Introduction
Трансплантация твердых органов, таких как кожа, сердце и почки в настоящее время является стандартной процедурой в медицинской практике во всем мире 1. Успешно пересаженные органы могут быть отвергнуты активации получателя иммунной системы, в которой признается основные антигены гистосовместимости донора. Поэтому пересаженные пациентам необходимо лечение с иммуносупрессивных препаратов 2. Аллогенная трансплантация кожи у мышей было установлено Medawar и коллегами в 1955 году и был полезен для выявления целевых молекул позже описаны как главный комплекс гистосовместимости (МНС) класса I и II. С тех пор модель пересадка кожи была постоянно модифицировать и адаптировать для изучения роли Т-клеток подмножеств и актуальность химической и биологической вмешательства в подавлении отторжение трансплантата 2-4. Кожа из уха и туловища труднее подготовить и более восприимчивы к гипоксии и некроза, чем хвостовой кожи 5; ОднакоПроцедура трансплантации аналогично. Кроме того, мониторинг трансплантации кожи хвоста легко из-за характерной текстурой волос кожи.
Эта статья предусматривает подробную процедуру для МНС класса II несоответствия трансплантации хвост кожи, что позволяет для изучения различных аспектов CD4 + Т-клеточного отторжения трансплантата и толерантности у мышей. Естественный трехточечный мутации в МНС класса II молекул IA B (называемая IA BM12) 6-9 достаточно, чтобы вызвать отказ от аллотрансплантатов кожи в C57BL / 6 мышей 8. BM12 молекула IA активирует CD4 + Т-клеток с различными αβ-Т-клеточного рецептора (TCR) цепи от мышей C57BL / 6, среди которых Vα2Vβ8-TCR-специфические Т-клетки, выявленные в того, чтобы генерировать TCR-трансгенной мыши 10. Адоптивный перенос Vα2Vβ8-TCR-специфических Т-клеток был использован для создания модели отказ в иммунодефицитных C57BL / 6 RAG2 - / - мыши пересаженные с И.А. BM12 кожи.
Генетические различия между донором и реципиентом повлиять на исход принятия трансплантации и отвержения. Существуют различные типы трансплантатов: аутотрансплантаты являются трансплантации, изъятых у самого человека-реципиента; syngrafts и аллотрансплантаты являются трансплантации от генетически идентичных и генетически неродственных индивидуумов соответственно. Принятие различных аллогенных трансплантаций органов было продемонстрировано химической и биологической вмешательства у пациентов и мышиных моделях 11,3,4. В основной подход, анти-CD3 антитела обработанных мышей C57BL / 6 показали длительное выживание И.А. BM12 хвостовой кожи (неопубликованные данные). Истощение CD4 + и CD8 + Т-клеток перед трансплантацией у мышей-реципиентов в результате принятия МНС класса I и II несогласованных трансплантатов (Откр. в 12). Интересно, отторжение трансплантатов кожи зависит от присутствия CD4 + 12). В этой модели, ориентированные на конкретные взаимодействие между различными иммунных клеток, блокируя костимулирующие молекулы с антителами или подавления с регуляторных Т-клеток может индуцировать толерантность (неопубликованные данные). В самом деле, блокируя как CD40 и CD28 привело к долгосрочной толерантности аллотрансплантата кожи 13,14.
Трансплантация Хвост-кожа легко выполнить и легко контролировать по сравнению с трансплантацией других органов. Кроме того, пересадка хвост кожи легко приготовить и менее восприимчивы к ишемии, чем другие ткани кожи. В отличие от вводимых анестетиков, использование анестезирующего газа (изофлуораном) во время трансплантации сокращает как порядок и время восстановления получатель. Curling трансплантата хвост кожи, что может привести к неполному заживления ран и отторжения трансплантата, предотвращается путем нанесения клея ткани. Кроме того, хвост-кожа трансплантации модель И.А. BM12 исключительно активизирует CD4 Этот протокол описывает надежный, воспроизводимый и легко контролируется модель мыши, которая позволяет химической и биологической вмешательства. Модель предназначена для исследования отказ и терпимости индукцию трансплантации хвост кожи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В этом видео-публикации и протокола, все процедуры животных были проведены в соответствии с протоколом животных, утвержденной Кантональная администрации Базель-Штадт, Швейцария. Выполните все процедуры в стерильных условиях, где возможно.
1. Подготовка хирургии
- Автоклав все хирургические инструменты и марлевые перед использованием.
- Нагрейте теплый коврик и организовать хирургические инструменты на столе (табл. материалов / Методы).
- Откройте палец полосы повязки. Применить вазелин на рану площадку с помощью ватного тампона (убедитесь, что марля полностью покрыта).
- Взвесьте мышей и управлять обезболивания бупренорфин 0,05 мг / кг массы тела. Примечание: это обеспечит обезболивание сразу же после трансплантации.
2. Подготовка Tail-кожи для трансплантации
- Усыпить мышей-доноров (например, И. А. BM12) за CO 2 удушья и гisinfect хвосты с дезинфицирующим раствором до удаления.
- Расположите хвост с черной полосой вниз на чистую пластиковую доску и разрезать его продольно по всей средней линии, что делает поверхностный разрез с участием только слой кожи.
- Снимите кожу с хвоста, используя захватывающие щипцы.
- Положите хвост шкуру в блюдо культуры 10 см клеток, наполненный 10 мл HBSS.
3. Хирургическая процедура
- Обезболить мышей-реципиентов (например, C57BL / 6) при вдыхании 3% раствором изофлуораном в прозрачной индукционного поля. Примечание: Время 3-5 мин для мыши для достижения хирургического самолет анестезии. Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
- Наведите курсор на теплой подушки и применять 1,5% изофлуораном через маску рта и ослов каждое животное рефлекс на носок щипать.
- Бритье спинной сайт мышей-реципиентов (например, C57BL / 6) и удаления загрязняющих волоски с помощью сухой марлевой SWAB.
- Лечить бритая трансплантации сайт с асептической решения.
- Зажмите кожу щипцами в средней / вправо сайте тыльной и использовать изогнутые ножницы, чтобы сделать круглое разрез около 1 х 0,6 см.
- Если кровотечение происходит, то очистить рану стерильным ватным тампоном.
- Оцените размер разрез и вырезать трансплантат предполагаемого размера от хвостовой кожи с помощью скальпеля.
- Обрезать углы закруглить пересадку.
- Загрузите пересадку на скальпель, сухой свыше ССРХ на стерильной ватной палочкой и поместить его в привитой кровати мыши-реципиента.
- Избегайте дублирования донора и принимающей кожи и нанести клей ткани на зоне контакта исключительно.
- Нанесите штукатурку без складки вокруг талии мыши.
- Применить клей не-эластичный бинт для фиксации пластыря к мыши (3 мм смещается).
- Надрезать с ножницами около 3 мм в верхней брюшной сайте повязку. Примечание: Это позволит избежать трapping зубов мыши на этапе восстановления.
- Снимите наркозно-рот-маска и держать пересаженных мышей на грелку, пока бодрствует.
- Вернуться пересаженные мышам в их клетки только тогда, когда полностью восстановился и оценить их подвижность для того, чтобы повязка не слишком туго.
- Прежде чем приступить к следующему хирургии Стерилизовать все хирургические инструменты с 70% этанола.
4. Послеоперационный уход
- Добавить парацетамол, содержащего сироп в питьевую воду (4 мг / мл) и вводить его в течение 7 дней.
- Вернуться мышь в комнату животных, как только он выздоровел.
- Внимательно следить мышей для клинических признаков, включая депрессию или других поведенческих изменений (в еде или неподвижности), нарушение внешнего вида (отсутствие ухода) или позы (Pilo-монтажных или сгорбившись осанки) в течение времени, повязка на месте (1 неделя).
5. Бинты Удаление (6-7 дней после трансплантации)
- Anesthetize мышей при вдыхании 3% изофлураном раствора в прозрачном окне индукции (см. выше).
- Вырезать повязку и штукатурки с ножницами артерии и осторожно удалите их. Примечание: во избежание растяжения сайта трансплантации.
- Монитор пересаженных мышам наличие клинических признаков (см. 4.3) и забил отторжение трансплантатов кожи (табл. 1). Примечание: Система оценка трансплантат пользуется различными волос текстур на хвостовой кожи по сравнению с спинной-кожи. Появление трансплантата и его отклонения относится к категории в 3 классах. Аллогенная кожи (МНС II несоответствие, например, И. А. BM12) трансплантаты C57BL / 6 иммунокомпетентных мышей, как правило, отклоняются в течение 12-15 дней после трансплантации (собственные данные и 15-20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В первом подходе C57BL / 6, были пересажены с IA BM12 аллотрансплантатами и IA б syngrafts. После удаления повязки, трансплантатов заметных признаков заживления ран без закрытия зоны контакта в мышей C57BL / 6 (фиг. 1а). После удаления повязки, клеточный воспаление CD4 + Т привело к появлению некротических участков (красные точки) и отказ от IA BM12 аллотрансплантатами в C57BL / 6 мышей в течение 13 дней после трансплантации (рис. 1В-C, заполненные символы), в то время как syngrafts терпели до 100 дней (рис. 1В-C, открытые символы). Эти данные показывают, прогрессирование острого отторжения ИА BM12 трансплантатов у иммунокомпетентных мышей C57BL / 6.
Различные исследования показывают, что отказ от МНС класса II несогласованной хвостовой кожи зависит от наличия аллогенных CD4 + Т-клеток (Откр. в 12). Действительно, Т-клеточный дефицит CD3ε - / - </ SUP> мыши и Т-и В-клеток с дефицитом RAG2 - / - мышей показали полное заживление раны и переносится И.А. BM12 прививает до 100 дней (рис. 2), в то время как мышей C57BL / 6 отклонил трансплантатов в течение 13 дней (рис. 2) . Принятие И.А. BM12 несогласованной хвостовой кожи позволяет для изучения аллогенных CD4 + Т-клеток и их функций эффекторных в мышиной модели без серьезных патологий заболеваний.
Чтобы разорвать сложившийся толерантности в CD3ε - / - и RAG2 - / - мыши, CD4 + Т-клетки восприимчиво переданы: 2 х 10 4 поликлональные C57BL / 6 CD4 + Т-клетки были достаточны, чтобы вызвать отказ от IA BM12 трансплантатов в течение 14 дней ( данные не представлены). Передача 50000 до 100000 C57BL / 6 CD4 + Т-клеток не ускорить процесс отторжения трансплантата в CD3ε - / - и RAG2 - / - мышей. Эти данные подчеркивают роль allogenЭПК CD4 + Т-клеток в острого отторжения трансплантата кожи модели.
Преимущество этого фрагмента кожи трансплантации модели является то, что функциональный анализ CD4 + Т-клеток можно легко сделать с помощью приемных передачи антиген-специфических CD4 + Т-клеток. Трансгенной мыши ПРО 9 считается идеальным инструментом для очерчивания активацию и фенотипическую поведение населения без влияния неспецифических CD4 + Т-клеток. Передача 2 х 10 4 антиген-специфичных клеток ПРО было достаточно, чтобы вызвать отказ от IA BM12 трансплантатов в RAG2 - / - мыши в течение 13 дней (рис. 3А-B). Кроме того, клетки ПРО легко выделить и можно отслеживать с помощью экспрессии цепей TCR-Vα2Vβ8 (фиг. 3C). Распространение ПРО клеток и производство цитокинов в IA BM12 пересадить RAG2 - / - были исследованы мышей. Клетки ПРО распространение extensiVely как определено eFluor670 разбавления анализа (рис. 3D) и до 30% клеток ПРО производства IFN-γ после PMA-стимуляции (рис. 3Е).
Взятые вместе, эти данные показывают, что относительно небольшое число аллогенных CD4 + Т-клетки необходимы, чтобы вызвать неприятие И.А. BM12 пересадке кожи, что делает эту модель идеальной для анализа аллогенных Т-клеток с минимальным тяжелой патологии.
Рисунок 1. Трансплантация мышей с аллогенной и сингенной хвостовой кожи. (A) C57BL / 6 мышей были пересажены с аллогенной (IA BM12) и сингенных (IA б) фрагмента кожи (N = 5 на группу). Фотографии иллюстрируют аллотрансплантаты (слева) и syngrafts (справа) после удаления повязки на 7-й день. (В) Заброшенные и (С)выживание кожи не прививает с 7 дня до дня отклонения или окончательного контроля (день 100). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 2 Аллотрансплантаты допускаются при отсутствии Т-клеток у мышей Выживание RAG2 -. / - И.А. BM12 - мыши пересадка кожи пересаженные в C57BL / 6, CD3ε - / - и RAG2 - / - мышей (N = 4-6 на группу) и иллюстрация отклоненных и принятых трансплантатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Конкретные CD4 + Т-клетки против И.А. BM12 размножаются и производят IFN-γ в ходе отторжения трансплантата (А) Заброшенные и (Б) выживание И.А. BM12 трансплантатов хвост кожи в RAG2 -. / - Мыши (N = 5) адаптивно переданы с 2 х 10 4 антиген-специфических клеток ПРО. (C) Vα2Vβ8-окрашивание клеток, выделенных из ПРО лимфатических узлов мышей трансгенных ПРО. (D) eFluor670 разбавление пролиферирующих клеток ПРО и (E) IFN-γ производство PMA- стимулировали клетки ПРО, выделенные из лимфатических узлов И.А. BM12 кожи привиты RAG2 - / -. мышей на 9-й день после приемный ПРО клеточный перенос (п = 5 мышей) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобыпосмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Прививка счет | Описание |
| 3 + | Нет красные области и наличие блестящей черной полосой |
| 2 + | Появление небольшого красные области, потеря блестящей черной полосой и сухости |
| 1 + | не Появление больших красных областях, не черная полоса и усадки |
| 0 | Отторжения трансплантата определяется как некроз 80% |
Таблица 1. Прививка система оценка. Появление трансплантата и его отказа является катеgorized в 3 классах, пользуясь различными текстурами волос на хвост-и спинной-кожи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Трансплантация кожи является широко используемым методом изучения неприятие и зависимость от Т-клеток терпимости. Так была создана модель пересадка кожи, несколько адаптации и изменения были применены. В описанной выше процедуре, IA BM12 трансплантации кожи хвоста осуществляется с помощью анестезирующего газа (изофлураном). Использование газа анестезии уменьшает время исполнения и мышей восстановления, что снижает нагрузку на трансплантированных мышей. Процедура использует клей ткани, чтобы зафиксировать хвост шкуру, которая имеет тенденцию к скручиванию более уха или ткани спинной-кожи. Кроме того, важно, чтобы сгладить хвостовой кожу перед резки и обрезки края, так как это снижает скручивание и улучшает позиционирование хвостовой кожи на месте вырезания спинного.
Для оценки отторжения трансплантата или признания требуется подготовить хвост шкуру с черной полосой (например, в C57BL / 6 мышей) в середине трансплантата для облегчения озвучивание траnsplants на основе текстурных различий волос.
Мутация BM12 молекулы МНС класса II И.А. исключительно активизирует CD4 + Т-клеток в иммунокомпетентных и иммунодефицитных мышей (того же генетического фона). С одной стороны это облегчает интерпретацию результатов, но с другой стороны это ограничивает способ CD4 + Т-клеток исследований. Чтобы продлить активацию Т-клеток в другие клетки подмножеств Т, хвостовой кожи от других доноров, например, тот же генетический фон, включая мышей И.А. bm1 и разного генетического фона, включая линии BALB / C или DBA мыши могут быть пересажены.
В исследованиях острой отторжения, мы выигрываем от природной мутации в МНС класса II канавкой и активации аллогенных CD4 + Т-клеток для изучения отторжения органов у мышей. Мышей C57BL / 6 отклонил И.А. BM12 пересадки кожи в течение 14 дней после трансплантации, что согласуется с большинством исследований УЗИнг И.А. BM12 кожи пересаживает 15-20. Кроме того, острое отторжение модель широко используется для проверки аллогенной потенциал CD4 + Т-клеток из генов-дефицитных мышей. Действительно, ИФН-γ - / - мышей показали задержкой И.А. BM12 отторжения трансплантата кожи (неопубликованные данные и 16). Блокировка IFN-γ введением блокирования антител же задерживается отказ 15,17,18. Это указывает на ключевую роль IFN-γ в инициировании выражение МНС класса II на Ag-представления и эндотелиальных клеток (Откр. в 12). С перфорин-дефицитных мышей не замедлил И.А. BM12 трансплантата кожи отказ 21, роль цитокинов, кажется, более важно для отказа. Действительно, IL-6 введение приводило к длительной жизнеспособности трансплантата, возможно, путем понижающей регуляции IFN-γ-продукцию 15. Кроме того, нейтрофилы, кажется, играют важную роль в отказе от И.А. BM12 пересадке кожи в ИЛ-4-дефицитных мышей 19 BM12 отторжения трансплантата у мышей 20. Администрация анти-CD3 антитела задержки И.А. BM12 отторжения трансплантата кожи у иммунокомпетентных мышей (неопубликованные данные). Более того, мы показали, что Т-клеток с дефицитом CD3ε - / - и RAG2 - / - мыши принять аллогенных трансплантатов кожи на срок до 100 дней. Толерантность в этих мышей может быть легко возвращен / нарушена приемных передачи CD4 + Т-клеток от иммунокомпетентных мышей C57BL / 6. Передача 2 х 10 4 CD4 + Т-клетки или клетки ПРО антиген-специфические достаточно, чтобы вызвать IA BM12 отторжение трансплантата около 14 суток. Изолированные Vα2Vβ8-позитивные клетки ПРО показали обширную пролиферацию и IFN-γ производства в лимфатических узлах до отказа, однако отказ зависит от I-Abm12 экспрессион в трансплантате кожи.
Таким образом, эта модель мыши является отличным способом для изучения активацию номера низкой Т-клеток во время отказа или толерантности. Трансплантация хвост-кожа легко выполнить и может быть применен к мышей с различными генетическим фоном для изучения аллогенных ответов Т-клеток, не неся тяжелую физиологический эффект. Кроме того, эта модель идеально подходит для мероприятий с химических и биологических веществ, которые вызывают перерыв или кожи толерантности трансплантата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
- Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
- Halleck, F., et al.
- Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
- Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
- McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
- Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non--bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
- Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
- Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
- Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
- Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
- Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
- Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
- Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
- Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
- Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
- Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
- Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
- Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
- Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).
