Introduction
La transplantation d'organes solides tels que la peau, le cœur et les reins est maintenant une procédure standard dans la pratique médicale dans le monde entier 1. Organes transplantés avec succès peuvent être rejetés par l'activation du système immunitaire receveur, qui reconnaît les antigènes majeurs d'histocompatibilité du donneur. Patients transplantés donc besoin d'un traitement avec des médicaments immunosuppresseurs 2. Allogreffe de peau chez la souris a été créé par Medawar et ses collègues en 1955 et a été utile pour identifier les molécules ciblées plus tard décrit comme complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et II. Depuis lors, le modèle de greffe de peau a été continuellement modifié et adapté pour étudier le rôle des sous-ensembles de lymphocytes T et de la pertinence de l'intervention chimique et biologique dans la suppression du rejet de greffe 2-4. La peau de l'oreille et du tronc sont plus difficiles à préparer et sont plus sensibles à l'hypoxie et la nécrose de la peau queue 5; cependant,la procédure de transplantation est similaire. En outre, le suivi des greffes de peau de la queue est facile en raison de la texture des cheveux caractéristique de la peau.
Cet article prévoit une procédure détaillée pour le CMH de classe II inadéquation transplantation queue peau qui permet l'étude des différents aspects de CD4 + T à médiation cellulaire rejet d'allogreffe et de tolérance chez les souris. La mutation à trois points naturel dans la molécule du CMH de classe II I-Ab (appelé IA BM12) 6-9 est suffisante pour induire le rejet des allogreffes de la peau chez des souris C57BL / 6 souris 8. La molécule d'BM12 IA active les cellules T CD4 + avec divers récepteurs cellulaires αβ-T (TCR) des chaînes à partir de souris C57BL / 6, dont les lymphocytes T Vα2Vβ8-TCR spécifiques ont été identifiées, afin de générer une souris TCR transgéniques 10. Le transfert adoptif de lymphocytes T Vα2Vβ8-TcR-spécifiques a été utilisée pour établir un modèle de rejet dans C57B immunodéficientesL / 6 Rag2 - / - souris transplantées avec la peau IA BM12.
Les différences génétiques entre donneur et receveur impact sur le résultat de l'acceptation de la greffe et le rejet. Il existe différents types de greffes: autogreffes sont des greffes du destinataire individuel lui-même; syngrafts et allogreffes sont des greffes de personnes génétiquement identiques et sans lien génétique respectivement. Acceptation de différentes greffes d'organes allogéniques a été démontrée par intervention chimique et biologique chez les patients et les modèles de souris 11,3,4. Dans une approche de base, anticorps anti-CD3-traité souris C57BL / 6 a montré une survie prolongée des IA BM12 queue-peau (données non publiées). L'épuisement des CD4 + et T CD8 + avant la transplantation dans des souris receveuses abouti à l'acceptation de CMH de classe I et II greffes incompatibles (Rev. en 12). Fait intéressant, le rejet des greffes de peau dépend de la présence de cellules CD4 + 12). Dans ce modèle, le ciblage des interactions spécifiques entre les différentes cellules du système immunitaire en bloquant les molécules de co-stimulation avec des anticorps ou avec suppression des cellules T régulatrices pourrait induire une tolérance (données non publiées). En effet, le blocage à la fois CD40 et CD28 conduit à long terme allogreffe de tolérance cutanée 13,14.
Transplantation queue-peau est facile à réaliser et facile à contrôler par rapport à la transplantation d'autres organes. En outre, les greffes de peau de la queue sont faciles à préparer et sont moins sensibles à l'ischémie que les autres tissus de la peau. Contrairement aux anesthésiques injectés, l'utilisation de gaz anesthésique (de isofluorane) lors de la transplantation réduit à la fois la procédure et le temps de récupération de destinataire. Curling de la greffe de peau de la queue, ce qui peut conduire à une cicatrisation incomplète, le rejet de greffe, est empêchée par l'application de colle pour tissus. En outre, le modèle de transplantation queue peau IA BM12 active exclusivement CD4 Ce protocole décrit un modèle de souris fiables, reproductibles et facilement contrôlé qui permet une intervention chimique et biologique. Le modèle est conçu pour enquêter sur le rejet et l'induction de tolérance des greffes de peau queue.
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Protocol
Dans cette publication de la vidéo et du protocole, toutes les procédures d'animaux ont été effectuées conformément au protocole de l'animal approuvé par l'autorité cantonale de Bâle-Ville, Suisse. Effectuer toutes les procédures dans des conditions stériles là où c'est possible.
1. Préparation de chirurgie
- Autoclave tous les instruments chirurgicaux et gaze avant de l'utiliser.
- Chauffer le coussin chaud et organiser instruments chirurgicaux sur la table (Table des Matières / Méthodes).
- Ouvrez les bandages bande de doigt. Appliquez de la vaseline sur le pavé de la plaie avec un coton-tige (assurez-vous que la gaze est entièrement recouvert).
- Peser les souris et administrer l'analgésie buprénorphine 0,05 mg / kg de poids corporel. Remarque: ce sera une analgésie immédiatement après la transplantation.
2. Préparation de la Queue-peau pour la transplantation
- Euthanasier souris donneuses (par exemple, IA BM12) par asphyxie au CO2 et disinfect les queues avec une solution de désinfection avant l'excision.
- Placez la queue avec la bande noire sur un tableau en plastique propre et couper longitudinalement tout au long de la ligne médiane, une incision superficielle impliquant que la couche de la peau.
- Retirez la peau de la queue en utilisant une pince de préhension.
- Mettez la queue-peau dans une boîte de culture de 10 cm de cellule remplie avec 10 ml de HBSS.
3. Procédure chirurgicale
- Anesthésier les souris receveuses (par exemple, des souris C57BL / 6) par l'inhalation d'une solution d'isofluorane à 3% dans une boîte à induction transparent. Remarque: Il faut 3-5 minutes pour la souris pour atteindre plan chirurgical anesthésie. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
- Placez la souris sur le tapis tiède et appliquer 1,5% isofluorane par un masque et des ânes bouche chaque réflexe animal par orteil pincement.
- Raser le site dorsale des souris receveuses (par exemple, C57BL / 6) et enlever les poils de contamination en utilisant un sw de gaze secab.
- Désinfecter rasé le site de transplantation avec une solution aseptique.
- Pincer la peau avec des pinces dans le site milieu / droite du dos et utiliser des ciseaux courbes à faire une incision ronde d'environ 1 x 0,6 cm.
- En cas de saignement, puis nettoyer la plaie avec un coton-tige stérile.
- Évaluer la taille de l'incision et couper une greffe de la taille estimée de la queue-peau à l'aide du scalpel.
- Coupez les coins pour contourner la transplantation.
- Chargez la greffe sur le scalpel, l'excès de HBSS sec sur un coton-tige stérile et le placer dans le lit de la greffe de la souris receveuse.
- Éviter le chevauchement des donateurs et de la peau de l'hôte et appliquer l'adhésif de tissu sur la zone de contact exclusivement.
- Appliquer un enduit sans plis autour de la taille de la souris.
- Appliquer un bandage non élastique adhésif pour fixer le plâtre à la souris (3 mm décalé).
- Inciser avec les ciseaux environ 3 mm dans le site ventrale supérieure du bandage. Note: Ceci est pour éviter trapping des dents de la souris lors de la phase de récupération.
- Retirer l'anesthésie-bouche-masque et garder les souris transplantées sur le coussin chauffant jusqu'à éveillé.
- Retour souris transplantées dans leurs cages quand il est complètement rétabli et évaluer leur mobilité afin de s'assurer que le bandage n'est pas trop serré.
- Stériliser l'ensemble des instruments chirurgicaux avec l'éthanol 70% avant de procéder à une intervention chirurgicale suivante.
4. Soins post-opératoires
- Ajouter le sirop contenant du paracétamol à l'eau de boisson (4 mg / ml) et de l'administrer pendant 7 jours.
- Souris Retour à la salle de l'animal une fois qu'il a récupéré.
- Suivre de près les souris des signes cliniques, y compris la dépression ou d'autres changements de comportement (alimentaires ou immobilité), apparence anormale (manque de toilettage) ou la posture (horripilation ou posture recroquevillée) pour le moment le pansement est en place (1 semaine).
5. Bandage Removal (6-7 jours post-transplantation)
- Anesthetize les souris par inhalation d'une solution isofluorane à 3% dans un caisson d'aspiration transparente (voir ci-dessus).
- Couper bandage en plâtre avec des ciseaux de l'artère et retirez les. Remarque: éviter l'étirement du site de transplantation.
- Surveillance de la souris transplantées des signes cliniques (voir 4.3) et le score de rejet des greffes de peau (tableau 1). Remarque: Le système de pointage de greffe prend avantage des différentes textures de cheveux sur la queue-peau par rapport à la dorsale peau. L'aspect de la greffe et le rejet est catégorisée en trois niveaux. Peau allogénique (CMH II correspondent pas, par exemple, IA BM12) greffes de souris C57BL / 6 immunocompétents sont généralement rejetés dans 12-15 jours post-greffe (propres données et 15-20).
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Representative Results
Dans une première approche C57BL / 6 ont été transplantés avec IA allogreffes BM12 et IA b syngrafts. Après élimination de bandage, greffes signes manifestes de la cicatrisation sans fermeture de la zone de contact en souris C57BL / 6 (Figure 1A). Après élimination de bandage, CD4 + T inflammation à médiation cellulaire a conduit à l'apparition de zones nécrotiques (taches rouges) et le rejet des IA allogreffes BM12 dans souris C57BL / 6 dans les 13 jours après la transplantation (figure 1B-C, les symboles pleins), tandis que syngrafts ont été bien tolérées jusqu'à 100 jours (figure 1B-C, symboles ouverts). Ces données montrent la progression du rejet aigu de greffe IA de BM12 dans immunocompétents souris C57BL / 6.
Diverses études montrent que le rejet du CMH de classe II queue peau incompatibles dépend de la présence de cellules T CD4 + allogéniques (Rev. en 12). En effet, des cellules T déficientes CD3e - / - </ sup> souris et T et les cellules B Rag2 déficiente - / - souris ont montré la guérison complète de la plaie et tolérés IA BM12 greffe jusqu'à 100 jours (figure 2), alors que C57BL / 6 a rejeté les greffes dans les 13 jours (Figure 2) . L'acceptation de IA BM12 queue peau dépareillés permet l'étude des cellules allogéniques T CD4 + et leurs fonctions effectrices dans un modèle de souris sans pathologies graves de la maladie.
Pour briser la tolérance établie dans CD3e - / - et Rag2 - / - souris, les cellules T CD4 + ont été adoptive transférés: 2 x 10/6 cellules T CD4 + C57BL 4 polyclonaux étaient suffisantes pour induire le rejet de IA greffes de BM12 dans les 14 jours ( données non présentées). Le transfert de 50 000 et 100 000 C57BL / 6 cellules T CD4 + n'a pas accéléré le processus de rejet de greffe dans CD3e - / - et Rag2 - / - souris. Ces données soulignent le rôle de allogeneic cellules T CD4 + dans le modèle de rejet de greffe de peau aiguë.
L'avantage de ce modèle de transplantation queue peau est que l'analyse fonctionnelle des cellules T CD4 + peut être facilement fait par transfert adoptif de cellules spécifiques de l'antigène T CD4 +. La souris transgénique ABM 9 est considéré comme un outil idéal pour délimiter l'activation et le comportement phénotypique de la population sans l'influence des cellules T CD4 + non-spécifiques. Le transfert de 2 x 10 4 cellules ABM spécifiques de l'antigène était suffisante pour induire le rejet de greffes d'IA BM12 dans Rag2 - / - souris dans les 13 jours (figure 3A-B). En outre, les cellules ABM sont faciles à isoler et peuvent être suivis en utilisant l'expression des chaînes Vα2Vβ8-TCR (Figure 3C). ABM prolifération cellulaire et la production de cytokines dans BM12 IA transplantées Rag2 - / - ont été étudiés. ABM cellules prolifèrent extensificationvement comme déterminé par dosage eFluor670 dilution (Figure 3D) et jusqu'à 30% des cellules ABM produite IFN-γ à une stimulation par PMA (Figure 3E).
Prises ensemble, ces données montrent que relativement peu de cellules T CD4 + allogéniques sont nécessaires pour induire le rejet de IA BM12 greffes de peau, ce qui rend ce modèle idéal pour l'analyse des lymphocytes T allogéniques avec une pathologie sévère minimal.
Figure 1. Transplantation allogénique de souris avec et queue-peau syngéniques. (A) C57BL / 6 ont été transplantés avec allogénique (IA BM12) et syngénique (IA b) la queue-peau (n = 5 par groupe). Photos illustrent allogreffes (à gauche) et syngrafts (à droite) après le retrait du bandage au jour 7. (B) de notation et (C)survie des greffes de peau à partir de 7 jours jusqu'au jour de rejet ou de suivi final (jour 100). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Allogreffes sont tolérés en l'absence de cellules T chez la souris de survie de Rag2 -. / - Greffes de peau de souris transplantées dans des souris C57BL / 6, CD3e - - IA BM12 / - et - / - rag2 souris (n = 4-6 par groupe) et illustration des greffes rejetées et acceptées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 3 Anti-IA BM12 cellules T CD4 + spécifiques prolifèrent et produisent de l'IFN-γ au cours du rejet de greffe (A) Notation et (B) la survie des IA BM12 greffes queue peau dans Rag2 -. / - Souris (n = 5) adoptive transféré avec 2 x 10 4 cellules ABM spécifiques de l'antigène. (C) Vα2Vβ8-coloration des cellules ABM isolés à partir de ganglions lymphatiques de souris ABM transgéniques. (D) eFluor670 dilution de la prolifération des cellules ABM et (E) la production d'IFN-γ de PMA- cellules stimulées ABM isolés à partir de ganglions lymphatiques de IA BM12 peau greffée Rag2 - / -. souris le jour 9 après le transfert adoptif de cellules ABM (n = 5 souris) S'il vous plaît cliquer ici pourvoir une version plus grande de cette figure.
| Score greffe | Description |
| 3 + | Pas de zones rouges et la présence d'une bande noir brillant |
| 2 + | Apparition de petites zones rouges, la perte d'une bande noir brillant et la sécheresse |
| 1 + | Apparition de grandes zones rouges, pas de bande noire et retrait |
| 0 | Le rejet de greffe défini comme 80% de nécrose |
Tableau 1. Du système de partition du greffon. L'aspect de la greffe et le rejet est categorized en 3 catégories, en profitant des différentes textures de cheveux sur la queue et dorsale-peau.
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Discussion
la transplantation de la peau est une méthode largement utilisée pour l'étude de rejet et de la tolérance des lymphocytes T dépendant. Comme le modèle de transplantation de la peau a été établi, plusieurs adaptations et modifications ont été appliquées. Dans la procédure décrite, IA BM12 transplantation queue peau est réalisée en utilisant des gaz anesthésiques (de isofluorane). L'utilisation de l'anesthésie au gaz diminue le temps d'exécution et la récupération des souris, ce qui diminue le stress sur les souris transplantées. Le procédé emploie un adhésif tissulaire à fixer la queue de la peau, qui a tendance à se courber plus que l'oreille ou la peau dorsale de tissu. En outre, il est important pour aplatir la queue avant de couper la peau et le rognage des bords car cela réduit curling et améliore le positionnement de la queue-cutanée sur le site d'excision dorsale.
Pour évaluer le rejet de greffe ou d'acceptation, il est nécessaire de préparer la queue-peau avec la bande noire (par exemple, dans C57BL / 6) au milieu de la greffe de faciliter la notation des transplants basées sur les différences de texture de cheveux.
La mutation de la molécule de CMH de classe II BM12 IA active exclusivement les cellules T CD4 + dans immunocompétentes et des souris immunodéficientes (du même arrière-plan génétique). D'une part, cela facilite l'interprétation des résultats, mais d'autre part elle limite le procédé à cellules T CD4 + études. Pour prolonger l'activation des cellules T à d'autres sous-ensembles de cellules T, la queue-peau d'autres bailleurs de fonds, par exemple, même fond génétique, y compris les souris IA de fond génétique différent et dont Balb / c ou DBA souris peuvent être transplantés.
Dans les études de rejet aigu, nous bénéficions de la mutation naturelle dans la classe II du CMH gorge et l'activation des cellules T CD4 + allogéniques pour étudier le rejet d'organe chez les souris. Souris C57BL / 6 a rejeté IA BM12 greffes de peau dans les 14 jours après la transplantation, qui est compatible avec la plupart des études usipeau ng IA BM12 greffes 15-20. En outre, le modèle d'un rejet aigu est largement utilisé pour tester le potentiel allogénique de cellules T CD4 + à partir de souris génétiquement déficientes. En effet, l'IFN-γ - / - souris ont montré retardé IA BM12 greffe de peau rejet (données non publiées et 16). IFN-γ blocage par l'administration d'anticorps bloquant retardé de façon similaire rejet 15,17,18. Cela indique un rôle clé de l'IFN-γ dans le lancement expression du CMH de classe II sur Ag-présentation et les cellules endothéliales (Rev. en 12). Depuis souris de la perforine déficiente ne tarda pas IA BM12 greffe de peau rejet 21, le rôle des cytokines semble être plus important pour le rejet. En effet, l'administration d'IL-6 a entraîné la survie du greffon prolongée, éventuellement par la régulation négative de l'IFN-γ-production 15. En outre, les neutrophiles semblent jouer un rôle majeur dans le rejet de l'AI BM12 greffes de peau chez des souris IL-4-19 déficient BM12 rejet de greffe chez des souris 20. L'administration d'anti-CD3 retards anticorps IA BM12 greffe de peau rejet chez des souris immunocompétentes (données non publiées). De plus, nous avons montré que les cellules T déficientes CD3e - / - et Rag2 - / - souris acceptent les greffes allogéniques de la peau pour un maximum de 100 jours. Tolérance chez ces souris peut être facilement revenue / cassé par le transfert adoptif de lymphocytes T CD4 + de immunocompétents souris C57BL / 6. Transfert de 2 x 10 4 cellules T CD4 + ou cellules ABM spécifiques de l'antigène est suffisante pour induire IA BM12 rejet de greffe autour du jour 14. Cellules ABM Vα2Vβ8 positifs isolés ont montré vaste prolifération et la production d'IFN-γ dans les ganglions lymphatiques avant rejet, mais rejet était dépendante de I-Abm12 expression dans la greffe de peau.
En résumé, ce modèle de souris est un excellent moyen pour étudier l'activation du nombre de cellules T faible en cas de rejet ou de tolérance. La transplantation queue peau est facile à réaliser et peut être appliqué à des souris avec différentes origines génétiques pour étudier les réponses allogéniques de cellules T sans encourir un effet physiologique grave. De plus, ce modèle est idéal pour les interventions avec des substances chimiques et biologiques qui induisent ou cassent la peau tolérance du greffon.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
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