Introduction
固体器官，如皮肤，心脏和肾脏移植是目前在全世界的医疗实践1的标准程序。成功移植的器官可以通过激活受体的免疫系统，其中确认捐助的主要组织相容性抗原被拒绝。因此移植的患者需要使用免疫抑制药物治疗2。异体皮移植在小鼠体内建立了梅达沃和他的同事于1955年，是识别后世誉为主要组织相容性复合体（MHC）I类和II目标分子的帮助。从那以后，皮肤移植模型得到了不断的修改和调整，研究T细胞亚群的作用和抑制移植排斥2-4化学和生物干预的相关性。从耳朵和躯干的皮肤都比较困难的准备，而且更容易受到缺氧和坏死较尾皮5;然而，移植过程是类似的。在另外的尾部皮肤移植物的监测是很容易由于皮肤的特征头发纹理。
本文提供的详细步骤MHC II类错配尾部皮肤移植，允许的CD4 + T细胞介导的移植排斥反应和耐受小鼠不同方面的研究。在MHC II类分子IA b将天然三点突变（称为IA BM12）6-9是足以引起排斥反应的皮肤移植物在C57BL / 6小鼠8。在IA BM12分子激活CD4 + T细胞与各种αβT细胞受体（TCR）从C57BL / 6小鼠链，其中Vα2Vβ8-TCR特异性T细胞，以产生一个TCR转基因小鼠10识别。 Vα2Vβ8-TCR特异性T细胞的过继转移已被用于建立一个排斥模型在免疫缺陷C57BL / 6的Rag2 - / -移植与IA BM12皮肤老鼠。
捐赠者和接受者之间的基因差异影响移植接受和拒绝的结果。有不同类型的移植：自体移植是从接收者个人自身移植; syngrafts和移植物分别从基因上相同和基因无关个体移植。不同的异体器官移植的接受已经证明了患者和小鼠模型11,3,4化学和生物干预。在一个基本的方法，抗-CD3抗体处理的C57BL / 6小鼠表现出IA BM12尾部皮肤（未发表数据），生存期延长。 CD4 +和CD8 + T细胞移植受体小鼠前的枯竭导致接受MHC I类和II不匹配的移植（修订版12）。有趣的是，抑制皮肤移植取决于CD4 +的存在12）。在此模型中，通过阻断共刺激分子的抗体或抑制与调节性T细胞靶向不同的免疫细胞之间的特异性相互作用可能诱导耐受（未发表数据）。事实上，无论阻断CD40和CD28分子导致了长期的皮肤移植耐受13,14。
相比于其它器官的移植尾部皮肤移植容易进行并易于监测。此外，尾部皮肤移植很容易准备，而且不太容易受到缺血较其他皮肤组织。而相比之下，注射麻醉剂，移植过程中使用麻醉气体（异氟烷）的缩短两者的程序和收件人的恢复时间。尾部皮肤移植，这可能会导致不完全的伤口愈合，移植物排斥的卷曲，可以防止通过应用组织粘合剂。此外，IA BM12尾部皮肤移植模型的专门激活的CD4 本协议描述了一个可靠，重现性好，易于监控的小鼠模型，允许化学和生物干预。该模型的目的是调查排斥和耐受诱导的尾部皮肤移植手术。
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Protocol
在这个视频发布和协议，所有动物的程序按照批准由州局巴塞尔城市州，瑞士动物的协议进行的。执行在无菌条件下尽可能的所有程序。
外科1。准备
- 高压灭菌所有的手术器械，使用前纱布。
- 热保暖垫，并组织手术器械上的表 （表材料/方法 ）。
- 打开手指带绷带。应用凡士林的伤口垫用棉签（确保纱布完全覆盖）。
- 称取小鼠和管理镇痛丁丙诺啡0.05毫克/公斤体重。注：这将立即移植后提供镇痛。
2，准备的尾部皮肤移植
- 每二氧化碳窒息和D安乐死供体小鼠（ 例如 IA BM12）isinfect尾部与前切除术消毒液。
- 定位尾部的黑色条纹倒在一个干净的塑料板，切纵向贯穿中间路线，做一个肤浅的切口仅累及皮肤层。
- 拉过使用镊子夹住尾巴的皮肤。
- 把尾部皮肤在10cm的细胞培养皿填充用10ml HBSS中。
3，外科手术
- 通过吸入以透明感应箱3％的异氟烷溶液麻醉受体小鼠（ 例如，C57BL / 6）。注意：这需要3-5分钟的鼠标，达到手术麻醉平面。使用上的眼睛兽医药膏，以防止肌肤干燥，同时在麻醉下。
- 将鼠标放在暖垫，并通过一个口罩和驴由脚趾捏适用1.5％异氟烷每个动物的条件反射。
- 剃接受者小鼠的背部的网站（ 例如，C57BL / 6），用干纱布SW去除污染的毛AB。
- 消毒剃部位无菌解决方案移植。
- 捏在背部中间/右现场镊子皮肤和使用弯曲剪刀，使约1×0.6厘米的圆形切口。
- 如果发生出血，然后清洗伤口，用无菌棉签。
- 评估该切口的大小和切断从使用手术刀尾部皮肤的估计大小的移植。
- 修剪边角圆的移植。
- 加载移植上的手术刀，干多余的HBSS在无菌棉签，并将其放置在受体小鼠的移植床。
- 避免供体和宿主皮肤的重叠和应用上的接触区域组织粘合剂完全。
- 应用无石膏鼠标左右腰部皱褶。
- 适用于粘接非弹性绷带来固定石膏鼠标（2毫米移位）。
- 切开以约3毫米的绷带的上腹部站点的剪刀。注意：这是为了避免TR鼠标的牙齿在恢复阶段apping。
- 取出麻醉口面罩，并保持移植的小鼠在加热垫，直到清醒。
- 返回小鼠移植到自己的笼子里，只有当完全康复，并评估其流动性，以确保绷带是不是太紧张。
- 继续进行下一个手术前消毒用70％乙醇所有的外科手术器械。
4，术后护理
- 添加含扑热息痛的糖浆的饮用水（4毫克/毫升），并管理它7天。
- 返回鼠标的动物房一旦恢复。
- 密切留意老鼠的临床症状包括抑郁症或其他行为改变（饮食或不动），外观异常（缺乏疏导）或姿势（PILO勃起或弯腰驼背的姿势），当时的绷带到位（1周）。
5，去除绷带（6-7天移植后）
- ANESthetize小鼠通过吸入以透明感应框（见上文）3％的异氟烷溶液。
- 切绷带和石膏与动脉剪刀，小心地将其删除。注意：避免拉伸移植部位。
- 监测移植小鼠的临床症状（见4.3），得分为抑制皮肤移植（ 表1）。注：该接枝评分系统采用的尾部皮肤较背侧皮肤不同发质的优势。移植和排斥的外观分为3级。 C57BL / 6小鼠免疫功能的异体皮（MHC II类错配， 例如，爱荷华BM12）移植物通常在12-15天移植后（自己的数据和15-20）拒绝。
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Representative Results
在第一种方法中的C57BL / 6小鼠移植IA BM12同种异体移植物和IA b syngrafts。拆除绷带后，移植物伤口愈合的迹象明显没有在C57BL / 6小鼠（ 图1A）的接触带的闭合。拆除绷带后，CD4 + T细胞介导的炎症导致的坏死区域的外观（红点）和内移植（ 图1B-C，实心）后13天C57BL / 6小鼠抑制IA BM12移植，而syngrafts被容忍长达100天（ 图1B-C，空心符号）。这些数据显示，IA BM12移植在免疫C57BL / 6小鼠的急性排斥反应的进展。
各种研究表明，抑制MHCⅡ类错配的尾部皮肤取决于同种异体CD4 + T细胞（修订版12）的存在。事实上，T细胞缺陷CD3ε - / - </ SUP>小鼠和T-和B-细胞缺陷的Rag2 - / -小鼠表现出完整的伤口愈合和耐受性的IA BM12移植物达100天（ 图2），而C57BL / 6小鼠移植拒绝在13天（ 图2） 。 IA的BM12不匹配的尾部皮肤可以接受异基因CD4 + T细胞和它们的效应功能在没有严重的疾病的病症的小鼠模型的研究。
打破既定公差在CD3ε - / -和的Rag2 - / -小鼠中，CD4 + T细胞过继转移：2×10 4个多克隆的C57BL / 6的CD4 + T细胞足以诱导排斥IA BM12移植的14天内（数据未显示）。 50,000和100,000的C57BL / 6的CD4 + T细胞的转移不加速CD3ε的移植物排斥过程- / -和的Rag2 - / -小鼠。这些数据强调allogen的作用EIC CD4 + T细胞在急性皮肤移植排斥模型。
这个尾部皮肤移植模型的优点是，CD4 + T细胞的功能分析可以通过抗原-特异性CD4 + T细胞的过继转移容易进行。该转基因小鼠ABM 9被认为是一种理想的工具描绘的活化和人口的表型行为，而不是非特异性的CD4 + T细胞的影响。 2×10 4个抗原特异性ABM单元的传输是足以引起排斥反应的IA BM12移植物中的Rag2 -在13天（ 图3A-B）小鼠- /。此外，ABM细胞易于分离，并且可以使用Vα2Vβ8-TCR链（ 图3C）中的表达进行跟踪。细胞因子IA BM12的ABM细胞增殖和生产移植的Rag2 - / -小鼠进行了研究。反导细胞增殖后缀的vely由eFluor670稀释测定法（ 图3D），并确定在PMA刺激（ 图3E）反导细胞高达30％的产生的IFN-γ。
总而言之，这些数据表明，相对少的异源CD4 + T细胞是必需的，诱导抑制IA BM12皮肤移植，使该模型非常适合同种异体T细胞以最小的严重病理分析。
图1。移植小鼠异体同基因和尾部的皮肤。 （一）C57BL / 6小鼠移植与异体（IA BM12）和同基因（IA B）尾部皮肤（N = 5元组）。图片第7天拆除绷带后，说明移植（左）和syngrafts（右）（B）计分和（C）皮肤移植物存活7天，直到抑制或最终的监测（100天）的日子。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2是同种异体移植物的耐受性在没有T细胞的小鼠中的Rag2的生存- / - IA BM12 -小鼠皮肤移植物移植到C57BL / 6，CD3ε - / -和的Rag2 - / -小鼠（n = 4-6每组），并说明拒绝和接受移植。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3抗IA BM12特异性CD4 + T细胞增殖，并在移植排斥反应产生IFN-γ（一）评分和IA BM12尾部皮肤移植中的Rag2（B）生存- / -小鼠（n = 5）继转移用2×10 4的抗原特异性细胞ABM（C）Vα2Vβ8染色ABM细胞从转基因小鼠的反弹道导弹的淋巴结中分离的（D）eFluor670稀释增殖ABM细胞和（E）的IFN-γ生产的PMA-刺激反导细胞IA BM12皮肤移植的Rag2的淋巴结中分离- / -小鼠在第9天之后反导继细胞转移（N = 5只小鼠） 请点击此处查看该图的放大版本。
| 移植得分 | 描述 |
| 3 + | 没有红区和一个闪亮的黑色条纹的存在 |
| 2 + | 红色的小区域，损失一个闪亮的黑色条纹和干燥的外观 |
| 1 + | 大红色区域的外观，没有黑条和收缩 |
| 0 | 移植排斥反应定义为80％坏死 |
表1。嫁接评分系统，移植和排斥反应的出现是美食gorized在3级，趁着不同发质的尾巴和背部皮肤。
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Discussion
皮肤移植是一种广泛使用的方法为研究抑制和容忍依赖于T细胞。自成立以来的皮肤移植模型中，几个修改和变化都得到了应用。在描述的过程中，使用麻醉气体（异氟烷）进行IA BM12尾部皮肤移植。使用气体麻醉的降低执行和小鼠恢复，从而减少了应力对移植小鼠的时间。该程序使用组织粘合剂来固定尾部皮肤，这容易卷曲超过耳或背皮肤组织。此外，它弄平切割和修整的边缘，因为这降低卷曲和提高了对背侧切除部位的尾部皮肤的定位之前尾部皮肤是非常重要的。
为了评估移植排斥或接受它需要准备尾部皮肤与黑色条纹（ 例如，C57BL / 6小鼠）在移植物的中间，方便TRA得分根据头发的质感差异nsplants。
在MHC II类IA BM12分子的突变完全激活免疫（相同遗传背景）和免疫缺陷小鼠CD4 + T细胞。一方面这有利于对结果的解释，但另一方面它限制了该方法对CD4 + T细胞的研究。为了延长T细胞活化其他T细胞亚群，尾部的皮肤从其他捐助者， 比如，相同的遗传背景，包括IA BM1小鼠和不同的遗传背景，包括免疫BALB / c或DBA小鼠可移植。
在急性排斥反应的研究中，我们受益于II类MHC槽和异源CD4 + T细胞，研究器官排斥小鼠的活化天然存在的突变。 C57BL / 6小鼠拒绝IA BM12皮肤移植中移植，这与大多数研究一致USI后14天吴IA BM12皮肤移植15-20。除了 急性排斥模型被广泛用于测试的CD4 + T细胞从基因缺陷小鼠的同种异基因的潜力。事实上，IFN-γ - / -小鼠表现出延迟IA BM12皮肤移植排斥反应（未发表数据和16）。阻断IFN-γ通过阻断抗体同样地延迟排斥15,17,18的管理。这表明IFN-γ在发起在Ag呈递细胞和内皮细胞（版本12）II类MHC表达的关键作用。自穿孔缺陷的小鼠并没有耽误IA BM12皮肤移植排斥21，细胞因子的作用似乎是抑制更为重要。实际上，IL-6施用导致延长移植物存活，有可能通过下调IFN-γ生产15。此外，嗜中性粒细胞似乎在IA BM12皮肤移植物中的IL-4缺陷型小鼠19的排斥中起主要作用BM12移植排斥小鼠20加强。管理的抗CD3抗体延误IA BM12皮肤移植排斥反应的免疫小鼠（未发表资料）。此外，我们发现，T细胞缺陷的CD3ε - / -和的Rag2 - / -小鼠接受异基因皮肤移植长达100天。公差在这些小鼠中可以很容易地恢复/由CD4 + T细胞的自免疫C57BL / 6小鼠过继转移破碎。转移2×10 4个CD4 + T细胞或抗原特异性细胞ABM是足以引起大约14天IA BM12移植物排斥。隔离Vα2Vβ8阳性细胞ABM但是表明在排斥前淋巴结广泛的增殖和IFN-γ的生产，拒绝是依赖于I-ABM12快递离子在皮肤移植。
总之，这种小鼠模型是研究抑制或耐受性在低活化T细胞数量的一个很好的方式。尾部皮肤移植是容易执行，并且可以被应用到小鼠不同的遗传背景，研究T细胞的同种异体反应而不会产生严重的生理效应。此外，这种模式是理想的干预，化学和生物物质，诱发或破皮肤移植耐受。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast finger strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Narrow pattern forceps | FST | 11003-12 | |
| Fine iris scissor curved | FST | 14095-11 | |
| Fine iris scissor | FST | 14094-11 | |
| Mayo scissors | FST | 14010-15 | |
| Artery scissors ball tip 11.5 cm | FST | 14080-11 | |
| Tissue forceps | FST | 11021-14 | |
| Surgical blade No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon steel |
| Surgical blade handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1 ml | ARTSANA | Disposable | |
| Temgesic, buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3 mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
References
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