Introduction
O transplante de órgãos sólidos, tais como a pele, o coração e os rins já é um procedimento padrão na prática médica mundial 1. Órgãos transplantados com sucesso pode ser rejeitado pela activação do sistema imune receptor, o qual reconhece os principais antigénios de histocompatibilidade dos dadores. Pacientes transplantados Portanto precisam de tratamento com drogas imunossupressoras 2. O transplante alogênico de pele em ratos foi estabelecida por Medawar e seus colegas em 1955 e foi útil para identificar as moléculas-alvo mais tarde descrito como complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e II. Desde então, o modelo de transplante de pele tem sido continuamente modificado e adaptado para estudar o papel das subpopulações de células T e a relevância da química e biológica de intervenção na supressão da rejeição do enxerto 2-4. Pele da orelha e tronco são mais difíceis de preparar e são mais suscetíveis à hipóxia e necrose de pele tail-5; no entanto,o procedimento de transplante é semelhante. Além disso, o monitoramento de transplantes de cauda de pele é fácil, devido à textura do cabelo característico da pele.
Este artigo fornece um procedimento detalhado para a classe II do MHC transplante incompatibilidade cauda-de pele que permite que para o estudo de diferentes aspectos dos linfócitos T CD4 + mediada por células T e tolerância rejeição do enxerto em murganhos. A mutação de três pontos natural na molécula de MHC de classe II IA b (chamado IA BM12) 6-9 é suficiente para induzir a rejeição de enxertos de pele em ratos C57BL / 6 8. A molécula BM12 IA activa as células T CD4 + com vários receptores de células αβ-T (TCR) cadeias de ratinhos C57BL / 6, entre os quais as células T Vα2Vβ8-específicos de TCR foram identificados, a fim de gerar um ratinho transgénico Tc-10. A transferência adoptiva de células T específicos de TCR Vα2Vβ8 tem sido usado para estabelecer um modelo de rejeição em C57B imunodeficienteL / 6 RAG2 - / - ratos transplantados com IA BM12 pele.
As diferenças genéticas entre doador e receptor influência sobre o resultado de aceitação de transplante e rejeição. Existem diferentes tipos de transplantes: auto-enxertos são transplantados a partir do próprio indivíduo receptor; syngrafts e enxertos são transplantes de indivíduos geneticamente idênticos e geneticamente não relacionadas, respectivamente. A aceitação de transplante de órgãos alogénicos foi demonstrada por intervenção química e biológica de pacientes e de modelos de rato 11,3,4. Numa abordagem básica, anti-CD3 tratadas com anticorpo C57BL / 6 ratos mostraram sobrevivência prolongada de IA BM12 cauda-de pele (dados não publicados). A depleção de células T CD4 + e CD8 +, células T antes do transplante em ratinhos receptores resultou na aceitação do MHC de classe I e II enxertos incompatíveis (rev. em 12). Curiosamente, a rejeição de enxertos de pele depende da presença de células T CD4 + 12). Neste modelo, tendo como alvo as interacções específicas entre as células imunes diferentes, bloqueando as moléculas de co-estimulação com anticorpos ou com supressão de células T reguladoras, pode induzir tolerância (dados não publicados). Na verdade, bloqueando tanto CD40 e CD28 levou a longo prazo a tolerância do enxerto de pele 13,14.
O transplante de pele da cauda-é fácil de realizar e é fácil de monitorizar em comparação com o transplante de outros órgãos. Além disso, os transplantes de pele de cauda são fáceis de preparar e são menos susceptíveis à isquemia do que os outros tecidos da pele. Em contraste com os anestésicos injectáveis, o uso de gás anestésico (isoflurano) durante o transplante de ambos encurta o processo e o tempo de recuperação do destinatário. Curling do transplante de cauda-de pele, o que pode conduzir a cicatrização incompleta e rejeição de enxerto, é evitada por aplicação de adesivo de tecido. Além disso, o modelo de transplante de pele da cauda-IA BM12 ativa exclusivamente CD4 Este protocolo descreve um modelo fiável, reprodutível e facilmente monitorado rato que permite a intervenção química e biológica. O modelo destina-se a investigar a rejeição ea tolerância indução de transplantes de rabo-de pele.
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Protocol
Nesta publicação de vídeo e protocolo, todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com o protocolo de animais aprovados pela Autoridade cantão Basileia-Cidade, Suíça. Execute todos os procedimentos em condições estéreis, sempre que possível.
1. Preparação de Cirurgia
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e gaze antes de usar.
- Aqueça a almofada quente e organizar instrumentos cirúrgicos sobre a mesa (Tabela de Materiais / Métodos).
- Abra as ataduras tira dedo. Aplique vaselina na almofada ferida com um cotonete (certifique-se a gaze é completamente coberto).
- Pesar os ratinhos e administrar analgesia buprenorfina 0,05 mg / kg de peso corporal. Nota: este vai proporcionar analgesia imediatamente após o transplante.
2. Preparação do Cauda-pele para Transplante
- Eutanásia camundongos doadores (por exemplo, BM12 IA) por asfixia CO 2 e disinfect as caudas com solução desinfetante antes da excisão.
- Posicione o rabo com a tarja preta para baixo em uma placa de plástico limpo e corte-o longitudinalmente ao longo da linha do meio, fazendo uma incisão superficial envolvendo apenas a camada de pele.
- Retire a pele da cauda usando uma pinça agarrando.
- Coloque o rabo-de pele em uma placa de cultura de 10 centímetros célula cheia com 10 ml de HBSS.
3. Procedimento Cirúrgico
- Anestesiar ratos receptores (por exemplo, ratinhos C57BL / 6) por inalação de uma solução a 3% de isofluorano em uma caixa de indução transparente. Nota: Demora 3-5 min para o mouse para chegar a anestesia plano cirúrgico. Use veterinário pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
- Coloque o mouse sobre a almofada morna e aplique 1,5% isofluorano através de uma máscara boca e bundas cada reflexo animais por toe beliscar.
- Raspar o site dorsal dos ratos destinatário (por exemplo, C57BL / 6) e remover os pêlos contaminantes usando um sw gaze secaab.
- Desinfetar local transplante raspada com uma solução asséptica.
- Aperte a pele com uma pinça no site meio / direita do dorso e usar tesoura curva para fazer uma incisão em torno de cerca de 1 x 0.6 cm.
- Se ocorrer sangramento, em seguida, limpar a ferida com um cotonete estéril.
- Avaliar o tamanho da incisão e corta um transplante do tamanho estimado a partir da cauda para a pele usando o bisturi.
- Apare os cantos para arredondar o transplante.
- Carregue o transplante no bisturi, o excesso de seca de HBSS em um cotonete estéril e colocá-lo na cama enxerto do mouse destinatário.
- Evitar a sobreposição de doador e pele de acolhimento e aplicar adesivo de tecido na zona de contato com exclusividade.
- Aplicar um emplastro sem vincos ao redor da cintura do mouse.
- Aplique o adesivo curativo não-elástico para fixar o gesso para o mouse (três milímetros deslocado).
- Inciso com a tesoura cerca de 3 mm no site ventral superior do curativo. Nota: Isto é para evitar trapping dos dentes do rato durante a fase de recuperação.
- Remova a boca-máscara anestésica e manter os ratos transplantados com a almofada de aquecimento até acordado.
- Retornar ratinhos transplantados para as suas gaiolas apenas quando totalmente recuperado e avaliar a sua mobilidade para assegurar que a ligadura não seja demasiado apertado.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com etanol 70%, antes de prosseguir com a próxima cirurgia.
4. Cuidados pós-operatórios
- Adicionar contendo paracetamol xarope para a água de beber (4 mg / ml), e administrá-lo por 7 dias.
- Retorno do mouse para a sala de animais, uma vez que se recuperou.
- Acompanhar de perto os ratos para sinais clínicos, incluindo depressão ou outras alterações comportamentais (comer ou imobilidade), a aparência anormal (falta de higiene) ou postura (pilo-ereção ou postura arqueada) para o tempo o curativo está em vigor (1 semana).
5. Remoção Bandage (6-7 dias pós-transplante)
- Anesthetize ratos por inalação de uma solução Isofluorano 3% em uma caixa de indução transparente (ver acima).
- Corte curativo e gesso com uma tesoura da artéria e, cuidadosamente, remova-os. Nota: evitar o estiramento do local do transplante.
- Monitorar os ratos transplantados para os sinais clínicos (ver 4.3) e marcar para a rejeição de enxertos de pele (Tabela 1). Nota: O sistema de pontuação do enxerto aproveita as diferentes texturas de cabelo na cauda-pele em comparação com o dorsal pele. A aparência do transplante e sua rejeição é classificado em 3 classes. Pele alogênico (MHC II incompatíveis, por exemplo, IA BM12) enxertos de camundongos C57BL / 6 imunocompetentes geralmente são rejeitados dentro de 12-15 dias pós transplante (próprios dados e 15-20).
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Representative Results
Numa primeira abordagem C57BL / 6 foram transplantadas com IA allografts BM12 e IA b syngrafts. Após a remoção curativo, enxertos sinais manifestos de cicatrização de feridas, sem encerramento da zona de contato em camundongos C57BL / 6 (Figura 1A). Após a remoção do penso, a inflamação mediada por células T CD4 +, conduziu ao aparecimento de áreas necróticas (manchas vermelhas) e rejeição de aloenxertos IA BM12 em ratinhos C57BL / 6 no espaço de 13 dias após o transplante (Figura 1B-C, símbolos a cheio), enquanto syngrafts eram toleradas por até 100 dias (Figura 1B-C, símbolos abertos). Estes dados mostram a progressão da rejeição aguda de enxertos IA BM12 imunocompetentes em ratinhos C57BL / 6.
Vários estudos demonstram que a rejeição do MHC classe II incompatíveis tail-pele depende da presença de células T CD4 + alogênicos (Rev. em 12). De facto, células T deficiente CD3ε - / - </ sup> ratos e T e células B RAG2 deficiente - / - ratos mostraram a cicatrização completa e tolerado o IA BM12 enxertos até 100 dias (Figura 2), enquanto que camundongos C57BL / 6 rejeitado enxertos prazo de 13 dias (Figura 2) . A aceitação de IA BM12 incompatíveis tail-pele permite o estudo de células T CD4 + alogênicos e suas funções efetoras em um modelo de camundongo sem patologias de doenças graves.
Para quebrar a tolerância estabelecida em CD3ε - / - e RAG2 - / - ratos, as células T CD4 + foram adotivamente transferidos: 2 x 10 4 policlonais C57BL / 6 células T CD4 + foram suficientes para induzir a rejeição de enxertos IA BM12 prazo de 14 dias ( dados não mostrados). Transferência de 50.000 e 100.000 C57BL / 6 células T CD4 + não acelerar o processo de rejeição de enxertos em CD3ε - / - e RAG2 - / - murganhos. Estes dados sublinham o papel de allogencélulas do modelo de rejeição aguda do enxerto de pele eic T CD4 +.
A vantagem deste modelo de transplante de pele da cauda-se que a análise funcional das células T CD4 + pode ser facilmente feito por transferência adoptiva de células específicas de antigénio de células CD4 + T. O ratinho transgénico ABM 9 é considerada uma ferramenta ideal para delinear a activação e o comportamento fenotípica da população sem a influência de células T CD4 + não-específicos. A transferência de 2 x 10 4 células ABM específicas de antigénio é suficiente para induzir a rejeição de enxertos IA BM12 em RAG2 - / - murganhos prazo de 13 dias (Figura 3A-B). Além disso, as células de ABM são fáceis de isolar e podem ser rastreados utilizando a expressão das cadeias Vα2Vβ8-TCR (Figura 3C). Proliferação de células ABM e produção de citocinas em BM12 IA transplantados RAG2 - / - murganhos foram investigados. Células ABM proliferaram extensipectivamente, como determinado por ensaio de diluição eFluor670 (Figura 3D) e até 30% das células de ABM produziram IFN-γ sobre-estimulação de PMA (Figura 3E).
Tomados em conjunto, estes dados mostram que um número relativamente pequeno de células T CD4 + alogeneicas são necessárias para induzir a rejeição de enxertos de pele IA BM12, tornando este modelo ideal para a análise de células T alogénicos com patologia mínima grave.
Figura 1. Transplante de camundongos com alogênico e singênico tail-pele. (A) camundongos C57BL / 6 foram transplantadas com alogênico (IA BM12) e singênico (IA b) tail-pele (n = 5 por grupo). Pictures ilustrar allografts (esquerda) e syngrafts (direita) após a remoção curativo no dia 7. (B) Pontuação e (C)sobrevivência dos enxertos de pele a partir do dia 7 até o dia da rejeição ou monitoramento final (dia 100). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Aloenxertos são tolerados na ausência de células T em ratinhos Sobrevivência de RAG2 -. / - Enxertos de pele de rato transplantadas em ratinhos C57BL / 6, CD3ε - - IA BM12 / - e - / - RAG2 ratinhos (n = 4-6 por grupo) e ilustração de enxertos rejeitados e aceitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3 células T CD4 + específicos anti-IA BM12 proliferar e produzir IFN-γ durante a rejeição do enxerto (A) Pontuação e (B) sobrevivência de IA BM12 enxertos de pele da cauda em RAG2 -. / - Ratos (n = 5) adotivamente transferido com 2 x 10 4 células ABM específicas para o antigénio. (C) Vα2Vβ8-coloração de células de ABM isoladas de nódulos linfáticos de ratinhos transgénicos ABM (D). diluição eFluor670 de proliferação de células ABM e (E) a produção de IFN-γ de PMA estimulado células ABM isoladas de linfonodos do IA BM12 pele enxertada RAG2 - / -. ratos no dia 9 após a transferência adotiva de células ABM (n = 5 ratos) Por favor, clique aqui paraver uma versão maior desta figura.
| Enxerto Pontuação | Descrição |
| 3 + | Não há áreas vermelhas ea presença de uma listra preta brilhante |
| 2 + | Aparecimento de áreas vermelhas pequenas, a perda de uma faixa preta brilhante e secura |
| 1 + | Aparecimento de grandes áreas vermelhas, sem tarja preta e retração |
| 0 | Rejeição do enxerto definido como 80% de necrose |
Tabela 1. Sistema de pontuação de enxerto. A aparência do transplante e a rejeição é categorized em 3 graus, aproveitando as diferentes texturas de cabelo na cauda e dorso-pele.
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Discussion
O transplante de pele é um método amplamente utilizado para estudar a rejeição e de tolerância em células T dependentes. Desde foi criado o modelo de transplante de pele, várias adaptações e mudanças foram aplicadas. No procedimento descrito, IA BM12 transplante de cauda-de pele é realizada usando gás anestésico (isoflurano). O uso de anestesia gás diminui o tempo de execução e recuperação de ratos, o que diminui o stress em ratos transplantados. O procedimento utiliza tecido adesivo para fixar o tail-pele, que tende a enrolar mais do ouvido ou tecido dorsal pele. Além disso, é importante para achatar o rabo-de pele antes de cortar e aparar as arestas que isso reduz ondulação e melhora o posicionamento da cauda da pele no local de excisão dorsal.
Para avaliar a rejeição de enxertos ou a aceitação é necessário para preparar o rabo-de pele, com a faixa preto (por exemplo, em ratinhos C57BL / 6) no meio do enxerto para facilitar a marcação de transplants com base nas diferenças de textura de cabelo.
A mutação da molécula MHC Classe II BM12 IA ativa exclusivamente células T CD4 + em imunocompetentes e camundongos imunodeficientes (do mesmo fundo genético). Por um lado, isto facilita a interpretação dos resultados, mas, por outro lado, limita o método de células T CD4 + estudos. Para estender a ativação das células T a outros subconjuntos de células T, cauda-pele de outros doadores, por exemplo, mesmo fundo genético incluindo ratos IA bm1 e diferentes antecedentes genéticos, incluindo Balb / c ou DBA ratos podem ser transplantados.
Nos estudos de rejeição aguda, nos beneficiamos de a mutação que ocorre naturalmente na classe II MHC sulco ea ativação de células T CD4 + alogênicos para estudar a rejeição de órgãos em ratos. Camundongos C57BL / 6 rejeitado IA BM12 enxertos de pele em até 14 dias após o transplante, o que é consistente com a maioria dos estudos using IA BM12 pele transplantes 15-20. Além disso, o modelo de rejeição aguda é amplamente utilizado para testar o potencial alogénico de células T CD4 + a partir de ratinhos do gene deficiente. De facto, o IFN-γ - / - murganhos mostraram retardada IA BM12 rejeição do enxerto de pele (dados não publicados e 16). Bloqueio de IFN-γ por administração de anticorpo de bloqueio semelhante retardada rejeição 15,17,18. Isto indica um papel chave de IFN-γ em iniciar a expressão de MHC classe II em Ag apresentadoras e células endoteliais (rev. em 12). Desde camundongos perforina deficiente não atrasar IA BM12 rejeição de enxerto de pele 21, o papel das citocinas parece ser mais importante para a rejeição. Na verdade, a administração de IL-6 resultou em sobrevivência prolongada do enxerto, possivelmente por regulação negativa de IFN-γ-produção 15. Além disso, os neutrófilos parecem desempenhar um papel importante na rejeição de IA BM12 enxertos de pele em ratinhos IL-4-19 deficiente BM12 rejeição do enxerto em camundongos 20. A administração de anti-CD3 atrasos anticorpos IA BM12 rejeição de enxerto de pele em ratos imunocompetentes (dados não publicados). Além disso, mostramos que a célula T deficiente CD3ε - / - e RAG2 - / - ratos aceitar os enxertos de pele alogênicos para até 100 dias. Tolerância nesses camundongos pode ser facilmente revertido / quebrado pela transferência adotiva de células T CD4 + de imunocompetentes camundongos C57BL / 6. Transferência de 2 x 10 4 células T CD4 + ou células ABM específicas de antigénio é suficiente para induzir IA BM12 rejeição do enxerto por volta do dia 14. Células ABM Vα2Vβ8-positivos isolados mostrou extensa proliferação e produção de IFN-γ nos gânglios linfáticos antes rejeição, contudo rejeição era dependente I-Abm12 expressaíon no enxerto de pele.
Em resumo, este modelo de rato é uma excelente maneira de estudar a ativação de números baixos de células T durante a rejeição ou tolerância. O transplante de pele da cauda-é fácil de realizar e pode ser aplicado a ratinhos com diferentes antecedentes genéticos para estudar as respostas de células T alogénicas sem incorrer um efeito fisiológico grave. Além disso, este modelo é ideal para intervenções com substâncias químicas e biológicas que induzem ou quebrar tolerância enxerto de pele.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
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