Introduction
Transplantasjon av faste organer som hud, hjerte og nyrer er nå en standard prosedyre i medisinsk praksis over hele verden en. Vellykket transplanterte organer kan forkastes ved aktivering av mottakerens immunsystem, som gjenkjenner de store histocompatibility antigenene til donoren. Derfor transplanterte pasienter trenger behandling med immundempende medisiner to. Allogen transplantasjon hud hos mus ble etablert av Medawar og medarbeidere i 1955, og var nyttig for å identifisere de målrettede molekyler senere beskrevet som store histocompatibility kompleks (MHC) klasse I og II. Siden den gang har hudtransplantasjon modellen vært kontinuerlig modifisert og tilpasset for å studere rollen til T celle undergrupper og relevansen av kjemiske og biologiske intervensjon i å undertrykke pode avvisning 2-4. Hud fra øret, og stammen er mer vanskelig å fremstille og er mer utsatt for hypoksi og nekrose enn hale-skin 5; Mentransplantasjon prosedyren er lik. I tillegg til overvåkning av tail-skin transplantasjoner er lett på grunn av den karakteristiske konsistens av hår på huden.
Denne artikkelen gir en detaljert fremgangsmåte for MHC klasse II mismatch tail-hudtransplantasjon som gjør det mulig for studier av ulike aspekter av CD4 + T-celle-mediert allograft avvisning og toleranse hos mus. Den naturlige tre-punkt-mutasjon i MHC klasse II molekyl IA b (kalt IA bm12) 6-9 er tilstrekkelig til å indusere hud-avvisning av allografter i C57BL / 6 mus 8.. IA bm12 molekyl aktiverer CD4 + T-celler med forskjellige αβ-T-celle-reseptoren (TCR) kjeder fra C57BL / 6 mus, hvorav Vα2Vβ8-TCR-spesifikke T-celler ble identifisert for å generere en TCR-transgene mus 10. I adoptive transfer of Vα2Vβ8-TCR-spesifikke T-celler har blitt brukt for å etablere en avvisning modell i immunodeficient C57BL / 6 Rag2 - / - mus transplantert med IA bm12 hud.
Genetiske forskjeller mellom giver og mottaker påvirke utfallet av transplantasjon aksept og avvisning. Det finnes forskjellige typer transplantasjoner: autografts er transplantasjoner fra mottakeren enkelte selv; syngrafts og allografts er transplantasjoner fra genetisk identiske og genetisk ubeslektede individer hhv. Aksept av forskjellige allogene organtransplantasjoner har blitt demonstrert av kjemiske og biologiske intervensjon hos pasienter og musemodeller 11,3,4. I en grunnleggende tilnærming, anti-CD3 antistoff-behandlet C57BL / 6 mus viste forlenget overlevelse av IA bm12 tail-hud (upubliserte data). Nedbryting av CD4 + og CD8 + T celler før transplantasjon i mottaker mus resulterte i aksept av MHC klasse I og II umake grafts (rev. i 12). Interessant, avvisning av skin grafts avhenger av nærværet av CD4 + 12). I denne modellen, kan målrette spesifikke interaksjoner mellom ulike immunceller ved å blokkere kostimulerende molekyler med antistoffer eller undertrykkelse med regulatoriske T-celler indusere toleranse (upubliserte data). Faktisk, blokkerer både CD40 og CD28 førte til langsiktig hud allograft toleranse 13,14.
Tail-hudtransplantasjon er lett å utføre og lett å overvåke forhold til transplantering av andre organer. I tillegg, hale-skin transplantasjoner er lett å tilberede og er mindre utsatt for ischemi enn andre hudvevet. I motsetning til injiserte bedøvelsesmidler, bruk av anestesigass (isofluorane) under transplantasjon forkorter både fremgangsmåten og mottaker restitusjonstid. Curling på halen-hud transplantasjon, noe som kan føre til ufullstendig sårheling og pode avvisning, forhindres ved bruk av vev lim. Videre IA bm12 tail-hudtransplantasjon modell aktiverer utelukkende CD4 Denne protokollen beskriver en pålitelig, reproduserbar og enkelt overvåkes mus modell som gjør det mulig for kjemisk og biologisk intervensjon. Modellen er beregnet for å undersøke avvisning og toleranse induksjon av hale hud transplantasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne videoen publikasjonen og protokoll, ble alle prosedyrer dyre gjennomført i henhold til dyr protokollen godkjent av Cantonal Authority Basel-Stadt, Sveits. Utfør alle prosedyrer i sterile forhold der det er mulig.
En. Utarbeidelse av kirurgi
- Autoklaver alle kirurgiske instrumenter og gasbind før bruk.
- Varm varm pad og organisere kirurgiske instrumenter på bordet (Table of materialer / metoder).
- Åpne finger stripe bandasjer. Påfør vaselin på såret pad med en bomullspinne (sørg gasbind er helt dekket).
- Veie mus og administrere analgesi Buprenorfin 0,05 mg / kg kroppsvekt. Merk: Dette vil gi analgesi umiddelbart etter transplantasjon.
2. Preparering av Tail-skin for Transplantasjon
- Avlive donor mus (f.eks, IA bm12) per CO 2 kvelning og disinfect halene med desinfeksjonsløsning før excision.
- Plasser halen med svart stripe ned på en ren plastbrett og skjær den på langs hele den midterste linjen, noe som gjør en overfladisk snitt involverer bare huden lag.
- Trekk av skinnet fra halen ved hjelp av gripetang.
- Sett på bak-huden i en 10 cm celle dyrkningsskål fylt med 10 ml HBSS.
Tre. Kirurgisk prosedyre
- Anesthetize mottaker mus (f.eks, C57BL / 6) ved inhalasjon av en 3% isofluorane løsning i en gjennomsiktig induksjon boks. Merk: Det tar 3-5 minutter for musen for å nå kirurgisk plan anestesi. Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Plasser musen på den varme pad og påfør 1,5% isofluorane via en munn maske og esler hvert dyr refleks ved tå knipe.
- Barbere ryggside av mottaker mus (f.eks C57BL / 6) og fjerne forurensende hårene ved hjelp av en tørr kompress swab.
- Desinfiser barbert transplantasjon nettsted med aseptisk løsning.
- Klyp huden med tang i midten / høyre fra dorsum og bruke buet saks for å lage en rund snitt på ca 1 x 0,6 cm.
- Hvis blødningen oppstår, deretter rense såret med en steril bomullspinne.
- Evaluere størrelsen på snittet og kuttet en transplantasjon av beregnet størrelse fra halen-hud ved hjelp av skalpell.
- Trim hjørner å runde transplantasjon.
- Laste transplantasjon på skalpell, tørr overkant av HBSS på en steril bomullsdott og plassere den i pode seng av mottakeren mus.
- Unngå overlapping av donor og vert huden og påfør vev lim på kontaktsonen eksklusivt.
- Påfør et plaster uten bretter rundt muse midjen.
- Påfør lim ikke-elastisk bandasje for å fikse gips til musen (3 mm forskjøvet).
- Incise med saksen ca 3 mm i øvre ventral stedet av bandasje. Merk: Dette er for å unngå trapping av musens tenner under restitusjonsfasen.
- Fjern bedøvelse-munn-maske og holde de transplanterte mus på varmeputen før våken.
- Returner transplanterte mus til burene kun når den er fullt restituert og vurdere deres mobilitet for å sikre at bandasjen ikke er for stramt.
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter med 70% etanol før du fortsetter med neste operasjon.
4. Postoperativ Care
- Legg paracetamol-holdig sirup til vanndrikke (4 mg / ml) og administrere det i 7 dager.
- Returner musen til dyrerom når den har kommet seg.
- Følge nøye med mus for kliniske tegn inkludert depresjon eller andre atferdsendringer (spise eller immobilitet), unormalt utseende (mangel på grooming) eller holdning (Pilo-ereksjon eller krum holdning) for tiden bandasjen er på plass (en uke).
5. Bandasje fjerning (6-7 dager etter transplantasjon)
- Anesthetize mus ved inhalering av en 3% isofluorane løsning i en gjennomsiktig boks induksjon (se ovenfor).
- Skjær bandasje og plaster med arterie saks og forsiktig fjerne dem. Merk: unngå strekking av transplantasjon nettstedet.
- Overvåk transplanterte mus for kliniske tegn (se 4.3) og scorer for avvisning av hud grafts (Tabell 1). Merk: graft score system utnytter de forskjellige hår teksturer på halen-hud i forhold til rygg-hud. Utseendet på transplantasjon og dens avvisning er kategorisert i tre karakterer. Allogen hud (MHC II feilaktige, f.eks, IA bm12) grafts av C57BL / 6 immunokompetente mus er vanligvis avvist innen 12-15 dager etter transplantasjonen (egne data og 15-20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en første tilnærming C57BL / 6 mus ble transplantert med IA bm12 allografts og IA b syngrafts. Etter bandasje fjerning, grafts manifest tegn på sårtilheling uten nedleggelse av kontaktsonen i C57BL / 6 mus (Figur 1a). Etter bandasje fjerning, CD4 + T-celle-mediert inflammasjon førte til utseendet på nekrotiske områder (røde flekker) og avvisning av IA bm12 allografts i C57BL / 6 mus innen 13 dager etter transplantasjon (Figur 1B-C, fylt symboler), mens syngrafts ble tolerert i inntil 100 dager (Figur 1B-C, åpne symboler). Disse dataene viser progresjon av akutt avvisning av IA bm12 grafts i immunkompetente C57BL / 6 mus.
En rekke studier viser at avvisning av MHC klasse II umake tail-skin er avhengig av tilstedeværelsen av allogene CD4 + T-celler (Rev. in 12). Faktisk, T cell mangel CD3ε - / - </ sup> mus og T-og B-celler mangel Rag2 - / - mus viste komplett sårtilheling og tolerert IA bm12 grafts opp til 100 dager (figur 2), mens C57BL / 6 mus avvist grafts innen 13 dager (figur 2) . Aksepten av IA bm12 feilaktige hale-hud åpner for studiet av allogene CD4 + T celler og deres effektorfunksjoner i en musemodell uten alvorlige sykdoms patologi.
For å bryte den etablerte toleranse i CD3ε - / - og Rag2 - / - mus, CD4 + T celler ble adoptively overført: 2 x 10 4 polyklonale C57BL / 6 CD4 + T celler var tilstrekkelig til å indusere avvisning av IA bm12 grafts innen 14 dager ( data ikke vist). Overføring av 50 000 og 100 000 C57BL / 6 CD4 + T celler ikke akselerere pode avvisning prosessen i CD3ε - / - og Rag2 - / - mus. Disse data understreker betydningen av allogenEIC CD4 + T celler i den akutte hud pode avvisning modell.
Fordelen med dette hale hudtransplantasjon modellen er at funksjonell analyse av CD4 + T-celler kan enkelt gjøres ved adoptiv overføring av antigen-spesifikke CD4 + T-celler. Den transgene musen ABM 9 er ansett som et enkelt verktøy for å avgrense aktivering og den fenotypiske opptreden av populasjonen uten påvirkning av ikke-spesifikke CD4 + T-celler. Overføringen av 2 x 10 4 antigenspesifikke ABM-celler var tilstrekkelig til å indusere avvisning av IA bm12 grafts i Rag2 - / - mus i løpet av 13 dager (figur 3A-B). I tillegg ABM celler er lette å isolere og kan spores ved hjelp av ekspresjon av de Vα2Vβ8 TCR-kjeder (figur 3C). ABM celleproliferasjon og produksjon av cytokiner i IA bm12 transplantert Rag2 - / - mus ble undersøkt. ABM-celler proliferated extensisvis bestemt ved eFluor670 fortynningsanalyse (fig. 3D) og opp til 30% av ABM-celler produsert IFN-γ ved PMA-stimulering (figur 3E).
Samlet utgjør disse dataene viser at relativt få allogene CD4 + T celler er nødvendig for å indusere avvisning av IA bm12 hud grafts, rendering denne modellen ideell for analyse av allogene T-celler med minimal alvorlig patologi.
Figur 1. Transplantasjon av mus med allogen og syngene hale-hud. (A) C57BL / 6 mus ble transplantert med allogen (IA bm12) og syngene (IA b) tail-hud (n = 5 per gruppe). Bildene illustrerer allografts (til venstre) og syngrafts (til høyre) etter bandasje fjerning på dag 7. (B) Scoring og (C)overlevelse av huden grafts fra dag 7 til dag for avvisning eller endelig overvåking (dag 100). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 2 allografter tolereres i fravær av T-celler i mus Survival of Rag2 -. / - IA bm12 - mouse skin grafts transplantert i C57BL / 6, CD3ε - / - og Rag2 - / - mus (n = 4-6 per gruppe) og illustrasjon av avviste og akseptert grafts. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 3 Anti-IA bm12 spesifikke CD4 + T celler sprer og produsere IFN-γ under pode avvisning (A) Scoring og (B) overlevelse av IA bm12 tail-hud grafts i Rag2 -. / - Muse (n = 5) adoptively overført med 2 x 10 4 antigenspesifikke ABM celler. (C) Vα2Vβ8-farging av ABM-celler isolert fra lymfeknuter fra transgene mus ABM. (D) eFluor670 fortynning av prolifererende celler ABM og (E) IFN-γ produksjon av PMA- stimulert ABM-celler isolert fra lymfeknuter av IA bm12 hud podet Rag2 - / -. muse på dag 9 etter adoptiv ABM celle overføring (n = 5 mus) Klikk her for åse en større versjon av dette tallet.
| Graft Score | Beskrivelse |
| 3 + | Ingen røde områder og tilstedeværelse av en skinnende svart stripe |
| 2 + | Utseende av små røde områder, tap av en skinnende svart stripe og tørrhet |
| 1 + | Utseende av store røde områder, ingen svart stripe og krymping |
| 0 | Pode avvisning definert som 80% nekrose |
Tabell 1. Graft score system. Utseendet på transplantasjon og sin avvisning er serveringsstedgorized i tre karakterer, drar nytte av de ulike hår teksturer på halen og rygg-hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skin transplantasjon er en mye brukt metode for å studere avvisning og toleranse avhengig av T-celler. Siden huden transplantasjon modellen ble etablert, har flere tilpasninger og endringer blitt anvendt. I den beskrevne fremgangsmåten, er IA bm12 tail-hud transplantasjon utføres ved hjelp av anestesigass (isofluorane). Bruken av gassanestesi reduserer tiden for utførelse og mus gjenvinning, noe som reduserer belastningen på transplanterte mus. Prosedyren syssels vev lim til å feste hale hud, som har en tendens til å krølle seg mer enn øret eller dorsal-hud vev. Videre er det viktig å flate-tail huden før trykking på kantene, da dette reduserer krølling og forbedrer posisjonering av tail-skin på dorsal excision side.
For å vurdere transplantat avvisning eller aksept det er nødvendig å fremstille bak-skin med den sorte stripe (for eksempel i C57BL / 6 mus) i midten av transplantatet for å lette scoring av transplants basert på håret tekstur forskjeller.
Mutasjonen av MHC klasse II IA bm12 molekyl utelukkende aktiverer CD4 + T-celler i immunkompetente og immundefekte mus (i samme genetiske bakgrunn). På den ene siden dette letter tolkningen av resultatene, men på den annen side det begrenser metoden til CD4 + T-celler studier. For å forlenge T-celleaktivering til andre T celle undergrupper, hale-hud fra andre givere, for eksempel, samme genetiske bakgrunn blant annet IA BM1 mus og annen genetisk bakgrunn inkludert Balb / c eller DBA mus kan transplanteres.
I den akutte avvisning studiene har vi ha nytte av den naturlig forekommende mutasjon i MHC klasse II-sporet og aktivering av allogene CD4 + T-celler for å studere organrejeksjon i mus. C57BL / 6 mus avvist IA bm12 hud grafts innen 14 dager etter transplantasjon, som er konsistent med de fleste studier USIng IA bm12 hud transplantasjoner 15-20. I tillegg til akutt avvisning modellen er mye brukt til å teste allogen potensialet i CD4 + T celler fra gen-mangelfull mus. Faktisk, IFN-γ - / - mus viste en forsinket IA bm12 hud pode avvisning (upubliserte data og 16). Blokkering IFN-γ ved administrasjon av blokkere antistoff tilsvarende forsinket avvisning 15,17,18. Dette indikerer en nøkkelrolle for IFN-γ i å initiere MHC klasse II uttrykk på Ag-presentasjoner og endotelceller (rev. i 12). Siden perforin-mutante mus ikke utsette IA bm12 hud pode avvisning 21, synes rollen av cytokiner å være viktigere for avvisning. Faktisk, IL-6 administrasjon førte til langvarig transplantatoverlevelse, muligens ved downregulating IFN-γ-produksjon 15. I tillegg nøytrofile synes å spille en viktig rolle i avvisningen av IA bm12 hud grafts i IL-4-mangelfull mus 19 bm12 pode avvisning i mus 20. Administrasjon av anti-CD3 antistoff forsinkelser IA bm12 hud pode avvisning hos immun mus (upubliserte data). Videre viste vi at T celle mangel CD3ε - / - og Rag2 - / - mus godta allogene hud grafts for opp til 100 dager. Toleranse i disse musene kan enkelt tilbakestilles / brutt av adoptiv overføring av CD4 + T celler fra immunkompetente C57BL / 6 mus. Overføring av 2 x 10 4 CD4 + T celler eller antigen-spesifikke ABM-celler er tilstrekkelig til å indusere IA bm12 pode avvisning rundt dag 14. Isolerte Vα2Vβ8-positive ABM-celler viste omfattende spredning og IFN-γ produksjonen i lymfeknutene før avvisning, men avvisning var avhengig av I-Abm12 expression i hudtransplantat.
Oppsummert er dette mus modell en utmerket måte å studere aktivering av lav T celle tall i løpet av avvisning eller toleranse. Halen-hudtransplantasjon er enkel å utføre, og kan bli anvendt på mus med forskjellige genetiske bakgrunner å studere de allogene responser av T-celler uten at det oppstår en alvorlig fysiologisk effekt. Dessuten er denne modellen ideell for intervensjoner med kjemiske og biologiske stoffer som induserer eller ødelegge huden pode toleranse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
- Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
- Halleck, F., et al.
- Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
- Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
- McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
- Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non--bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
- Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
- Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
- Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
- Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
- Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
- Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
- Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
- Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
- Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
- Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
- Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
- Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
- Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).
