Introduction
El trasplante de órganos sólidos, como la piel, el corazón y los riñones es ahora un procedimiento estándar en la práctica médica en todo el mundo 1. Órganos trasplantados con éxito pueden ser rechazadas por la activación del sistema inmune receptor, que reconoce los antígenos principales de histocompatibilidad del donante. Por lo tanto los pacientes transplantados necesitan tratamiento con medicamentos inmunosupresores 2. El trasplante alogénico de piel en ratones fue establecido por Medawar y sus colegas en 1955 y ha sido útil para la identificación de las moléculas específicas que se describen más adelante como complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II. Desde entonces, el modelo de trasplante de piel ha sido modificado y adaptado para estudiar el papel de los subconjuntos de células T y la relevancia de la química y la intervención biológica en la supresión de rechazo de injertos 2-4 continuamente. La piel de la oreja y el tronco son más difíciles de preparar y son más susceptibles a la hipoxia y la necrosis de la piel de la cola-5; Sin embargo,el procedimiento de trasplante es similar. Además, el seguimiento de trasplantes de cola de la piel es fácil debido a la textura del cabello característico de la piel.
Este artículo proporciona un procedimiento detallado de MHC de clase II desajuste trasplante de cola de la piel que permite el estudio de los diferentes aspectos de la T CD4 + rechazo de aloinjertos mediada por células y la tolerancia en ratones. La mutación natural de tres puntos en la molécula de MHC clase II IA B (llamado IA BM12) 6-9 es suficiente para inducir el rechazo de aloinjertos de piel en ratones C57BL / 6 8. La molécula de BM12 IA activa las células T CD4 + con diferentes receptor de células αβ-T (TCR) cadenas de ratones C57BL / 6, entre las que se identificaron las células T Vα2Vβ8-TCR-específicas con el fin de generar un ratón transgénico TCR-10. La transferencia adoptiva de células-TCR-específicos Vα2Vβ8 T se ha usado para establecer un modelo de rechazo en C57B inmunodeficienteL / 6 Rag2 - / - ratones transplantados con la piel IA BM12.
Las diferencias genéticas entre el donante y el receptor afectan el resultado de la aceptación y el rechazo de trasplante. Hay diferentes tipos de trasplantes: autoinjertos son los trasplantes de la persona beneficiaria misma; syngrafts y aloinjertos son los trasplantes de individuos genéticamente idénticos y no relacionados genéticamente, respectivamente. Aceptación de diferentes trasplantes de órganos alogénicos se ha demostrado por la intervención química y biológica en pacientes y modelos de ratón 11,3,4. En un enfoque básico, anti-CD3 tratados C57BL / 6 ratones mostraron una supervivencia prolongada de IA BM12 cola-piel (datos no publicados). El agotamiento de los CD4 + y CD8 + T las células antes del trasplante en ratones receptores resultó en la aceptación de MHC de clase I y II injertos no coincidentes (Apocalipsis en el 12). Curiosamente, el rechazo de injertos de piel depende de la presencia de células CD4 + 12). En este modelo, la orientación interacciones específicas entre diferentes células inmunes mediante el bloqueo de las moléculas coestimuladoras con anticuerpos o supresión con células T reguladoras podría inducir tolerancia (datos no publicados). De hecho, el bloqueo de ambos CD40 y CD28 dio lugar a la tolerancia 13,14 aloinjerto de piel a largo plazo.
Trasplante de Cola-piel es fácil de realizar y fácil de controlar en comparación con el trasplante de otros órganos. Además, los trasplantes de cola de la piel son fáciles de preparar y son menos susceptibles a la isquemia de otros tejidos de la piel. En contraste a los anestésicos inyectados, el uso de gas anestésico (isofluorano) durante el trasplante acorta tanto el procedimiento y el tiempo de recuperación destinatario. Curling del trasplante de cola de la piel, que puede conducir a la cicatrización de heridas incompleta y el rechazo del injerto, se evita mediante la aplicación de adhesivo de tejido. Además, el modelo de trasplante de piel de la cola-IA BM12 activa exclusivamente CD4 Este protocolo describe un modelo de ratón fiable, reproducible y fácilmente controlables que permite la intervención química y biológica. El modelo está diseñado para investigar el rechazo y la tolerancia a la inducción de los trasplantes de cola de la piel.
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Protocol
En esta publicación, el vídeo y el protocolo, se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con el protocolo de los animales aprobado por la autoridad cantonal de Basilea-Ciudad, Suiza. Realice todos los procedimientos en condiciones de esterilidad, cuando sea posible.
1. Preparación de Cirugía
- Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y gasas antes de su uso.
- Calentar la almohadilla caliente y organizar los instrumentos quirúrgicos en la tabla (Tabla de Materiales / Métodos).
- Abra las vendas de la tira dedo. Aplique vaselina en la plataforma de la herida con un algodón (asegúrese de que la gasa se cubre totalmente).
- Pesar los ratones y administrar analgesia buprenorfina 0,05 mg / kg de peso corporal. Nota: esto proporcionará analgesia inmediatamente después del trasplante.
2. Preparación de la cola de la piel para el Trasplante
- La eutanasia a los ratones donantes (por ejemplo, IA) BM12, los cuales por asfixia de CO 2 y disinfect las colas con solución de desinfección antes de la escisión.
- Coloque la cola con la franja negro sobre una placa de plástico limpio y cortado longitudinalmente a lo largo de la línea media, haciendo una incisión superficial que afecta sólo la capa de piel.
- Retirar la piel de la cola utilizando pinzas de agarre.
- Ponga la cola de la piel en una placa de cultivo de 10 cm celda llena con 10 ml de HBSS.
3. Procedimiento Quirúrgico
- Anestesie ratones receptores (por ejemplo, ratones C57BL / 6) por inhalación de una solución de isofluorano 3% en una caja de inducción transparente. Nota: Se necesita 3-5 minutos para el ratón para llegar a la anestesia plano quirúrgico. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
- Coloca el ratón sobre la almohadilla tibia y aplicar el 1,5% isofluorane través de una mascarilla boca y el culo cada reflejo animal toe pellizcos.
- Afeitar el sitio dorsal de los ratones receptores (por ejemplo, C57BL / 6) y quitar los pelos contaminantes utilizando un sw gasa secaab.
- Desinfectar sitio trasplante afeitado con solución aséptica.
- Apriete la piel con unas pinzas en el sitio central / derecha del dorso y el uso de tijeras curvas para hacer una incisión alrededor de alrededor de 1 x 0,6 cm.
- Si se produce una hemorragia, luego limpiar la herida con un hisopo de algodón estéril.
- Evaluar el tamaño de la incisión y cortar un trasplante de el tamaño estimado de la cola-piel utilizando el bisturí.
- Recorte esquinas para redondear el trasplante.
- Cargue el trasplante en el bisturí, el exceso seca de HBSS en un hisopo de algodón estéril y lo coloca en el lecho del injerto del ratón receptor.
- Evitar la superposición de los donantes y de la piel de acogida y aplicar adhesivo tisular en la zona de contacto de forma exclusiva.
- Aplicar un yeso sin arrugas alrededor de la cintura del ratón.
- Aplicar el adhesivo vendaje no elástico para fijar el yeso para el ratón (3 mm desplazado).
- Una incisión con las tijeras alrededor de 3 mm en el sitio ventral superior del vendaje. Nota: Esto es para evitar trapping de los dientes del ratón durante la fase de recuperación.
- Retire la anestesia boca máscara y mantener a los ratones trasplantados en la almohadilla caliente hasta que despierto.
- Volver ratones trasplantados a sus jaulas sólo cuando esté completamente recuperado y evaluar su movilidad para asegurarse de que el vendaje no está demasiado ajustado.
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% antes de proceder con la cirugía siguiente.
4. Cuidado post-operatorio
- Añadir jarabe que contiene paracetamol al agua de bebida (4 mg / ml) y administrarlo durante 7 días.
- Ratón Regresar a la sala de los animales una vez que se haya recuperado.
- Seguir de cerca los ratones en busca de signos clínicos como la depresión u otros cambios de comportamiento (comer o inmovilidad), aspecto anormal (falta de aseo personal) o la postura (pilo-erección o postura encorvada) durante el tiempo que el vendaje está en su lugar (1 semana).
5. Eliminación del vendaje (6-7 días post-trasplante)
- Anesthetize los ratones por inhalación de una solución de isofluorano 3% en una caja de inducción transparente (véase más arriba).
- Cortar el vendaje y el yeso con unas tijeras de la arteria y cuidadosamente eliminarlos. Nota: evitar el estiramiento del sitio de trasplante.
- Monitorear los ratones trasplantados en busca de signos clínicos (ver 4.3) y la puntuación para el rechazo de los injertos de piel (Tabla 1). Nota: El sistema de puntuación de injerto se aprovecha de las diferentes texturas de pelo en la cola de la piel en comparación con el dorsal de la piel. La aparición del trasplante y su rechazo se clasifica en 3 grados. Piel alogénico (MHC II no coinciden, por ejemplo, IA BM12) injertos de C57BL / 6 ratones inmunocompetentes son generalmente rechazados dentro de 12 a 15 días después del trasplante (datos propios y 15-20).
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Representative Results
En una primera aproximación C57BL / 6 ratones fueron trasplantados con aloinjertos BM12, los cuales IA y b syngrafts IA. Después de retirar el vendaje, injertos signos manifiestos de la cicatrización de heridas y sin cierre de la zona de contacto en C57BL / 6 ratones (Figura 1A). Después de la retirada del vendaje, CD4 + T inflamación mediada por células condujo a la aparición de áreas necróticas (manchas rojas) y el rechazo de aloinjertos BM12, los cuales IA en ratones C57BL / 6 ratones dentro de 13 días después del trasplante (Figura 1B-C, símbolos rellenos), mientras que syngrafts fueron tolerados durante un máximo de 100 días (Figura 1B-C, símbolos abiertos). Estos datos muestran la progresión de rechazo agudo de injertos BM12, los cuales IA en inmunocompetentes C57BL / 6 ratones.
Diversos estudios demuestran que el rechazo de MHC de clase II de la cola de piel de no coincidentes depende de la presencia de alogénicos de células T CD4 + (rev. en 12). De hecho, las células T deficientes CD3ε - / - </ sup> ratones y T y células B Rag2 deficiente - / - ratones mostraron la curación completa de la herida y toleraron el IA BM12 injertos de hasta 100 días (Figura 2), mientras que los ratones C57BL / 6 rechazada injertos dentro de 13 días (Figura 2) . La aceptación de IA BM12 coincidentes cola-piel permite el estudio de alogénicas células T CD4 + y sus funciones efectoras en un modelo de ratón sin patologías graves de la enfermedad.
Para romper la tolerancia establecida en CD3ε - / - y Rag2 - / - ratones, las células T CD4 + fueron trasladados adoptivamente: 2 x 10 4/6 policlonales células C57BL T CD4 + fueron suficientes para inducir el rechazo de injertos BM12, los cuales IA dentro de 14 días ( datos no mostrados). Transferencia de 50,000 y 100,000 de C57BL / 6 células T CD4 + no aceleró el proceso de rechazo del injerto en CD3ε - / - y Rag2 - / - ratones. Estos datos ponen de relieve el papel de allogenLas células T CD4 + EIC en el modelo de rechazo del injerto de piel aguda.
La ventaja de este modelo de trasplante de cola-piel es que el análisis funcional de las células T CD4 + se puede hacer fácilmente por transferencia adoptiva de células T CD4 + específicas de antígeno. El ratón transgénico ABM 9 se considera una herramienta ideal para delinear la activación y el comportamiento fenotípico de la población sin la influencia de las células no T CD4 + específicas. La transferencia de 2 x 10 4 células de ABM específicas de antígeno era suficiente para inducir el rechazo de los injertos de BM12, los cuales IA en Rag2 - / - ratones dentro de 13 días (Figura 3A-B). Además, las células de ABM son fáciles de aislar y pueden ser rastreados utilizando la expresión de las cadenas Vα2Vβ8-TcR (Figura 3C). La proliferación de células de ABM y la producción de citoquinas en BM12 IA trasplantaron Rag2 - / - ratones fueron investigados. Células ABM proliferaron extensificaciónVely como se determina por el ensayo de dilución eFluor670 (Figura 3D) y hasta 30% de las células de ABM produjo IFN-γ sobre PMA-estimulación (Figura 3E).
Tomados en conjunto, estos datos muestran que se requieren relativamente pocas células T CD4 + alogénicas para inducir el rechazo de injertos de piel IA BM12, los cuales, lo que hace este modelo ideal para el análisis de las células T alogénicas con patología grave mínima.
Figura 1. Trasplante de ratones con trasplante alogénico y la cola de piel de syngeneic. (A) ratones C57BL / 6 ratones fueron trasplantados con alogénico (IA BM12) y singénico (IA b)-cola de la piel (n = 5 por grupo). Fotos ilustran aloinjertos (izquierda) y syngrafts (derecha) después de la retirada del vendaje el día 7. (B) Puntuación y (C)supervivencia de los injertos de piel desde el día 7 hasta el día de rechazo o un control final (día 100). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Aloinjertos son tolerados en ausencia de células T en ratones de supervivencia de Rag2 -. / - Injertos de piel de ratón trasplantados en ratones C57BL / 6, CD3ε - - IA BM12 / - y Rag2 - / - ratones (n = 4-6 por grupo) y la ilustración de los injertos rechazados y aceptados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 3 células T CD4 + específicas contra la IA BM12 proliferan y producen IFN-γ durante el rechazo del injerto (A) Calificación y (B) la supervivencia de IA BM12, los cuales los injertos de piel en la cola-Rag2 -. / - Ratones (n = 5) adoptivamente transferido con 2 x 10 4 células de ABM específicas de antígeno. (C) Vα2Vβ8-tinción de las células de ABM aisladas de los ganglios linfáticos de ratones transgénicos ABM. (D) eFluor670 dilución de la proliferación de células de ABM y (E) la producción de IFN-γ de PMA- estimulado las células ABM aisladas de los ganglios linfáticos de IA BM12 piel injertada Rag2 - / -. ratones en el día 9 después de la transferencia adoptiva de células ABM (n = 5 ratones) Por favor, haga clic aquí paraver una versión más grande de esta figura.
| Injerto Puntuación | Descripción |
| 3 + | No hay áreas rojas y la presencia de una franja de color negro brillante |
| 2 + | Aparición de pequeñas zonas rojas, la pérdida de una franja de color negro brillante y sequedad |
| 1 + | La aparición de grandes áreas de color rojo, sin raya negro y la contracción |
| 0 | El rechazo de injerto define como 80% de necrosis |
Tabla 1. Sistema de puntuación de injerto. La aparición del trasplante y su rechazo es Categorized en 3 grados, aprovechando las diferentes texturas de pelo en la cola y dorsal-piel.
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Discussion
Trasplante de la piel es un método ampliamente utilizado para el estudio de rechazo y dependiente de las células T de la tolerancia. Desde que se estableció el modelo de trasplante de piel, se han aplicado varias adaptaciones y cambios. En el procedimiento descrito, IA BM12 trasplante de cola de piel se realiza con gas anestésico (isofluorano). El uso de la anestesia con gas reduce el tiempo de ejecución y la recuperación de los ratones, lo que disminuye la presión sobre los ratones trasplantados. El procedimiento emplea adhesivo tisular para fijar la cola de la piel, lo que tiende a curvarse más de oído o tejido dorsal-piel. Además es importante para aplanar la cola de la piel antes de cortar y recortar los bordes, ya que esto reduce el rizado y mejora el posicionamiento de la cola-piel en el sitio de escisión dorsal.
Para evaluar el rechazo de injertos o aceptación que se requiere para preparar la cola-piel con la banda negro (por ejemplo, en ratones C57BL / 6) en el centro del injerto para facilitar la puntuación de TRAnsplants basados en diferencias de textura del pelo.
La mutación de la molécula de BM12 MHC de clase II IA activa exclusivamente las células T CD4 + en inmunocompetentes y ratones inmunodeficientes (de los mismos antecedentes genéticos). Por un lado, esto facilita la interpretación de los resultados, pero por otro lado, limita el método a T CD4 + estudios de células. Para extender la activación de células T a otros subconjuntos de células T, cola de piel de otros donantes, por ejemplo, el mismo fondo genético incluyendo ratones IA bm1 y diferentes antecedentes genéticos incluyendo Balb / c ratones DBA o pueden ser trasplantados.
En los estudios de rechazo agudo, nos beneficiamos de la mutación natural en el MHC de clase II ranura y la activación de las células T CD4 + alogénicas para estudiar el rechazo de órganos en ratones. C57BL / 6 ratones rechazó injertos de piel IA BM12, los cuales dentro de los 14 días después del trasplante, lo que es consistente con la mayoría de los estudios USIpiel ng IA BM12 trasplantes 15-20. Además el modelo de rechazo agudo es ampliamente utilizado para probar el potencial alogénico de células T CD4 + de ratones deficiente en el gen. De hecho, el IFN-γ - / - ratones mostraron retraso IA BM12 rechazo del injerto de piel (datos no publicados y 16). El bloqueo de IFN-γ por la administración de anticuerpo de bloqueo de manera similar rechazo tardío 15,17,18. Esto indica un papel clave de IFN-γ en la iniciación de la expresión de MHC de clase II en Ag-presentar y las células endoteliales (Apocalipsis en el 12). Dado que los ratones deficientes-perforina no retrasó IA BM12 rechazo del injerto de piel 21, el papel de las citocinas parece ser más importante para el rechazo. De hecho, la IL-6 dio lugar a la administración prolongada supervivencia del injerto, posiblemente mediante la regulación negativa de IFN-γ-la producción 15. Además, los neutrófilos parecen jugar un papel importante en el rechazo de injertos de piel IA BM12, los cuales en ratones IL-4-19 deficiente BM12 rechazo de injertos en ratones 20. La administración de anti-CD3 retrasos de anticuerpos IA BM12 rechazo del injerto de piel en ratones inmunocompetentes (datos no publicados). Por otra parte, hemos demostrado que las células T deficientes CD3ε - / - y Rag2 - / - ratones aceptan los injertos de piel alogénicos para un máximo de 100 días. Tolerancia en estos ratones puede ser fácilmente revertida / roto por la transferencia adoptiva de células T CD4 + de inmunocompetentes C57BL / 6 ratones. Transferencia de 2 x 10 4 células T CD4 + o células de ABM específicas de antígeno es suficiente para inducir IA BM12 rechazo del injerto alrededor del día 14. Células de ABM Vα2Vβ8-positivos aislados mostraron extensa proliferación y la producción de IFN-γ en los ganglios linfáticos antes de rechazo, sin embargo rechazo era dependiente de la I-ABM12 expresoiones en el injerto de piel.
En resumen, este modelo de ratón es una excelente manera de estudiar la activación de un número bajo de células T durante el rechazo o tolerancia. El trasplante de cola-piel es fácil de realizar y se puede aplicar a los ratones con diferentes fondos genéticos para estudiar las respuestas alogénicas de células T sin incurrir en un efecto fisiológico grave. Por otra parte, este modelo es ideal para intervenciones con sustancias químicas y biológicas que inducen o romper la tolerancia del injerto de piel.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
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