Introduction
Transplantation av fasta organ såsom hud, hjärta och njurar är nu ett standardförfarande i medicinsk praxis i hela världen 1. Framgångsrikt transplanterade organ kan avvisas av aktivering av mottagarens immunsystem, som erkänner de stora histokompatibilitetsantigener av donatorn. Därför transplanterade patienter behöver behandling med immunosuppressiva läkemedel 2. Allogen hud transplantation på möss etablerades av Medawar och kollegor i 1955 och var till hjälp för att identifiera de riktade molekylerna senare beskrivs som MHC (MHC) klass I och II. Sedan dess har hudtransplantation modellen kontinuerligt modifierats och anpassats för att studera betydelsen av T-cell-undergrupper och relevansen av kemiska och biologiska intervention i trycka avstötning av transplantat 2-4. Hud från örat och bålen är svårare att förbereda och är mer mottagliga för hypoxi och nekros än tail-skin 5; docktransplantationsförfarandet är likartad. Dessutom är lätt på grund av den karakteristiska hårstruktur av huden övervakning av svans-hudtransplantat.
Den här artikeln innehåller en detaljerad beskrivning av MHC klass II mismatch svans-hudtransplantation som gör det möjligt att studera olika aspekter av CD4 + T-cellmedierad avstötning och tolerans hos möss. Den naturliga tre-punktmutation i MHC klass Il-molekyl IA b (kallat IA bm12) 6-9 är tillräcklig för att inducera avstötning av hud-allograft i C57BL / 6 möss 8. Den IA bm12 molekylen aktiverar CD4 +-T-celler med diverse cell αβ-T-receptor (TCR)-kedjor från C57BL / 6 möss, bland vilka Vα2Vβ8-TcR-specifika T-celler identifierades i syfte att alstra en TCR-transgen mus 10. Den adoptiv överföring av Vα2Vβ8-TcR-specifika T-celler har använts för att etablera en kasse modell i immundefekta C57BL / 6 RAG2 - / - möss som transplanterats med IA bm12 hud.
Genetiska skillnader mellan givare och mottagare påverkar resultatet av transplantatacceptans och avvisande. Det finns olika typer av transplantationer: auto är transplantationer från den mottagande individen själv; syngrafts och allografter är transplantationer från genetiskt identiska och genetiskt obesläktade individer respektive. Godkännande av olika transplantationer allogen organ har visats genom kemisk och biologisk ingripande i patienter och musmodeller 11,3,4. I en grundläggande tillvägagångssätt, anti-CD3-antikropp-behandlade C57BL / 6 möss uppvisade förlängd överlevnad av IA bm12 tail-skin (opublicerade data). Utarmning av CD4 + och CD8 + T-celler före transplantation i mottagarländerna möss resulterade i godkännande av MHC klass I och II inkompatibla transplantat (rev. i 12). Intressant, avstötning av hudtransplantation beror på närvaron av CD4 + 12). I denna modell kan rikta specifika interaktioner mellan olika immunceller genom att blockera samstimulerande molekyler med antikroppar eller undertryckande med regulatoriska T-celler inducerar tolerans (opublicerade data). Faktum är att blockera både CD40 och CD28 ledde till långvarig hud allograft tolerans 13,14.
Svans hudtransplantation är lätt att utföra och lätt att övervaka jämfört med transplantation av andra organ. Dessutom svans-hud transplantationer är lätt att förbereda och är mindre känsliga för ischemi än andra hud vävnader. I motsats till injicerade bedövningsmedel, användning av narkosgasen (isofluoran) vid transplantation förkortar både förfarandet och mottagare återhämtningstid. Curling av svansen-hud transplantation, vilket kan leda till ofullständig sårläkning och transplantatavstötning, förhindras genom tillämpning av vävnadslim. Dessutom IA bm12 tail-hudtransplantation modell aktiverar CD4 uteslutande Detta protokoll beskriver en pålitlig, reproducerbar och lätt övervakas musmodell som möjliggör kemisk och biologisk ingripande. Modellen är avsedd för undersökning av avstötning och toleransinduktion av svans-hudtransplantat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denna video publicering och protokoll, alla djurförsök utförs i enlighet med djur protokollet godkänts av kantonala myndigheten Basel-Stadt, Schweiz. Utför alla förfaranden i sterila förhållanden där så är möjligt.
1. Beredning av kirurgi
- Autoklavera alla kirurgiska instrument och gasväv före användning.
- Värm varma pad och organisera kirurgiska instrument på bordet (Table of Materials / metoder).
- Öppna finger remsor bandage. Applicera vaselin på såret pad med en bomullspinne (se gasväv är helt täckt).
- Väg mössen och administrera smärtlindring Buprenorfin 0,05 mg / kg kroppsvikt. Obs: detta kommer att ge smärtlindring direkt efter transplantation.
2. Beredning av Tail-skin för transplantation
- Euthanize donatormöss (t.ex. IA bm12) per kvävning med CO2 och disinfect svansar med desinfektionslösning före excision.
- Placera svansen med svart rand ner på en ren plastkortet och skär den på längden i hela mittlinjen, vilket gör en ytlig snitt involverar endast hudlagret.
- Dra av huden från svansen med hjälp av grepp pincett.
- Sätt svansen-huden i en 10 cm cellodlingsskål fylld med 10 ml HBSS.
3. Kirurgisk procedur
- Bedöva mottagarmöss (eg, C57BL / 6) genom inhalation av en 3% isofluoran lösning i en genomskinlig induktion låda. Observera: Det tar 3-5 min för musen för att nå kirurgiska plan anestesi. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Placera musen på den varma pad och tillämpa 1,5% isofluoran via en mun mask och åsnor varje djur reflex från tå nypa.
- Raka rygg platsen för de mottagande möss (t.ex. C57BL / 6) och ta bort kontaminerande hårstrån med hjälp av en torr gasväv swab.
- Desinficera rakat transplantation plats med aseptisk lösning.
- Nyp huden med pincett i mitten / höger sida av dorsum och använda böjd sax för att göra en runda snitt på ca 1 x 0,6 cm.
- Om blödning uppstår, då rengöra såret med en steril bomullspinne.
- Utvärdera storleken på snittet och skär en transplantation av den beräknade storleken från svansskinn med användning av skalpell.
- Trim hörn att runda transplantationen.
- Fyll på transplantatet på skalpellen, torr överskott av HBSS på en steril bomullstuss och placera den i transplantatbädden av mottagaren mus.
- Undvik överlappning av givare och värd hud och tillämpa vävnadsadhesiv på kontaktzonen exklusivt.
- Applicera ett plåster utan veck runt musen midjan.
- Applicera lim icke-elastisk binda för att fästa gips till musen (3 mm skiftat).
- Incisionsfilm med saxen omkring 3 mm i den övre ventrala platsen av bandaget. OBS: Detta är för att undvika trapping av musens tänder under återhämtningsfasen.
- Ta ut bedövningsmedel-mun-mask och hålla de transplanterade möss på värmedynan tills vaken.
- Återgå transplanterade möss till sina burar endast när återhämtat sig helt och bedöma deras rörlighet för att se till att bandaget inte är för snäv.
- Sterilisera alla kirurgiska instrument med 70% etanol innan du fortsätter med nästa operation.
4. Postoperativ vård
- Lägg paracetamol som innehåller sirap till dricksvatten (4 mg / ml) och administrera det i 7 dagar.
- Återgå musen till djurrummet när den har återhämtat sig.
- Noga övervaka möss för kliniska symptom som depression eller andra beteendeförändringar (äta eller orörlighet), onormalt utseende (brist på grooming) eller kroppshållning (upprest päls eller krökt kroppshållning) för den tid bandaget är på plats (1 vecka).
5. Bandage Removal (6-7 dagar efter transplantation)
- Anesthetize möss genom inhalation av en 3% isofluoran lösning på ett öppet induktionslåda (se ovan).
- Klipp bandage och gips med artär sax och försiktigt ta bort dem. OBS: undvika sträckning av transplantationsstället.
- Övervaka transplanterade möss för kliniska tecken (se 4.3) och poäng för avstötning av hudtransplantation (tabell 1). Anm: Transplantatet score-system drar fördel av de olika hår texturer på svans-huden jämfört med den dorsala huden. Utseendet på transplantation och dess avvisande kategoriseras i tre grader. Allogen hud (MHC II inkompatibla, exempelvis, IA bm12) transplantat av C57BL / 6 immunkompetenta möss brukar avvisas inom 12-15 dagar efter transplantation (egna data och 15-20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I ett första tillvägagångssätt C57BL / 6 möss transplanterades med IA bm12 allograft och IA b syngrafts. När bandaget avlägsnas, ympar uppenbara tecken på sårläkning utan tillslutning av kontaktzonen i C57BL / 6 möss (Figur 1A). När bandaget avlägsnas, ledd av CD4 + T-cellförmedlad inflammation till utseendet på nekrotiska områden (röda prickar) och avstötning av IA bm12 allotransplantat i C57BL / 6 möss inom 13 dagar efter transplantation (Figur 1B-C, fyllda symboler), medan syngrafts tolererades under upp till 100 dagar (Figur 1B-C, öppna symboler). Dessa data visar progressionen av akut avstötning av IA bm12 transplantat i immunokompetenta C57BL / 6 möss.
Olika studier visar att förkastande av MHC klass II omaka svans-hud är beroende av förekomsten av allogena CD4 + T-celler (rev. i 12). Indeed, T-cell deficient CD3ε - / - </ sup> möss och T-och B-celler bristfälliga RAG2 - / - möss visade fullständig sårläkning och tolererade IA bm12 transplantat upp till 100 dagar (figur 2), medan C57BL / 6 möss avvisade transplantat inom 13 dagar (figur 2) . Godkännandet av IA bm12 omaka svans-hud möjliggör studier av allogena CD4 + T-celler och deras effektorfunktioner i en musmodell utan allvarliga sjukdomar sjukdom.
För att bryta den etablerade tolerans i CD3ε - / - och RAG2 - / - möss, CD4 + T-celler adoptivt överförs: 2 x 10 4 polyklonala C57BL / 6 CD4 + T-celler var tillräckliga för att framkalla avstötning av IA bm12 transplantat inom 14 dagar ( data ej visade). Överföring av 50.000 och 100.000 C57BL / 6 CD4 +-T-celler inte accelerera transplantatavstötning processen i CD3ε - / - och RAG2 - / - möss. Dessa data understryker betydelsen av Allogeneic CD4 + T-celler i den akuta hud transplantatavstötning modell.
Fördelen med denna svans-hud transplantation modell är att funktionell analys av CD4 +-T-celler kan lätt göras genom adoptiv överföring av antigenspecifika CD4 + T-celler. Transgen ABM mus 9 anses vara ett idealiskt verktyg för att avgränsa aktiveringen och den fenotypiska uppträdande av populationen utan inverkan av icke-specifika CD4 +-T-celler. Överföringen av 2 x 10 4 antigenspecifika ABM-celler var tillräcklig för att inducera avstötning av IA bm12 transplantat i RAG2 - / - möss inom 13 dagar (Figur 3A-B). Dessutom ABM-celler är lätta att isolera och kan spåras med hjälp av uttrycket av de Vα2Vβ8-TcR-kedjor (figur 3C). ABM-cellproliferation och produktion av cytokiner i IA bm12 transplanterade RAG2 - / - möss undersöktes. ABM-celler föröka extensifitivt bestämt genom eFluor670 utspädningsanalys (fig 3D) och upp till 30% av ABM-celler producerade IFN-γ vid PMA-stimulering (figur 3E).
Sammantaget visar dessa data att relativt få allogena CD4 + T-celler erfordras för att inducera avstötning av IA bm12 hudtransplantat, vilket gör denna modell idealisk för analys av allogena T-celler med minimal allvarlig patologi.
Figur 1. Transplantation av möss med allogen och syngent svans-skin. (A) C57BL / 6 möss transplanterades med allogena (IA bm12) och syngena (IA b) svans-hud (n = 5 per grupp). Bilder visar allografts (vänster) och syngrafts (höger) efter bandage bort på dag 7. (B) Målgörare och (C)överlevnad hudtransplantation från dag 7 till dag för avstötning eller slut övervakning (dag 100). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2 Allografter tolereras i frånvaro av T-celler i möss Överlevnad av RAG2 -. / - IA bm12 - mus hudtransplantat som transplanterats i C57BL / 6, CD3ε - / - och RAG2 - / - möss (n = 4-6 per grupp) och illustration avvisade och accepterade transplantat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 3 Anti-IA bm12 specifika CD4 +-T-cellerna proliferera och producera IFN-γ under transplantatavstötning (A) Scoring och (B) överlevnad hos IA bm12 svans-hudtransplantat i RAG2 -. / - Möss (n = 5) adoptivt överförs med 2 x 10 4 antigenspecifika ABM-celler. (C) Vα2Vβ8-färgning av ABM-celler som isolerats från lymfkörtlar från transgena ABM möss. (D) eFluor670 utspädning av prolifererande ABM-celler och (E) IFN-γ produktion av PMA- stimulerade ABM celler som isolerats från lymfkörtlar i IA bm12 hud ympade RAG2 - / -. möss på dag 9 efter adoptiv cellöverföring ABM (n = 5 möss) Klicka här för attse en större version av denna siffra.
| Graft Betyg | Beskrivning |
| 3 + | Inga röda områden och närvaron av en glänsande svart rand |
| 2 + | Utseende av små röda områden, förlust av en glänsande svart rand och torrhet |
| 1 + | Utseende av stora röda områden, ingen svart rand och krympning |
| 0 | Transplantationsavstötning definieras som 80% nekros |
Tabell 1. Graft poängsystem. Utseendet på transplantation och avstötning är kategorized i 3 grader, att dra nytta av de olika hår texturer på svansen-och rygg-hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hud transplantation är en allmänt använd metod för att studera avstötning och tolerans beroende av T-celler. Eftersom huden transplantationsmodell bildades har flera anpassningar och förändringar tillämpats. I det beskrivna förfarandet, är IA bm12 svans-hud transplantation utförs med hjälp av narkosgaser (isofluoran). Användningen av gas anestesi minskar tiden för utförande och möss återhämtning, vilket minskar belastningen på transplanterade möss. Proceduren använder vävnadsadhesiv att fixa svansen-skin, som tenderar att krypa mer än örat eller dorsal-hudvävnad. Dessutom är det viktigt att platta till svans-hud före skärning och trimning kanterna eftersom detta minskar curling och förbättrar positioneringen av svans-huden på den dorsala excision site.
För att bedöma avstötning av transplantat eller acceptans krävs det att förbereda svansen-huden med svart band (t.ex. i C57BL / 6 möss) i mitten av transplantatet för att underlätta att göra poäng av transplants baserade på hårstruktur skillnader.
Mutationen av MHC klass Il-IA bm12 molekylen aktiverar exklusivt CD4 +-T-celler i immunkompetenta och immundefekta möss (av samma genetiska bakgrund). Å ena sidan är detta underlättar tolkningen av resultaten, men å andra sidan den begränsar metoden till CD4 +-T-celler studier. För att förlänga T-cellsaktivering till andra T-cellgrupper, svans-hud från andra givare, till exempel, samma genetiska bakgrund inklusive IA BM1 möss och annan genetisk bakgrund inklusive Balb / c eller DBA möss kan transplanteras.
Under de akuta avstötnings studier vi dra nytta av den naturligt förekommande mutation i MHC klass Il-spåret och aktiveringen av allogena CD4 + T-celler för att studera organavstötning hos möss. C57BL / 6 möss förkastas IA bm12 hudtransplantat inom 14 dagar efter transplantation, vilket är förenligt med de flesta studier USIng IA bm12 hudtransplantat 15-20. Förutom den akuta avstötnings modell används allmänt för att testa den allogena potentialen hos CD4 +-T-celler från gen-defekta möss. Indeed, IFN-γ - / - uppvisade möss fördröjd IA bm12 hud transplantatavstötning (opublicerade data och 16). Blockering IFN-γ genom administration av blockerande antikropp på liknande fördröjd avstötning 15,17,18. Detta tyder på en viktig roll för IFN-γ i påbörjande MHC klass Il-expression på Ag-presenter och endotelceller (rev. i 12). Eftersom perforin-brist möss inte försena IA bm12 huden avstötning 21, verkar roll cytokiner vara viktigare för avstötning. Indeed, IL-6 administrering resulterade i förlängd transplantatöverlevnad, eventuellt genom nedreglering av IFN-γ-produktion 15. Dessutom neutrofiler verkar spela en viktig roll i avvisandet av IA bm12 hudtransplantation i IL-4-brist möss 19 bm12 avstötning hos möss 20. Administration av anti-CD3 förseningar antikropps IA bm12 huden avstötning i immunkompetenta möss (opublicerade data). Dessutom visade vi att T-cell deficient CD3ε - / - och RAG2 - / - möss acceptera de allogena hudtransplantat i upp till 100 dagar. Tolerans hos dessa möss kan lätt återgick / brytas genom adoptiv överföring av CD4 +-T-celler från immunokompetenta C57BL / 6 möss. Överföring av 2 x 10 4 av CD4 + T-celler eller antigenspecifika ABM-celler är tillräcklig för att inducera IA bm12 transplantatavstötning runt dag 14. Isolerat Vα2Vβ8 positiva ABM-celler visade omfattande proliferering och IFN-γ produktion i lymfkörtlarna före avstötning emellertid avslag var beroende av I-Abm12 expressjon i hudtransplantat.
Sammanfattningsvis är denna musmodell ett utmärkt sätt för att studera aktivering av tal låg T-cell under avstötning eller tolerans. Svansen-hudtransplantation är lätt att utföra och kan appliceras till möss med olika genetisk bakgrund för att studera de allogena svar hos T-celler utan att ådra sig en allvarlig fysiologisk effekt. Dessutom är denna modell perfekt för insatser med kemiska och biologiska ämnen som inducerar eller bryta hudtransplantation tolerans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
- Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
- Halleck, F., et al.
- Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
- Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
- McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
- Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non--bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
- Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
- Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
- Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
- Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
- Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
- Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
- Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
- Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
- Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
- Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
- Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
- Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
- Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).
