Introduction
このような皮膚、心臓、腎臓などの固形臓器の移植は現在、世界の医療行為1の標準的な手順である。正常に移植された臓器は、ドナーの主要組織適合性抗原を認識するレシピエントの免疫系の活性化によって拒絶することができる。このため、移植患者は免疫抑制剤2を用いた治療を必要としています。マウスでの同種皮膚移植は1955年にメダウォアらによって設立され、後に主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIおよびIIとして記述対象となる分子を同定するために有用だった。それ以来、皮膚移植モデルを連続的に変更され、T細胞サブセットの役割および移植片拒絶2-4を抑制するのに化学的および生物学的介入の関連性を研究するために適合されている。耳とトランクから肌を準備するのがより困難であると尾の皮膚5よりも低酸素症や壊死を受けやすい。しかし、移植手順は同様である。また尾の皮膚移植のモニタリングは、皮膚の特徴的な髪の質感が容易です。
この記事では、CD4 + T細胞媒介同種移植片拒絶およびマウスにおける寛容の様々な側面の研究を可能にし、MHCクラスIIミスマッチ尾皮膚移植のための詳細な手順を提供します。 （IA BM12と呼ばれる）MHCクラスII分子IA b は6-9の天然の三点突然変異は、C57BL / 6マウス8における皮膚同種移植片の拒絶反応を誘導するのに十分である。 IAのBM12分子は、種々のαβ-T細胞受容体Vα2Vβ8-TCR特異的T細胞は、TCR-トランスジェニックマウス10を生成するために、同定され、そのうちC57BL / 6マウスからの（TCR）の鎖を用いてCD4 + T細胞を活性化する。 Vα2Vβ8-TCR特異的T細胞の養子移入は、免疫不全C57Bに拒絶モデルを確立するために使用されているL / 6 RAG2 - / - IA BM12皮膚を移植したマウス。
ドナーとレシピエント間の遺伝的差異は、移植受容と拒絶の結果に影響を与える。移植の異なる種類があります。自家移植は、レシピエント個体自体からの移植である。 syngraftsおよび同種移植片は、それぞれ遺伝的に同一と遺伝的に無関係な個人からの移植である。別の同種臓器移植の受け入れは、患者とマウスモデル11,3,4における化学的および生物学的介入によって実証されている。基本的なアプローチでは、抗CD3抗体で処理したC57BL / 6マウスIA BM12尾皮膚（未発表データ）の生存期間の延長を示した。レシピエントマウスにおける移植の前にCD4 +およびCD8 + T細胞の枯渇は、MHCクラスIおよびIIミスマッチ移植片（12改訂）の受入れをもたらした。興味深いことに、皮膚移植片の拒絶反応は、CD4 +の存在に依存する（12牧師）。このモデルでは、調節性T細胞と抗体または抑制との共刺激分子を遮断することによって、異なる免疫細胞間の特異的相互作用を標的とする（未発表データ）寛容を誘導し得る。実際、CD40およびCD28の両方を遮断することは、長期的な皮膚同種移植片寛容13,14につながった。
尾の皮膚移植は他の臓器の移植に比べて実行が容易であり、監視が容易です。また、尾の皮膚移植は、調製が容易であり、他の皮膚組織よりも虚血を受けにくい。注入された麻酔薬とは対照的に、移植時の麻酔ガス（イソフルラン）の使用は、プロシージャおよび受信者の回復時間の両方を短縮します。不完全な創傷治癒および移植片拒絶につながる可能性尾皮膚移植のカールは、組織接着剤の適用によって防止される。さらに、IA BM12尾皮膚移植モデルでは、排他的に、CD4を活性化させる このプロトコルは、化学的、生物学的な介入を可能にし、信頼性の高い再現性があり、容易に監視マウスモデルを説明しています。モデルは、尾の皮膚移植の拒絶と寛容の誘導を調査対象としています。
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Protocol
このビデオ出版物およびプロトコルでは、すべての動物の手順はカントン当局バーゼルシュタット、スイスで承認された動物プロトコルに従って行った。可能な限り無菌状態ですべての手順を実行します。
外科1。準備
- 使用前にすべての手術器具やガーゼをオートクレーブ。
- 暖かいパッドを加熱して、テーブル（ 材料/方法の表 ）に手術器具を整理します。
- 指ストリップ包帯を開きます。 （ガーゼが完全に覆われていることを確認してください）綿棒で創傷パッドの上にワセリンを適用します。
- マウスの重さおよび鎮痛ブプレノルフィン0.05 mg / kg体重を管理します。注意：これはすぐに移植後鎮痛を提供します。
移植のためのテール皮膚の2。準備
- CO 2窒息とDあたりのドナーマウス（ 例えば、IA BM12）を安楽死させる切除する前に消毒液で尾をisinfect。
- きれいなプラスチック板に黒のストライプを下にして尾を置き、中央のライン全体で縦にカットし、スキン層のみが関与する表面的な切開を行う。
- 把持鉗子を使用して、尾から肌をやってのける。
- 10ミリリットルのHBSSで満たされた10cmの細胞培養皿の中で尾の皮膚を置く。
3。外科的手技
- 透明インダクションボックスの3％イソフルラン溶液を吸入によってレシピエントマウス（ 例えば、C57BL / 6）を麻酔。注意：マウスは、手術平面麻酔を達成することは3〜5分かかります。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
- 暖かいパッドの上にマウスを置き、つま先をつまんで、各動物レフ口マスクとロバを経由して1.5％イソフルランを適用します。
- レシピエントマウスの背側部位（ 例えば、C57BL / 6）を剃るとドライガーゼSWを使用して、汚染の毛を取り除くAB。
- 無菌性溶液で剃毛移植部位を消毒。
- 背の右/中央のサイトにある鉗子で皮膚をつまんで、約1×0.6cmの円形の切開を作るために湾曲したハサミを使用しています。
- 出血が発生した場合は、その後、滅菌綿棒で傷口をきれいに。
- 切開の大きさを評価し、メスを用いて尾部皮膚から推定サイズの移植をカット。
- 移植を丸めるコーナーをトリム。
- 滅菌綿棒で、メス、HBSSの乾燥過剰に移植をロードし、レシピエントマウスの移植床に置きます。
- ドナーとホストの皮膚の重複を回避し、独占的に接触領域に組織接着剤を適用します。
- マウスの腰の周りにしわなしに石膏を適用します。
- （3ミリメートルシフト）は、マウスに石膏を固定するための接着剤の非弾性包帯を適用します。
- 包帯の上腹、サイト内の3ミリメートル程度ハサミで切開する。注：これは、trのを回避することである回復期のマウスの歯のapping。
- 麻酔から口にマスクを外し、目を覚ましまで加熱パッド上に移植されたマウスを保持します。
- 完全に回復した場合にのみケージに移植されたマウスを戻し、包帯がきつすぎるではないことを確実にするために彼らの移動性を評価します。
- 次の手術に進む前に70％エタノールですべての手術器具を滅菌する。
4。術後ケア
- 飲料水（4 mg / ml）をにパラセタモール含有シロップを追加し、7日のためにそれを管理します。
- それが回復した後、動物の部屋にマウスを返します。
- 密接に包帯が所定の位置にある時間（1週間）のために、うつ病やその他の行動の変化（食事や不動）、異常な外観（グルーミングの欠如）や姿勢（PILO - 勃起や猫背の姿勢）を含む臨床兆候をマウスを監視します。
5。包帯除去（6-7日後の移植）
- Anes透明インダクションボックスの3％イソフルオラン液の吸入によるthetizeマウス（上記参照）。
- 動脈ハサミで包帯や絆創膏をカットし、慎重にそれらを削除します。注：移植部位の伸縮を避ける。
- 臨床徴候のために移植されたマウスを監視する（4.3参照）、皮膚移植片（ 表1）の拒絶のために得点。注：グラフ、スコアシステムは、背の皮膚に比べて尾部皮膚に異なる髪のテクスチャを利用しています。移植とその拒絶反応の出現は3等級に分類されている。 C57BL / 6免疫応答性マウスの同種皮膚（MHC IIの不一致、 例えば、アイオワBM12）移植片は、通常12から15日後に移植（自分のデータと、15〜20）内で拒否されます。
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Representative Results
最初のアプローチで、C57BL / 6マウスのIA BM12同種移植片およびIA B型syngraftsを移植した。包帯除去後の、C57BL / 6マウス（ 図1A）における接触ゾーンの閉鎖せずに移植片、創傷治癒の徴候をマニフェスト。 syngraftsながら包帯を除去した後、CD4 + T細胞媒介炎症は、移植後13日以内に、C57BL / 6マウス（キャラクターいっぱい図1B-C）で壊死領域（赤い斑点）の外観およびIAのBM12の同種移植片の拒絶反応につながった最大100日間（ 図1B-C、白抜きの記号）のために許容された。これらのデータは、免疫応答性C57BL / 6マウスにおけるIAのBM12移植片の急性拒絶反応の進行を示している。
種々の研究は、MHCクラスIIミスマッチ尾の皮膚の拒絶反応が同種異系CD4 + T細胞（12改訂）の存在に依存することを実証している。確かに、T細胞欠損CD3ε - / - </ SUP>マウスおよびT-およびB-細胞が欠損RAG2 - / -マウスは、完全な創傷治癒を示し、C57BL / 6マウス（ 図2）13日以内に移植片を拒絶し、一方、IA BM12は 、100日（ 図2）までグラフト耐容。 IA BM12ミスマッチ尾の皮膚の受容は重篤な疾患の病理のないマウスモデルにおいて、同種CD4 + T細胞およびそれらのエフェクター機能の研究を可能にする。
- / -およびRAG2 -確立されたCD3εにおける寛容を破壊する/ -マウスは、CD4 + T細胞を養子移入した：2×10 4ポリクローナルC57BL / 6 CD4 + T細胞（14日以内IAのBM12移植片の拒絶反応を誘導するのに十分であったデータは示さず）。 - / - 50,000〜100,000 C57BL / 6 CD4 + T細胞の移入は、CD3εにおける移植片拒絶反応プロセスを加速せず、RAG2 - / -マウス。これらのデータは、allogenの役割を強調する急性皮膚移植片拒絶モデルにおけるEIC CD4 + T細胞。
この尾の皮膚移植モデルの利点は、CD4 + T細胞の機能解析を容易に抗原特異的CD4 + T細胞の養子移入することによって行うことができることである。トランスジェニックマウスABM 9は 、非特異的CD4 + T細胞の影響を受けることなく、活性化および集団の表現型の挙動を描写するための理想的なツールと考えられている。 13日間（ 図3A-B）内- / -マウス2×10 4個の抗原特異的ABM細胞の移動は、RAG2におけるIAのBM12移植片の拒絶反応を誘導するのに十分であった。また、ABM細胞は、単離が容易であり、Vα2Vβ8-TCR鎖（ 図3C）の式を用いて追跡することができる。 - / -マウスを調べたRAG2移植IA BM12におけるサイトカインのABM細胞増殖および生産。 ABM細胞が増殖しextensieFluor670希釈アッセイ（ 図3D）によって決定され、ABM細胞の最大30％が、PMA刺激（ 図3E）の際のIFN-γを産生しvelyとして。
まとめると、これらのデータは、比較的少数の同種異系CD4 + T細胞は最小限の重度の病状を有する同種異系T細胞の分析のために、この理想的なモデルをレンダリングする、IA BM12の皮膚移植片の拒絶反応を誘導するために必要とされることを示している。
図1。同種と同系尾の皮膚を用いたマウスの移植。 （A）C57BL / 6マウスを、同種異系（IA BM12）および同系（IA b）は尾部皮膚た（n = 5群）を移植した。写真は、7日目に包帯を除去した後（右）の同種移植片（左）とsyngraftsを示す。（B）スコア、および（C）拒絶または最終的なモニタリングの日まで7日目からの皮膚移植片の生存（100日目）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
。図2は、同種移植片マウスにおけるT細胞の不在下で許容されるの生存RAG2 - / - IA BM12 - C57BL / 6マウスに移植した皮膚移植片、CD3ε - / -およびRAG2 - / -マウス（n = 4-6グループごと）および拒否され、受け入れられた移植片の図。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
。図3抗IA BM12特異的CD4 + T細胞は増殖し、移植片拒絶の間、IFN-γを産生する（A）スコアおよびIA BM12尾の皮膚RAG2における移植片の（B）生存- / -マウス（n = 5）養子2×10 4個の抗原特異的ABM細胞を移した。ABMの増殖細胞のトランスABMマウスのリンパ節から単離されたABM細胞（C）Vα2Vβ8染色。（D）eFluor670希釈液との（E）IFN-γ産生PMA- - / - IA BM12の皮膚のリンパ節から分離ABM細胞が移植されたRAG2刺激した。養子ABM細胞移入後9日目マウス（n = 5マウス） には、ここをクリックしてください。この図の拡大版を表示します。
| グラフトスコア | 説明 |
| 3 + | 赤いエリアはなく、光沢のある黒のストライプの存在 |
| 2 + | 小さな赤い領域の外観、光沢のあるブラックストライプや乾燥の損失 |
| 1 + | 大きな赤い部分の見え方、黒いストライプと収縮 |
| 0 | 移植片拒絶は、80％の壊死のように定義 |
表1。グラフトスコアシステム。移植とその拒絶反応の出現はケイトですテールと背皮膚に異なる髪のテクスチャを利用して、3グレードでgorized。
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Discussion
皮膚移植拒絶反応およびT細胞依存耐性を研究するために広く用いられる方法である。皮膚移植モデルが確立されて以来、いくつかの適応および変更が適用されている。記載された手順では、IA BM12尾の皮膚移植が麻酔ガス（イソフルラン）を用いて行われる。ガス麻酔を使用すると、移植されたマウスへのストレスを減少させる実行し、マウスの回復の時間が短縮されます。手順は、耳や背皮膚組織よりも多くをカールする傾向がある、尾の皮膚を修正するために組織接着剤を採用しています。しかもこれがカーリングを軽減し、背側切除部位での尾の皮膚の位置を向上させるようにエッジを切断し、トリミング前の尾の皮膚を平らにすることが重要です。
移植片拒絶または受諾を評価するためには、TRAの得点を容易にするために、移植片の中央に（C57BL / 6マウスでは、例えば ）ブラックストライプと尾の皮膚を準備するために必要である髪質の違いに基づいてnsplants。
MHCクラスIIのIA BM12分子の変異は、排他的に（同じ遺伝的背景の）免疫担当し、免疫不全マウスにおけるCD4 + T細胞を活性化させる。一方で、これは結果の解釈を容易にするが、他方で、それはCD4 + T細胞の調査にメソッドを制限する。 例えば 、他のT細胞サブセット、他のドナーからの尾の皮膚へのT細胞の活性化を拡張するために、IA BM1マウスおよびBALB / cまたはDBAマウスを含む様々な遺伝的背景を含め、同じ遺伝的背景を移植することができる。
急性拒絶反応の研究では、MHCクラスII溝内に天然に存在する突然変異マウスにおける臓器拒絶反応を研究するための同種異系のCD4 + T細胞の活性化から利益を得る。 C57BL / 6マウスに、ほとんどの研究USIと一致している、移植後14日以内に、IA BM12の皮膚移植片を拒絶したIA BM12皮膚移植を、15〜20 ng の 。また、急性拒絶モデルは広く遺伝子欠損マウスからのCD4 + T細胞の同種異系潜在性を試験するために使用される。実際に、IFN-γ - / -マウスは、遅延IA BM12皮膚移植片拒絶（未発表データ及び16）を示した。抗体も同様に遅延した拒絶15,17,18をブロックの投与により、IFN-γをブロックする。これは、Ag提示および内皮細胞（12牧師）上のMHCクラスIIの発現を開始する中でのIFN-γの重要な役割を示している。パーフォリン欠損マウスは、IA BM12皮膚移植片拒絶21を遅らせなかったので、サイトカインの役割は、拒否 の方が重要であると思われる。実際、IL-6の管理は、おそらくIFN-γ産15をダウンレギュレーションすることにより、長期の移植片生存をもたらした。また、好中球はIL-4欠損マウスにおける19 IA BM12の皮膚移植片の拒絶反応において主要な役割を果たすように見える20におけるABT-100ブロックサイトカイン分泌や遅延IA BM12移植片拒絶反応を観察することによって強化される。免疫応答性マウス（未発表データ）中の抗CD3抗体の遅れIA BM12皮膚移植片拒絶を投与。 - / -およびRAG2 - / -マウスは、最大100日間、同種皮膚移植片を受け入れるまた、我々は、T細胞欠損CD3εことを示した。これらのマウスにおける寛容を容易に戻すことができ/免疫応答性C57BL / 6マウス由来のCD4 + T細胞の養子移入によって破壊した。 2×10 4個の CD4 + T細胞または抗原特異的ABM細胞の移動は、14日目の周りIA BM12移植片拒絶反応を誘導するのに十分である。単離さVα2Vβ8陽性ABM細胞は、しかしながら、拒絶反応の前にリンパ節に大規模な増殖およびIFN-γ産生を示した拒絶反応は、I-Abm12エクスプレスに依存していた皮膚移植におけるイオン。
要約すると、このマウスモデルは、拒絶または耐性の間の低T細胞数の活性化を研究するための優れた方法である。尾皮膚移植は実行が容易であり、重篤な生理学的効果を招くことなく、T細胞の同種異系応答を研究するために、異なる遺伝的背景を有するマウスに適用することができる。また、このモデルは、皮膚移植寛容を誘導するか、または壊す化学的および生物学的物質との介入のための理想的です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
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