BF와 GFP 채널 적절 노출 설정을 설정한다. 하나의 배아에 초점을 총 3 Z-섹션, 위의 하나의 이미지 50 μm의 현재 초점면 아래 한 50 ㎛를 취득하는 현미경을 프로그램.
참고 : 다른 조직이 서로 다른 초점면을 차지하기 때문에 각 제브라 피쉬의 이미지가 초점이 심장과 간으로 캡처를 위해,이 사항을 확인합니다. - GFP 및 BF의 channe를 사용하여 타일 이미지를 얻기 위해 소프트웨어 매개 변수를 설정LS. 인수 탭에서 고급 설정을 선택합니다. 선택 타일 영역은 다음 타일. 원도 옵션을 선택합니다.
참고 : 바둑판 식 배열이 아니라 각각의 합성 이미지를 만드는 데 사용됩니다. 단일 시야 각 웰의 작은 부분만을 캡처한다. 타일링 기능은 자동으로 전체도의 복합 이미지를 만드는 필드 -보기 각 우물에서 여러 인접를 캡처 할 수 있습니다. 각 합성 이미지가 하나의 잘에서 수십 개의 개별 이미지가 포함 된 위치를 자동으로 접시 당 96 합성 이미지를 캡처하는 것이 가능하다. - 캐리어를 선택하고 인자에게 90 %를 입력합니다. 90 %의 충진율을 선택하면 이러한 각 웰의 면적의 90 %가 합성 화상에 표시 될 것으로 선택된 웰의 여러 이미지를 캡처 할 것이다.
NOTE : 충진율을 선정 할 때, 다이어그램이 묘화되는 영역을 나타내는 표시 될 것이다. 우물의 영역을 포함하는 비율을 선택이 실험에 적합합니다. - 옵션에서 원하는 중첩의 양을 선택합니다.
참고 : 하나의 대표 이미지를 함께 타일을 바느질 할 때, 10 %의 중첩 이미지 사이에 부드러운 솔기 수 있습니다. 스티치 화상이 불필요한 경우에는, 0 % 오버랩을 사용하여 촬상 시간을 줄이는 것이다. 90 % 곡선 인자 및 5 % 오버랩을 사용하여, 단일 웰의 합성 화상 (59)에 개별 이미지로 구성된다. - 영상을 시작합니다. 현미경은 자동으로 이미지를 수집합니다.
- 수동으로 조직 특이 형광 잘 각각의 합성 이미지 (그림 1)을 검사합니다.
- 참고 : 화학 물질의 노출은 이전 실험적인 치료 우물을 관찰에 근무 함을 확인하는 긍정적 인 제어로 시작하는 것이 가장 좋습니다.
96 - 웰 플레이트에있는 태아의 4. 수동 이미지 캡처
참고 : 결과를 확인 AC에 20 배 긴 작동 거리 목표를 사용하려면첩 더 자세한 이미지를 수동으로 (그림 2).
- 설정 (BF) 20 배 목표와 시야를 사용하여, 긍정적 인 제어 배아를 파악하고 형광 신호가 카메라를 포화되지 않은 것을 확인하고, 적절하게 BF 및 GFP 채널에 대한 노출 설정을 설정합니다.
- 수동으로 개별 배아 및 캡처 이미지를 확인합니다.
참고 : 노출 설정이 양성 대조군 배아 선택하고 나면 설정을 변경하지 마십시오. 각 이미지는 균일 한 조건 하에서 촬영 된대로 이것은 형광 강도의 비교를 허용한다.
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Representative Results
그림 1은 96 - 웰 플레이트의 각각의 우물에서 합성 이미지를 보여줍니다. 각 합성 이미지는 5 % 이미지 중첩 59 개별 이미지로 구성되어 있습니다. 라이브 제브라 피쉬가 아니라 각 내에서 무작위로 지향, 아직 우리가 간에서 중심에 형광을 구별 할 수있게되어 있습니다. 시야 이미지는 제브라 피쉬의 방향을 평가하고, 형태 학적 이상 (그림 1A와 1C)를 시각화에 대한 참조로서 유용하다. 10 배 목표를 사용하여 자동화 된 영상이 화학 물질을 화면과 높은 배율에서 수동 평가 보증을 결정하는 데 사용된다. 2도 더 자세한 분석을 위해 20 배 긴 작동 거리 목표로 촬영 한 이미지를 보여줍니다. 이러한 이미지는 현미경 스테이지에서 플레이트를 제거하지 않고도 1에 도시 된 자동화 된 주사 직후 촬영했다. 20 배 목표를 사용하여 마음에 형광 정확하게 심장 발을 지역화 할 수 있습니다VES (그림 2C-2 층). 때때로, 배아의 방향은 이미지를 캡처를위한 차선 일 수 있고, 모호한 결과를 가져올 수 있습니다. 물론 당 3 제브라 피쉬를 배치하고 세중의 각 처리 (프로토콜 단계 2.3)을 수행하는 것은 정확하게 형광을 시각화하기 위해 여러 기회를 제공합니다.
.. 그림 1 자동화 된 복합 영상은 심장 판막과 간 명 시야 (A, C) 및 형광의 조직 특이 형광을 보여준다 (B, DH)의 Tg의 이미지 (5xERE : GFP) 이일에 지정된 화학 물질로 처리 c262/c262 배아 포스트 수정 (DPF) 및 3 DPF에 몇 군데. 각 패널은 5 %와 59 개별 이미지로 구성된 하나의 잘 (의 합성 이미지를 보여줍니다96 - 웰 플레이트에서 중복). A와 B, 0.1 % DMSO (차량 제어)에서 배양 한 배아는 GFP 음수입니다. CH는, 태아는 100 NG / ML 17β-에스트라 디올 (E2), 1.85 μM 제니스 타인 (창)와 함께 배양 또는 심장 판막 (화살표)과 간 (화살촉)에서 10 μM BPA 전시 형광, 18.5 nm의 세대 또는 1 μM BPA 전시 심장 판막에 형광하지만 간으로 처리 배아. B ', 패널 B에 D의 박스 지역에서 단일 유충의 디지털 확대 이미지'등, 패널 D의 박스 지역에서 디지털 확대 이미지 및. = 500 μm의 스케일 바는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 제브라 피쉬 배아에 자동으로 이미지 조직 특이 형광을 간단한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 자이스의 Axio 옵저버를 사용하여 개발되었습니다. Z1은 선 블루 2011 소프트웨어와 함께, 그러나이 기술은 합성 이미지를 만들 수 타일링을 수행 할 수있는 자동화 된 무대와 현미경 제어 소프트웨어와 함께 모든 거꾸로 현미경을 사용하여 적용 할 수 있습니다. 전동 무대 거꾸로 현미경을 갖추는 것은 높은 콘텐츠 심사를위한 전문 장비를 구입에 실제보다 저렴한 대안을 제공 할 수 있습니다. 전동 스테이지는 스테이지의 현미경과 품질의 제조업체와 모델에 따라 수천에서 미국 달러의 수만에 이르기까지 다양합니다.
프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 일부 화학 물질에 따라서는 치료 기간 동안 어둠 속에서 배아를 배양하는 것이 도움이 될 수 있습니다, 광 감응성. 제브라 피쉬 배아는 탈수에 민감합니다. 따라서, CHEMI에 대한칼 노출 하루 이상 지속은 증발 (프로토콜 단계 2.3)을 제한하는 미디어 96 - 웰 플레이트의 가장자리를 따라 우물을 채우기 위해 중요합니다.
이 단계를주의 깊게 (프로토콜 단계 3.2) 보정되어 있는지 확인하는 것도 중요합니다. 한 일반적인 실수는 완전히 판을 고정하지 않고 무대에 접시를 배치하는 것입니다. 무대가 이동하면이 경우에, 무대에 접시의 위치는 약간의 우물 전혀 부분적으로 또는하지 군데가 발생할 수도있는, 변경할 수 있습니다. 연속으로 몇 접시를 이미징 할 때, 한 접시가 같은 제조업체가 모두 동일한 방향에서 무대에 배치 될 때, 각 판의 단계를 재조정 절대적으로 필요가 없습니다.
자동 이미지 타일 매개 변수 (프로토콜 단계 3.5)를 설정하면, 각의 대부분이 잘 이미지화 될 수 있도록. 3 DPF 세 이상에서, 제브라 피쉬의 유충은 아의 가장자리 근처에 자신을 위치하는 경향이L은, 따라서 90 % 채우기 비율은 각 웰의 가장자리가 가시화 될 수 있도록하는 것이 좋습니다. 그러나, 충진율 이상 화상 취득의 시간 이상이다.
이 해상도를 개선하는 합성 이미지에 접 알고리즘을 수행 할 수있다. 스티칭 알고리즘이 수행 될 경우, 5 ~ 10 %의 화상 오버랩 (프로토콜 단계 3.6)를 포함하는 타일링 파라미터를 설정한다. 오버랩 높을 스티칭 알고리즘의 성능이 더. 일부의 경우, 10 % 오버랩 스티치 고배율 대물를 사용 더욱 가시화를 필요로하지 않는 분석에 유용한 이미지를 생성 할 수있다. 그러나, 더 이상 이미지 수집이 더 많은 이미지로 소요됩니다 중첩 잘 당 캡처됩니다. 0 %의 오버랩은 영상 획득 시간을 감소시키고 형광 노광 및 광표백을 최소화하기 위해 사용될 수있다. 이 경우에, 20X objecti를 사용 셀렉트 웰 상세한 이미지를 캡처했습니다 (그림 2).
이 프로토콜에 대한 이미지 캡처 시간은 실험 매개 변수에 따라 달라집니다. 이 프로토콜의 매개 변수를 사용하여 이미지 수집 (90 % 채우기 비율 5 % 중복, 세 캡처 한 이미지 당 Z-섹션과 GFP 채널에 대한 50 밀리 및 시야 채널에 대한 1 밀리의 노출 시간) 삼분 오십 초 소요 물론 당. 따라서, 세시간 오십 분 60 우물을 스크린 할 수있다. 그것은 하루에 180 우물, 또는 세중 (60)의 독특한 화합물을 화면에 가능하다.
이 프로토콜은 조직 특이 형광을위한 자동화 이미징을 수 있지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 위드 형광 이미징 많은 하이 콘텐츠 스크리닝 기법에 사용 된 공 초점 화상의 해상도가 부족하다. 또한, 형광 정량 인해 잘 내의 각 제브라 피쉬의 방향의 높은 변동성에 어렵다. 이 유니폼에서 제브라 피쉬의 이미징에 의해 피할 수방향 조건, 금형을 사용하거나 마이크로 플레이트 균일 한 방향 5,10에 제브라 피쉬 배아를 강제로 우물로하여, 예를 들어. 영상 획득 시간은 180에 하루에 검사 할 수있는 우물의 수. 하루에 180 우물을 상영 수동 이미징 비해 상당한 개선이 제한됩니다. 그러나, 일반적으로 높은 처리량 방법은 하루에 10,000 우물의 평균 화면하지만 복잡하고 고가의 워크 스테이션을 필요로 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 쉽게 반전 위드 형광 현미경으로 실험실에서 적용 할 수 있습니다 높은 콘텐츠 심사에 실제적이고, 덜 비싼 대안을 나타냅니다. 여기에서 설명한 촬상 방법은 비약적 샘플 준비의 속도와 편의성이 향상 정중 장착되거나 지향되지 않은 배아 조직 특정 형광의 분석을 허용한다. 합성 이미지는 참조 용으로 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 높은 처리량 검사 O를 허용하도록 개발되었다화학 물질 라이브러리와 환경 물 샘플에서 F 조직 특정 에스트로겐 수용체 리간드. 대안 적으로,이 촬상 프로토콜은 조직 특이 적 활성에 대한 형광 리포터를 선별하는데 사용될 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
우리는 수잔 농부와 제브라 피쉬의 치료에 대한 UAB의 제브라 피쉬 연구 시설의 직원을 감사드립니다. 약리학 및 독물학의 부에서 창업 자금에 의해 제공되는 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 mm plates | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl - 17.2 grams KCl - 0.76 grams CaCl2-2H2O - 2.9 grams MgSO4-7H2O - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150 ml 2% methylene blue 100 μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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