Introduction
Transplantation af faste organer såsom hud, hjerte og nyrer er nu en standard procedure i medicinsk praksis på verdensplan 1. Succesfuld transplanterede organer kan afvises ved aktivering af modtagerens immunsystem, der anerkender de store histokompatibilitetsantigener af donoren. Derfor transplanterede patienter har brug for behandling med immunosuppressive lægemidler 2. Allogen hud-transplantation i mus blev etableret af Medawar og kolleger i 1955 og var nyttige til at identificere de målrettede molekyler senere beskrevet som hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og II. Siden da har hudtransplantation model løbende blevet ændret og tilpasset til at studere den rolle, T-celle delmængder, og relevansen af kemiske og biologiske indgreb i at undertrykke afstødning 2-4. Hud fra øret og stammen er vanskeligere at forberede og er mere modtagelige for hypoxi og nekrose end hale-hud 5; imidlertidtransplantation procedure ligner. Desuden er let på grund af den karakteristiske hår tekstur af huden overvågning af hale-hudtransplantater.
Denne artikel giver en detaljeret procedure for MHC klasse II mismatch hale-hud transplantation, der giver mulighed for studiet af forskellige aspekter af CD4 + T-celle-medieret allotransplantatafvisning og tolerance i mus. Den naturlige trepunktsophæng mutation i MHC-klasse II-molekyle IA b (benævnt IA bm12) 6-9 er tilstrækkeligt til at inducere afstødning af hud-allotransplantater i C57BL / 6 mus 8. IA bm12 molekyle aktiverer CD4 +-T-celler med forskellige αβ-T-cellereceptoren (TCR) kæder fra C57BL / 6 mus, blandt hvilke blev identificeret Vα2Vβ8-TcR-specifikke T-celler for at generere en TcR-transgen mus 10. Adoptiv overførsel af Vα2Vβ8-TCR-specifikke T-celler er blevet brugt til at etablere en afvisning model i immunoinsufficiente C57BL / 6 Rag2 - / - mus transplanteret med IA bm12 hud.
Genetiske forskelle mellem donor og modtager påvirke udfaldet af transplantation accept og afvisning. Der findes forskellige typer af transplantationer: autotransplantater er transplantationer fra recipientindividets selv; syngrafts og allotransplantater er transplantationer fra genetisk identiske og genetisk uafhængige individer hhv. Accept af forskellige allogene organtransplantationer er blevet påvist ved kemiske og biologiske indgreb i patienter og musemodeller 11,3,4. I en grundlæggende fremgangsmåde, anti-CD3-antistof-behandlede C57BL / 6 mus viste forlænget overlevelse IA bm12 hale-hud (upublicerede data). Udtømning af CD4 + og CD8 + T-celler inden transplantation i recipientmus resulterede i accept af MHC klasse I-og II uoverensstemmende transplantater (Rev. i 12). Interessant afvisning af hudtransplantater afhænger af tilstedeværelsen af CD4 + 12). I denne model kan målrette specifikke interaktioner mellem forskellige immunceller ved at blokere samstimulerende molekyler med antistoffer eller undertrykkelse med regulatoriske T-celler inducere tolerance (upublicerede data). Faktisk blokerer både CD40 og CD28 førte til langsigtet hud allotransplantat tolerance 13,14.
Tail-hudtransplantation er let at udføre og let at kontrollere i forhold til transplantation af andre organer. Desuden er halen-hudtransplantater let at tilberede og er mindre modtagelige for iskæmi end andre hud væv. I modsætning til injicerede anæstetika, anvendelse af narkosegas (isofluoran) under transplantation forkorter både proceduren og modtageren restitutionstid. Curling af halen-hudtransplantation, hvilket kan føre til ufuldstændig sårheling og transplantatafstødning forhindres ved anvendelse af væv klæbemiddel. Desuden IA bm12 hale-hud transplantation model udelukkende aktiverer CD4 Denne protokol beskriver en pålidelig, reproducerbar og nemt overvåges musemodel, der giver mulighed for kemisk og biologisk indgriben. Modellen er beregnet til at undersøge afvisning og tolerance induktion af hale-hudtransplantater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne video publikation og protokol blev alle dyreforsøg gennemføres i overensstemmelse til dyret protokol godkendt af Cantonal Authority Basel-Stadt, Schweiz. Udfør alle procedurer i sterile forhold er muligt.
1.. Preparation of Surgery
- Autoklavér alle kirurgiske instrumenter og gaze før brug.
- Varm varm pad og organisere kirurgiske instrumenter på bordet (Table of Materialer / Metoder).
- Åbn finger striben bandager. Påfør vaseline på såret pad med en vatpind (sørg for gaze er helt dækket).
- Mus vejes og administrere analgesi Buprenorphin 0,05 mg / kg legemsvægt. Bemærk: dette vil give analgesi umiddelbart efter transplantation.
2.. Forberedelse af Tail-hud til transplantation
- Afliv donormus (f.eks IA bm12) pr CO 2 kvælning og disinfect haler med desinfektionsmidlet før excision.
- Placer hale med den sorte stribe ned på en ren plast bord og klippe den på langs hele den midterste linje, hvilket gør en overfladisk snit kun involverer huden lag.
- Træk skindet fra halen ved hjælp gribende pincet.
- Sæt halen-hud i en 10 cm celledyrkningsskål fyldt med 10 ml HBSS.
3.. Kirurgisk procedure
- Bedøver recipientmus (f.eks C57BL / 6) ved inhalation af en 3% isofluoran opløsning i en gennemsigtig induktion kassen. Bemærk: Det tager 3-5 min til musen for at nå kirurgisk plan anæstesi. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- Placer musen på den varme pad og anvende 1,5% isofluoran via mund maske og æsler hvert dyr refleks ved tå klemme.
- Barbere ryg stedet for de modtagende mus (f.eks C57BL / 6) og fjerne forurenende hår med en tør gaze swAB.
- Desinficer barberet transplantation site med aseptisk løsning.
- Klem huden med en pincet i midten / højre side af dorsum og bruge krum saks til at gøre en runde snit på omkring 1 x 0,6 cm.
- Hvis der opstår blødning, derefter rense såret med en steril vatpind.
- Vurdere størrelsen af snittet og skære en transplantation af den anslåede størrelse fra halen-huden ved hjælp af skalpellen.
- Trim hjørner for at afrunde transplantation.
- Indlæse transplantation på skalpel tørre overskydende HBSS på en steril vatpind og placere den i transplantatlejet modtagerens musen.
- Undgå overlapning af donor og vært hud og anvende væv lim på kontakt zone udelukkende.
- Påfør et plaster uden folder omkring muse taljen.
- Påfør lim uelastisk bandage til at fastsætte gips til musen (3 mm forskudt).
- Incise med saksen omkring 3 mm i den øverste ventrale side af bandagen. Bemærk: Dette er for at undgå trKortlægning af musens tænder i opsvingsfasen.
- Fjern bedøvelsesmiddel-mund-maske og holde de transplanterede mus på varmepuden indtil vågen.
- Retur transplanterede mus til deres bure kun når den er fuldt tilbagebetalt, og vurdere deres mobilitet for at sikre, at bandagen ikke er for stramt.
- Sterilisere alle kirurgiske instrumenter med 70% ethanol før du fortsætter med næste operation.
4.. Postoperativ pleje
- Tilføj paracetamol-holdige sirup drikkevandet (4 mg / ml) og administrere det til 7 dage.
- Retur musen til dyret plads, når den er tilbagebetalt.
- Nøje overvåge mus for kliniske tegn, herunder depression eller andre adfærdsmæssige ændringer (spise eller immobilitet), unormal udseende (manglende grooming) eller kropsholdning (hår-rejsning eller krum stilling) for den tid, bandagen er på plads (1 uge).
5.. Bandage Fjernelse (6-7 dage efter transplantation)
- Anesthetize mus ved inhalation af en 3% isofluoran opløsning i en gennemsigtig induktion kasse (se ovenfor).
- Skær bandage og gips med arterie saks og forsigtigt fjerne dem. Bemærk: undgå strækning af transplantation site.
- Overvåg transplanterede mus for kliniske tegn (se 4.3) og score for afvisning af hudtransplantation (tabel 1). Bemærk: graft scoresystem drager fordel af de forskellige hårteksturer på halen-hud i forhold til den dorsale hud. Udseendet af transplantationen og afvisningen er kategoriseret i 3 grader. Allogen hud (MHC II forkerte, f.eks IA bm12) transplantater af C57BL / 6 immunkompetente mus normalt afvises inden for 12-15 dage efter transplantationen (egne data og 15-20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en første tilgang C57BL / 6 mus blev transplanteret med IA bm12 allotransplantater og IA b syngrafts. Efter bandage fjernelse grafts åbenbare tegn på sårheling uden lukning af kontakt zone i C57BL / 6 mus (figur 1a). Efter bandage fjernelse, CD4 + T-celle-medieret inflammation førte til fremkomsten af nekrotiske områder (røde pletter), og afvisning af IA bm12 allotransplantater i C57BL / 6 mus inden for 13 dage efter transplantation (Figur 1B-C, fyldt symboler), mens syngrafts blev tolereret i op til 100 dage (Figur 1B-C, åbne symboler). Disse data viser progressionen af akut afstødning af IA bm12 grafts i immunkompetente C57BL / 6 mus.
Forskellige undersøgelser viser, at afvisningen af MHC klasse II uoverensstemmende hale-hud afhænger af tilstedeværelsen af allogene CD4 + T-celler (Rev. i 12). Faktisk T-celle deficiente CD3ε - / - </ sup> mus og T-og B-celler mangelfuld Rag2 - / - mus viste komplet sårheling og tolereret IA bm12 grafts op til 100 dage (figur 2), mens C57BL / 6 mus afviste podninger indenfor 13 dage (figur 2) . Accept af IA bm12 uoverensstemmende hale hud muliggør studiet af allogene CD4 +-T-celler og deres effektorfunktioner i en musemodel uden alvorlige sygdomstilstande patologier.
For at bryde den etablerede tolerance i CD3ε - / - og Rag2 - / - mus, CD4 + T-celler blev adoptivt overført: 2 x 10 4 polyklonale C57BL / 6 CD4 + T-celler var tilstrækkelig til at fremkalde afvisning af IA bm12 grafts inden for 14 dage ( data ikke vist). Overførsel af 50.000 og 100.000 C57BL / 6 CD4 + T-celler ikke fremskynde graftafstødning proces i CD3ε - / - og Rag2 - / - mus. Disse data understreger betydningen af allogeneic CD4 + T-celler i den akutte hud afstødning model.
Fordelen ved denne hale-hudtransplantation model er, at funktionel analyse af CD4 + T-celler kan nemt gøres ved adoptiv overførsel af antigen-specifikke CD4 + T-celler. Det transgene ABM mus 9 betragtes som et ideelt værktøj til at afgrænse aktivering og fænotypiske adfærd hos befolkningen, uden indflydelse af ikke-specifikke CD4 + T-celler. Overførslen af 2 x 10 4 antigen-specifikke ABM-celler var tilstrækkelig til at fremkalde afvisning af IA bm12 grafts i Rag2 - / - mus indenfor 13 dage (figur 3A-B). Desuden er ABM-celler nemme at isolere og kan spores ved hjælp af udtryk for de Vα2Vβ8-TCR kæder (figur 3C). ABM celledeling og produktion af cytokiner i IA bm12 transplanteret Rag2 - / - mus blev undersøgt. ABM-celler florerede extensively som bestemt ved eFluor670 fortynding assay (figur 3D) og op til 30% af ABM-celler producerede IFN-γ på PMA-stimulering (figur 3E).
Tilsammen viser disse data, at relativt få allogene CD4 + T-celler er nødvendige for at fremkalde afvisning af IA bm12 hudtransplantation, gør denne model ideel til analyse af allogene T-celler med minimal alvorlig patologi.
Figur 1. Transplantation af mus med allogene og syngene hale-hud. (A) C57BL / 6 mus blev transplanteret med allogen (IA bm12) og syngene (IA b)-hale-hud (n = 5 pr gruppe). Billeder illustrere allotransplantater (venstre) og syngrafts (højre) efter bandage fjernelse på dag 7. (B) Scoring og (C)overlevelse hudtransplantater fra dag 7 til dag for afvisning eller den endelige kontrol (dag 100). Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2 Allotransplantater tolereres i fravær af T-celler i mus Overlevelse af Rag2 -. / - IA bm12 - mus hudtransplantation transplanteret i C57BL / 6, CD3ε - / - og Rag2 - / - mus (n = 4-6 per gruppe), og illustration af afviste og accepterede podninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 3. Anti-IA bm12 specifikke CD4 + T-celler prolifererer og producerer IFN-γ i afstødning (A) Scoring og (B) overlevelse IA bm12 hale-hudtransplantater i Rag2 -. / - Mus (n = 5) adoptivt overført med 2 x 10 4 antigen-specifikke ABM-celler. (C) Vα2Vβ8-farvning af ABM-celler isoleret fra lymfeknuder transgene ABM mus. (D) eFluor670 fortynding af prolifererende ABM-celler og (E) IFN-γ produktion af PMA- stimulerede ABM celler isoleret fra lymfeknuder IA bm12 hud podet Rag2 - / -. mus på dag 9 efter adoptiv ABM celleoverførsel (n = 5 mus) Klik her for atse en større version af dette tal.
| Graft Score | Beskrivelse |
| 3 + | Ingen røde områder og tilstedeværelsen af en skinnende sort stribe |
| 2 + | Udseende af små røde områder, tab af en skinnende sort stribe og tørhed |
| 1 + | Forekomsten af store røde områder, ingen sort stribe og svind |
| 0 | Afstødning defineret som 80% nekrose |
Tabel 1.. Graft score system. Udseendet af transplantationen og afvisningen er Categorized i 3 grader, drage fordel af de forskellige hår teksturer på halen-og ryg-hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hudtransplantation er en almindeligt anvendt metode til at studere afvisning og tolerance afhænger af T-celler. Da hudtransplantation model blev etableret, har flere tilpasninger og ændringer blevet anvendt. I den beskrevne procedure, er IA bm12 hale-hud transplantation udføres ved hjælp af bedøvende gas (isofluoran). Brugen af gas anæstesi reducerer tidspunktet for udførelse og mus opsving, som mindsker belastningen på transplanterede mus. Proceduren beskæftiger vævsklæbemiddel at fastsætte halen-hud, som har tendens til at krølle mere end øret eller dorsal-hud væv. Desuden er det vigtigt at flade hale-hud før opskæring og trimning kanterne, da dette reducerer curling og forbedrer positioneringen af halen-hud på ryg excision site.
For at vurdere afstødning eller accept er det nødvendigt at forberede halen-hud med den sorte stribe (fx i C57BL / 6 mus) i midten af transplantatet at lette scoring af transplants baseret på hår tekstur forskelle.
Mutationen af MHC klasse II IA bm12 molekyle udelukkende aktiverer CD4 + T-celler i immunkompetente og immunsvækkede mus (af den samme genetiske baggrund). På den ene side dette letter fortolkningen af de resultater, men på den anden side begrænser fremgangsmåde til CD4 +-T-celler studier. At udvide T-celle aktivering til andre T-celle delmængder, hale-hud fra andre donorer, f.eks, samme genetiske baggrund, herunder IA BM1 mus og anden genetisk baggrund, herunder Balb / c eller DBA mus kan transplanteres.
I den akutte afstødning undersøgelser vi drage fordel af den naturligt forekommende mutation i MHC klasse II-rille og aktivering af allogene CD4 + T-celler for at studere organafstødning hos mus. C57BL / 6 mus afviste IA bm12 hudtransplantation inden for 14 dage efter transplantationen, hvilket er i overensstemmelse med de fleste undersøgelser USIng IA bm12 hudtransplantater 15-20. Desuden akut afstødning model er almindeligt anvendt til at teste den allogene potentiale af CD4 + T-celler fra gen-deficiente mus. Faktisk IFN-γ - / - mus udviste forsinket IA bm12 hudtransplantat afstødning (upublicerede data og 16). Blokering IFN-γ ved administration af blokerende antistof tilsvarende forsinket afstødning 15,17,18. Dette indikerer en nøglerolle af IFN-γ i at indlede MHC klasse II-ekspression på Ag-præsenterende og endotelceller (Rev. i 12). Da perforin-mangel mus ikke forsinke IA bm12 hud afstødning 21 synes rolle cytokiner til at være mere vigtigt for afvisning. Faktisk, IL-6 administration resulterede i langvarig transplantatoverlevelse, eventuelt ved nedregulering IFN-γ-produktion 15. Desuden synes neutrofiler til at spille en stor rolle i afvisningen af IA bm12 hudtransplantation i IL-4-mangel mus 19 bm12 graftafstødning i mus 20. Administration af anti-CD3 antistof forsinkelser IA bm12 hud afstødning i immunkompetente mus (upublicerede data). Desuden viste vi, at T-celle mangelfuld CD3ε - / - og Rag2 - / - mus acceptere de allogene hudtransplantation i op til 100 dage. Tolerance i disse mus kan let gendannes / brudt af adoptiv overførsel af CD4 + T-celler fra immunkompetente C57BL / 6 mus. Overførsel af 2 x 10 4 CD4 + T-celler eller antigenspecifikke ABM-celler er tilstrækkeligt til at inducere IA bm12 afstødning omkring dag 14. Isolerede Vα2Vβ8 positive ABM celler viste omfattende proliferation og IFN-γ produktion i lymfeknuderne før afstødning, men afvisning var afhængig af I-Abm12 expression i hudtransplantation.
Sammenfattende denne musemodel er en glimrende måde at studere aktivering af lav T-celle numre under afvisning eller tolerance. Halen-hudtransplantation er let at udføre og kan anvendes til mus med forskellige genetiske baggrunde for at undersøge de allogene responser af T-celler uden at pådrage sig alvorlige fysiologisk virkning. Desuden er denne model er ideel til interventioner med kemiske og biologiske stoffer, der inducerer eller hudtransplantation tolerance Break.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
- Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
- Halleck, F., et al. New perspectives of immunosuppression. Transplantation proceedings. 45 (3), 1224-1231 (2013).
- Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
- Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current protocols in immunology. , (2009).
- McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
- McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
- Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non--bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
- Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
- Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
- Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
- Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
- Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
- Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
- Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
- Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
- Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
- Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
- Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
- Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
- Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).
