Introduction
Il trapianto di organi solidi come la pelle, cuore e reni è ormai una procedura standard nella pratica medica in tutto il mondo 1. Organi trapiantati con successo possono essere rifiutati dalla attivazione del sistema immunitario ricevente, che riconosce i principali antigeni di istocompatibilità del donatore. Pertanto, i pazienti trapiantati necessitano di un trattamento con farmaci immunosoppressori 2. Il trapianto allogenico pelle nei topi è stata fondata da Medawar e colleghi nel 1955 ed è stato utile per identificare le molecole mirate successivamente descritto come complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e II. Da allora, il modello di trapianto di pelle è stato costantemente modificato e adattato per studiare il ruolo di sottoinsiemi di cellule T e la rilevanza di prodotti chimici e di intervento biologico nel sopprimere rigetto 2-4. Pelle dall'orecchio e il tronco sono più difficili da preparare e sono più suscettibili di ipossia e necrosi di coda pelle 5; tuttavia,la procedura di trapianto è simile. Inoltre il monitoraggio dei trapianti coda-pelle è facile a causa della caratteristica struttura dei capelli della pelle.
Questo articolo fornisce una procedura dettagliata per MHC di classe II trapianto coda della pelle disadattamento che permette lo studio dei diversi aspetti del CD4 + T cellulo-mediata rigetto e la tolleranza nei topi. La mutazione naturale tre punti nella molecola MHC di classe II IA b (chiamato IA BM12) 6-9 è sufficiente per indurre il rigetto di alloinnesti cutanee in topi C57BL / 6 8. Il BM12 molecola IA attiva le cellule T CD4 + con vari recettore delle cellule T αβ-(TCR) catene da C57BL / 6 topi, tra cui cellule T Vα2Vβ8-TcR-specifici sono stati identificati al fine di generare un topo transgenico TcR-10. Il trasferimento adottivo di cellule Vα2Vβ8-TcR specifiche T è stato utilizzato per creare un modello di rigetto nei C57B immunodeficientiL / 6 Rag2 - / - topi trapiantati con la pelle IA BM12.
Differenze genetiche tra donatore e ricevente impatto l'esito di trapianto di accettazione e di rifiuto. Ci sono diversi tipi di trapianti: autologhi sono trapianti dal singolo destinatario stesso; syngrafts e allotrapianti sono trapianti da individui geneticamente identici e geneticamente imparentati, rispettivamente. L'accettazione di diversi trapianti di organi allogenici è stata dimostrata dagli interventi chimici e biologici nei pazienti e nei modelli murini 11,3,4. In un approccio di base, anti-CD3 anticorpo trattati C57BL / 6 topi hanno mostrato una sopravvivenza prolungata di IA BM12 tail-pelle (dati non pubblicati). L'esaurimento delle CD4 + e CD8 + T cellule prima del trapianto in topi riceventi provocato l'accettazione delle MHC di classe I e II innesti non corrispondenti (Rev. in 12). È interessante notare che il rigetto di innesti di pelle dipende dalla presenza di CD4 + 12). In questo modello, il targeting interazioni specifiche tra le diverse cellule immunitarie, bloccando le molecole di costimolazione con anticorpi o soppressione di cellule T regolatorie potrebbe indurre tolleranza (dati non pubblicati). Infatti, il blocco sia CD40 e CD28 ha portato a lungo termine di tolleranza allogenico pelle 13,14.
Trapianto Tail-pelle è facile da eseguire e facile da controllare rispetto al trapianto di altri organi. Inoltre, trapianti coda-pelle sono facili da preparare e sono meno sensibili a ischemia di altri tessuti cutanei. In contrasto con anestetici iniettati, l'uso di gas anestetico (isofluorano) durante il trapianto accorcia sia la procedura e tempi di recupero destinatario. Arricciamenti del trapianto coda-pelle, che può portare alla guarigione della ferita incompleta e rigetto del trapianto, è impedita dalla applicazione di adesivo tissutale. Inoltre, il modello di trapianto di coda-pelle IA BM12 attiva esclusivamente CD4 Questo protocollo descrive un modello di topo affidabile, riproducibile e facilmente controllato che permette intervento chimico e biologico. Il modello è stato progettato per indagare il rifiuto e la tolleranza induzione di trapianti di coda della pelle.
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Protocol
In questa pubblicazione video e protocollo, sono state condotte tutte le procedure sugli animali conformemente al protocollo animali approvato dall'Autorità cantonale di Basilea-Città, Svizzera. Eseguire tutte le procedure in condizioni sterili, ove possibile.
1. Preparazione di Chirurgia
- Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e garza prima dell'uso.
- Riscaldare il pad calda e organizzare strumenti chirurgici sulla tabella (tabella dei materiali / metodi).
- Aprire le bende striscia dito. Applicare vaselina sul pad ferita con un batuffolo di cotone (assicurarsi che la garza è completamente coperto).
- Pesare i topi e somministrare analgesia Buprenorfina 0,05 mg / kg di peso corporeo. Nota: questo fornirà analgesia subito dopo il trapianto.
2. Preparazione della coda-pelle per il trapianto
- Euthanize topi donatori (ad esempio, IA BM12) per CO 2 asfissia e disinfect le code con una soluzione di disinfezione prima escissione.
- Posizionare la coda con la striscia nera verso il basso su una tavola di plastica pulito e tagliato longitudinalmente tutta la linea mediana, facendo una incisione superficiale coinvolge solo lo strato di pelle.
- Estrarre la pelle dalla coda con pinze di presa.
- Mettere la coda pelle in una coltura di cellule piatto di 10 centimetri riempito con 10 ml HBSS.
3. Procedura chirurgica
- Anestetizzare topi riceventi (ad esempio, C57BL / 6) per inalazione di una soluzione isofluorano 3% in una scatola trasparente induzione. Nota: Ci vogliono 3-5 minuti per il mouse per raggiungere l'anestesia piano chirurgico. Utilizzare veterinario unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Posizionare il mouse sul tappetino tiepida e applicare 1,5% isofluorane tramite una maschera bocca e asini ogni riflesso animale punta pizzicare.
- Shave il sito dorsale dei topi riceventi (ad esempio, C57BL / 6) e rimuovere i peli contaminanti utilizzando una garza sw asciuttoab.
- Disinfettare sito trapianto rasata con una soluzione asettica.
- Pizzicare la pelle con una pinza nel sito centrale / destra del dorso e usare le forbici curve per fare un giro incisione di circa 1 x 0,6 centimetri.
- Se l'emorragia si verifica, quindi pulire la ferita con un tampone di cotone sterile.
- Valutare la dimensione della incisione e tagliare un trapianto della dimensione stimata dalla coda-pelle con il bisturi.
- Tagliare gli angoli per arrotondare il trapianto.
- Caricare il trapianto sul bisturi, eccesso secco di HBSS su un batuffolo di cotone sterile e posizionarlo nel letto innesto del mouse destinatario.
- Evitare la sovrapposizione di donatore e la pelle host e applicare l'adesivo di tessuto sulla zona di contatto in esclusiva.
- Applicare un cerotto, senza pieghe intorno alla vita del mouse.
- Applicare l'adesivo bendaggio non elastico per fissare l'intonaco al mouse (3 mm spostato).
- Incidere con le forbici circa 3 mm nel sito ventrale superiore del bendaggio. Nota: Questo per evitare trANALITICI dei denti del mouse durante la fase di recupero.
- Rimuovere l'anestetico-bocca-maschera e mantenere i topi trapiantati sulla rampa di riscaldamento fino sveglio.
- Ritorno topi trapiantati nelle loro gabbie solo quando completamente recuperato e valutare la loro mobilità per garantire che la fasciatura non sia troppo stretto.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% prima di procedere con un intervento chirurgico successivo.
4. Cure post-operatorie
- Aggiungere sciroppo contenente paracetamolo per l'acqua potabile (4 mg / ml) e somministrare per 7 giorni.
- Ritorno mouse per stanza degli animali una volta che ha recuperato.
- Monitorare attentamente i topi per segni clinici, tra cui la depressione o altri cambiamenti comportamentali (alimentari o di immobilità), aspetto anomalo (mancanza di grooming) o la postura (pilo-erezione o postura ricurva) per il tempo la benda è a posto (1 settimana).
5. Fasciatura Removal (6-7 giorni post-trapianto)
- Anesthetize topi per inalazione di una soluzione isofluorano 3% in una scatola trasparente induzione (vedi sopra).
- Tagliare benda e gesso con le forbici arterie e cura rimuoverle. Nota: evitare di allungamento del sito trapianto.
- Monitorare i topi trapiantati di segni clinici (v. 4.3) e il punteggio per il rifiuto di innesti cutanei (Tabella 1). Nota: Il sistema di punteggio innesto sfrutta le diverse texture dei capelli sulla coda-pelle rispetto alla dorsale pelle. L'aspetto del trapianto e il suo rifiuto è classificato in 3 gradi. Pelle allogenico (MHC II non corrispondenti, ad esempio, IA BM12) innesti di C57BL / 6 topi immunocompetenti di solito sono rifiutati entro 12-15 giorni dopo il trapianto (dati propri e 15-20).
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Representative Results
In un primo approccio C57BL / 6 topi sono stati trapiantati con IA allotrapianti BM12 e IA b syngrafts. Dopo la rimozione della fasciatura, innesti segni manifesti di guarigione della ferita senza chiusura della zona di contatto in topi C57BL / 6 (Figura 1A). Dopo la rimozione della fasciatura, CD4 + T infiammazione cellulo-mediata portato alla comparsa di zone necrotiche (macchie rosse) e rigetto di alloinnesti IA BM12 in C57BL / 6 topi entro 13 giorni dopo il trapianto (Figura 1B-C, simboli pieni), mentre syngrafts è stato tollerato per un massimo di 100 giorni (Figura 1B-C, simboli aperti). Questi dati mostrano la progressione del rigetto acuto di IA innesti BM12 in immunocompetenti C57BL / 6 topi.
Vari studi dimostrano che il rifiuto di MHC classe II non corrispondenti tail-pelle dipende dalla presenza di allogeniche cellule T CD4 + (Rev. in 12). Infatti, cellule T carente CD3ε - / - </ sup> topi e T e cellule B Rag2 carente - / - topi hanno mostrato completa guarigione delle ferite e hanno tollerato la IA BM12 innesti fino a 100 giorni (Figura 2), mentre C57BL / 6 topi respinto innesti entro 13 giorni (Figura 2) . L'accettazione di IA BM12 non corrispondenti tail-pelle permette per lo studio delle allogenico cellule T CD4 + e delle loro funzioni effettrici in un modello di topo senza gravi patologie della malattia.
Per rompere la tolleranza stabilita in CD3ε - / - e Rag2 - / - topi, le cellule T CD4 + sono stati trasferiti adoptively: 2 x 10 4 policlonali C57BL / 6 cellule T CD4 + sono stati sufficienti per indurre il rifiuto di IA innesti BM12 entro 14 giorni ( dati non mostrati). Trasferimento di 50.000 e 100.000 C57BL / 6 cellule T CD4 + non accelerare il processo di rigetto in CD3ε - / - e Rag2 - / - mice. Questi dati sottolineano il ruolo di allogencellule EIC T CD4 + nel modello di rigetto del trapianto cutaneo acuto.
Il vantaggio di questo modello trapianto coda pelle è che l'analisi funzionale delle cellule T CD4 + può essere fatto facilmente trasferimento adottivo di cellule antigene-specifiche CD4 + T. Il topo transgenico ABM 9 è considerato uno strumento ideale per delineare l'attivazione e il comportamento fenotipica della popolazione senza l'influenza di non-specifici cellule T CD4 +. Il trasferimento di 2 x 10 4 cellule ABM antigene-specifiche è stata sufficiente per indurre il rigetto di innesti IA BM12 in Rag2 - / - topi entro 13 giorni (Figura 3A-B). Inoltre, le cellule ABM sono facili da isolare e possono essere monitorati utilizzando l'espressione delle catene Vα2Vβ8-TCR (Figura 3C). La proliferazione delle cellule ABM e la produzione di citochine in BM12 IA trapiantate Rag2 - / - topi sono stati studiati. Cellule ABM proliferato Prorogatevamente come determinato dal eFluor670 diluizione di prova (Figura 3D) e fino al 30% delle cellule ABM prodotto IFN-γ upon PMA-stimolazione (Figura 3E).
Presi insieme, questi dati mostrano che relativamente poche cellule CD4 + T allogeniche sono necessari per indurre rifiuto di IA BM12 innesti cutanei, rendendo questo modello ideale per l'analisi di cellule T allogeniche con minima patologia grave.
Figura 1. Trapianto di topi con trapianto allogenico e singenico coda pelle. (A) C57BL / 6 topi sono stati trapiantati con allogenico (IA BM12) e singenico (IA b) tail-pelle (n = 5 per gruppo). Immagini illustrano allotrapianti (a sinistra) e syngrafts (a destra) dopo la rimozione bendaggio il giorno 7. (B) Scoring e (C)sopravvivenza di pelle innesti di giorno 7 fino al giorno di rifiuto o di monitoraggio finale (giorno 100). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Alloinnesti sono tollerati in assenza di cellule T nei topi sopravvivenza di Rag2 -. / - Trapianti di pelle di topo trapiantate in C57BL / 6, CD3ε - - IA BM12 / - e RAG2 - / - mice (n = 4-6 per gruppo) e l'illustrazione degli innesti rifiutati ed accettati. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 3 specifiche cellule T CD4 + Anti-IA BM12 proliferano e producono IFN-γ durante il rigetto di trapianto (A) Scoring e (B) sopravvivenza di IA BM12 innesti coda di pelle in Rag2 -. / - Mice (n = 5) adoptively trasferita con 2 x 10 4 cellule ABM antigene-specifiche. (C) Vα2Vβ8-colorazione delle cellule ABM isolate da linfonodi di topi transgenici ABM. (D) eFluor670 diluizione di cellule proliferanti ABM e (E) la produzione di IFN-γ di PMA- stimolato le cellule ABM isolate da linfonodi di IA BM12 pelle innestata Rag2 - / -. topi il giorno 9, dopo il trasferimento adottivo di cellule ABM (n = 5 topi) Cliccate qui pervisualizzare una versione più grande di questa figura.
| Graft Score | Descrizione |
| 3 + | Nessun zone rosse e la presenza di una striscia nera lucida |
| 2 + | Aspetto di piccole zone rosse, la perdita di una striscia nera lucida e secchezza |
| 1 + | Aspetto di grandi aree rosse, nessuna striscia nera e ritiro |
| 0 | Rigetto del trapianto definita come 80% necrosi |
Tabella 1. Sistema di punteggio Graft. L'aspetto del trapianto e il suo rifiuto è categorized in 3 gradi, sfruttando le diverse texture dei capelli sulla coda e dorsale pelle.
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Discussion
Trapianto di pelle è un metodo ampiamente usato per studiare rifiuto e tolleranza dipende cellule T. Poiché il modello di trapianto di pelle è stato istituito, sono stati applicati diversi adattamenti e modifiche. Nella procedura descritta, IA BM12 trapianto coda-pelle viene eseguita utilizzando il gas anestetico (isofluorane). L'uso di anestesia gas diminuisce il tempo di esecuzione e topi di recupero, che diminuisce lo stress sui topi trapiantati. La procedura impiega tessuto adesivo per fissare la coda-pelle, che tende ad arricciarsi più di orecchio o tessuto-pelle dorsale. Inoltre è importante per appiattire la coda-pelle prima del taglio e rifilatura dei bordi in quanto ciò riduce curling e migliora posizionamento della coda-pelle sul sito escissione dorsale.
Per valutare il rigetto dell'organo trapiantato o accettazione è necessaria per preparare la coda pelle con la striscia nera (ad esempio, in topi C57BL / 6) nel mezzo dell'innesto per facilitare punteggio di tradinsplants basati su differenze di struttura dei capelli.
La mutazione del BM12 molecola MHC di classe II IA attiva esclusivamente cellule T CD4 + in topi immunodeficienti e immunocompetenti (dello stesso sfondo genetico). Da un lato questo facilita l'interpretazione dei risultati, ma dall'altro limita il metodo di cellule T CD4 + studi. Per estendere l'attivazione delle cellule T ad altri sottoinsiemi di cellule T, tail-pelle da altri donatori, ad esempio, il background genetico stesso compreso topi IA BM1 e background genetico diverso, tra cui Balb / c o DBA topi possono essere trapiantate.
Negli studi di rigetto acuto, beneficiamo di mutazione naturale nella classe II solco MHC e l'attivazione di allogeniche cellule T CD4 + per studiare il rigetto d'organo nei topi. C57BL / 6 topi respinto IA BM12 innesti cutanei entro 14 giorni dopo il trapianto, che è coerente con la maggior parte degli studi USIpelle ng IA BM12 trapianti 15-20. Inoltre il modello rigetto acuto è ampiamente utilizzato per testare il potenziale allogenico di cellule T CD4 + da topi gene-carenti. Infatti, IFN-γ - / - mice mostrava ritardato IA BM12 rigetto del trapianto cutaneo (dati non pubblicati e 16). Blocco IFN-γ mediante somministrazione di bloccare anticorpi simile ritardo rifiuto 15,17,18. Ciò indica un ruolo chiave di IFN-γ nell'iniziare espressione MHC classe II su Ag-presentare e cellule endoteliali (Rev. in 12). Poiché perforina-deficient mice non tardò IA BM12 rigetto della pelle 21, il ruolo delle citochine sembra essere più importante per il rifiuto. Infatti, IL-6 somministrazione ha prolungato la sopravvivenza del trapianto, eventualmente downregulating IFN-γ-produzione 15. Inoltre, i neutrofili sembrano giocare un ruolo importante nel rifiuto di IA BM12 innesti cutanei in topi IL-4-deficient 19 BM12 rigetto del trapianto nei topi 20. La somministrazione di anti-CD3 ritardi anticorpi IA BM12 rigetto della pelle nei topi immunocompetenti (dati non pubblicati). Inoltre, abbiamo dimostrato che cellule T carente CD3ε - / - e Rag2 - / - mice Accetto i trapianti di pelle allogenico per un massimo di 100 giorni. Tolleranza in questi topi possono essere facilmente ripristinato / rotto dal trasferimento adottivo di cellule T CD4 + da immunocompetenti C57BL / 6 topi. Trasferimento di 2 x 10 4 cellule T CD4 + o cellule ABM antigene-specifiche è sufficiente per indurre IA BM12 rigetto intorno al giorno 14. Isolato cellule ABM Vα2Vβ8-positivi hanno mostrato una vasta proliferazione e la produzione di IFN-γ nei linfonodi prima del rifiuto, tuttavia rigetto era dipendente da I-Abm12 expressione nel trapianto di pelle.
In sintesi, questo modello di topo è un ottimo modo per studiare l'attivazione del numero di cellule T basso durante il rigetto o la tolleranza. Il trapianto coda-pelle è facile da eseguire e può essere applicato a topi con differenti background genetici per studiare le risposte di cellule T allogeniche senza incorrere in un effetto fisiologico grave. Inoltre, questo modello è ideale per interventi con sostanze chimiche e biologiche che inducono o rompere la tolleranza innesto cutaneo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
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