Introduction
De plasmamembran, liksom de många intracellulära membran, tjänar som hinder som skiljer två vattenhaltiga kamrar. I fallet med plasmamembranet, är separationen mellan utsidan och insidan av cellen; för intracellulära organeller är det mellan cytoplasman och organell lumen. Till exempel, separerar det endoplasmatiska retiklet (ER) membranet en oxiderande miljö inom lumen av ER från ett cytosoliskt reducerande miljö 1. Membranproteiner syntetiseras på ER-associerade ribosomer, och uppnå sin slutliga topologi inom ER-membranet 2. Förvärvet av lämpliga membran orientering och topologi för proteiner är avgörande för deras normala funktion. Korrekt topologi tillåter relevanta domäner av membranproteiner för att interagera med deras bindningspartners, tillåter den kritiska post-translationella modifieringar för att uppträda, och i fallet av plasmamembranproteiner, tillåter cellen att interagera med och svara to dess miljö. För att till fullo uppskatta funktionen av ett membranprotein, är det helt klart nödvändigt att veta hur detta protein är orienterade i förhållande till membranet inom där den finns, dvs dess membran topologi. Förutom förvärvet av grundläggande vetenskaplig kunskap, förståelse topologin av en membranprotein och vilka aspekter av ett protein yta utsätts för olika miljöer har markerat kliniska implikationer eftersom membranproteiner utgör merparten av farmakologiska mål 3. Tills nyligen, metoder för att bestämma membranprotein topologi har krävt betydande investeringar i tid och pengar, eller krävt reagens som är svåra att få tag på.
Både experimentella och i silico metoder har använts för att bestämma membrantopologin av proteiner som är bosatta inom plasmamembranet. Eftersom de första förutsägelser av membranöverbryggande domäner baserat på den utvärderade hydrofobicitet av indidubbla aminosyror 3, många prediktiva algoritmer finns nu tillgängliga på internet, och helt enkelt kräver kunskap om proteinets aminosyrasekvens. Men antaganden är ofta centralt för sådana modelleringsprogram, antaganden som kan leda till felaktiga uppdrag av topologi 4,5. Dessutom, även om dessa datorbaserade förutsägelser kan försöksvis tilldela membranomspännande regionerna, de inte alltid avgöra om amino- eller karboxitermini av proteiner är i cytoplasman, organell lumen eller cell exteriör. Även med ökad datorkraft, och användningen av maskininlärningsalgoritmer 6, sådana uppgifter är fortfarande en modell, och måste valideras med hjälp experimentellt förvärvade data. Direkt experimentell bestämning av membran topologi har genomförts med hjälp av paneler av monoklonala antikroppar med kända epitoper fördelade över hela proteinet, där bedömning av deras immunreaktivitet har gjorts före och efter cell permeabilization. Dettatillvägagångssätt kräver en uppsättning av antikroppar, som kanske inte är tillgängliga för proteinet av intresse.
En alternativ strategi är att ingenjör epitopmärkningar sådana som myc eller hemagglutinin (HA) i olika platser i hela proteinet, återigen följt av bestämning av immunreaktivitet före och efter membran permeabilization. Förutom immunogena taggar, har enzymatiska taggar (inklusive alkaliskt fosfatas, β-galaktosidas, eller β-laktamas) och kemiska modifieringar såsom cystein skanning alla använts för att bestämma membranprotein topologi 7,8. En ytterligare metod som används för topologisk kartläggning av plasmamembranproteiner bygger på ett något annorlunda sätt att epitopmärkningar. I denna metod markörsekvensen är den N-kopplad glykosylering konsensussekvensen NXS / T. Eftersom glykosylering sker endast när en sådan sekvens är närvarande i lumen i den biosyntetiska vägen, närvaron av etiketten i en luminal kontraett cytosoliskt utrymmet är lätt observeras som en massförskjutning på SDS-PAGE-geler. Ett sådant tillvägagångssätt har tillämpats på multispanning jonkanal CFTR 9. Medan alla dessa angreppssätt har använts, är det tydligt att de alla kräver betydande investeringar i molekylärbiologi för att generera och sekvens de många konstruktioner.
För att bestämma topologisk information om transmembranproteiner som ligger inom intracellulära organeller har visat sig vara mer utmanande. Tillämpningen av fluorescensbaserade tekniker har dock gjort bestämning av membran topologi mycket enklare. Tekniken med bimolekylära fluorescens komplettering (BiFC) bygger på samspelet mellan två icke-fluorescerande fragment av ett fluorescerande protein, återställa de fluorescerande egenskaper som protein 10. Även initialt beskrivits för bestämning av protein-proteininteraktioner in vivo 10, har denna metod också utnyttjatsatt bestämma membranprotein topologi i växtceller 11. Men detta synsätt är också tidskrävande eftersom det kräver generering av inte bara fusionsproteiner med proteinet av intresse, men också en mängd olika fusionsproteiner riktade till cytosolen eller organell lumen, och kräver kunskap om vilka intracellulära membran proteinet av intresse är bosatt i .
Ett alternativt enklare metod för att fastställa membranprotein topologi har beskrivits 12. Analysen, Fluorescence Proteas Protection (FPP) kräver generering av ett fusionsprotein mellan GFP och genen av intresse. Systemet är baserat på den relativa tillgängligheten av icke-specifika proteaser till GFP-del; beroende på om GFP är skyddad från proteolys genom bosatt i lumen av intracellulära organeller eller är utsatt för proteolys genom att vara närvarande i cytosolen. Således, om GFP-delen på proteinet av intresse är vänd mot cytoplasman, den kommer att utsättas förproteasaktivitet och fluorescenssignalen förloras. Omvänt, om GFP-delen på proteinet av intresse är vänd mot en miljö "skyddade" från proteaset (såsom Golgi lumen) sedan fluorescenssignalen kommer att bestå.
Att tillåta proteaser för att komma in i cellen, men inte gå in intracellulära membran fack kolesterol bindande drog digitonin används. Kolesterol är den dominerande sterol i vertebrater, och är specifikt berikad på plasmamembranet relativt intracellulära avdelningar. Den glykosid toxin, digitonin, utvinns ur växten Digitalis purpurea. Digitonin har en affinitet för kolesterol rika membran, där det leder till selektiv membran permeabiliztion 14,16 (Figur 1). Förutom att tillåta utförsel av små cytosoliska komponenter, digitonin permeabilization tillåter också införandet av exogena molekyler, såsom proteinas K eller trypsin. FPP-protokollet drar fördel av fact att plasmamembranet innehåller upp till 80% av cellulär kolesterol 17, medan andra organeller, såsom ER, Golgi, endosomer, mitokondrier, som har mycket låg kolesterolhalt, förblir intakta 14. Den selektiva inkorporeringen av kolesterol in i plasmamembranet har observerats i många eukaryota celler, vilket medger användningen av digitonin-beroende plasmamembranet permeabilisering i så skilda eukaryota arter som S. cerevisiae människors 14,18. FPP-analysen ger en enkel, snabb och ganska robusta sätt att bestämma (a) huruvida ett protein är membranbundna / associerade eller fritt diffunderbart i cytosolen och (b) vilken domän av en membranprotein ansikten cytosolen eller organell lumen. Skulle ett membranprotein har flera inriktningar, kommer signalen uppstå från den dominerande formen och mindre former kommer inte att upptäckas. Samtidigt som det kan finnas viss oro att tillsatsen av en GFP-del till proteinet på intresse kan påverka dess funktion och/ Eller subcellulära lokalisering, detta är faktiskt mer teoretisk än verklig. Faktiskt många studier har tydligt visat att GFP taggen inte ändrar egenskaperna hos proteinet 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generation och validering av fluorescerande protein chimärer
- Append grönt fluorescerande protein (GFP) till amino- eller karboxylterminalerna av proteinet av intresse med användning av vanliga rekombinant-DNA-strategier 13.
OBS: Även om vi har använt GFP i stor utsträckning, andra varianter såsom cyan fluorescerande protein (GFP), gulfluorescerande protein (YFP), DsRed och mCherry kan användas. Förbättringar i fluorofor fällbara effektivitet, ljusstyrka och foto ständigt görs, och utredare bör använda sig av den senaste generationens konstruktioner.- Bekräfta korrekta DNA-sekvensen och se till att GFP-delen är i ram med det intressanta proteinet. Utför sekvense använda standard rekombinant DNA strategier 21.
OBS: Många institutioner har core DNA anläggningar, som utredaren uppmuntras att kontakta för ytterligare information. - För enkla eller dubbla pass membranproteiner, genererabåde amino- och karboxylterminala versionerna av fusionsproteinerna 19.
- För flera överbryggande proteiner sätter GFP inom förmodade extramembrane loopar, liksom terminaler. Var särskilt försiktig vid generering transmembrana chimärer med fluorescerande fusionsproteinet fäst till aminoterminalen av målproteinet som signalsekvenser ofta spjälkas genom proteolys när proteinet har passerat genom ER translocon.
- I fallet med ännu existerande signalsekvenser, sätter det fluorescerande fusionsproteinet distalt om klyvningsstället för att generera ett moget protein innehållande en intakt aminoterminal taggade fluorescerande protein. Används standardiserade rekombinanta DNA-strategier för generering av chimärer 21.
- Bekräfta korrekta DNA-sekvensen och se till att GFP-delen är i ram med det intressanta proteinet. Utför sekvense använda standard rekombinant DNA strategier 21.
- Bestäm närvaro av tillräckligt med lämpligt lokaliserad fluorescerande signal i cellinjen av intresse.
- Observera cellerna under epifluorescensmikroskopi använder den inneboende fluorescens av GFP i lämpåt filter ställa villkor. För GFP filtersatser som omfattar 510-560 nm, bekräftar att rätt filter används för fluoroforen anställd.
OBS: En tillräcklig signal uppnås när bedömning med ögat ger en tillräckligt stark signal om att cellstrukturen inom vilken signalen bosatt lätt löses ovanför bakgrunden. Dessutom färgningsmönstret av GFP-protein bör vara konsistent med markörer för lämplig organell, och helst identisk med den för det nativa omärkt protein.
- Observera cellerna under epifluorescensmikroskopi använder den inneboende fluorescens av GFP i lämpåt filter ställa villkor. För GFP filtersatser som omfattar 510-560 nm, bekräftar att rätt filter används för fluoroforen anställd.
- Ta reda på om en stabil eller transient transfektion strategi kommer att utnyttjas baserat på proteinet som utvärderas.
OBS: Stabila transfektanter råd generellt lägre nivåer av uttryck än gående system. Även transient uttryck ger högnivåexpression av proteiner och ökning signalintensiteten (~ 5-24 h efter transfektion, beroende på proteinet), det kan också leda till överuttryck artefakter såsom protein aggrnare eller mättnad av protein inriktning vägar, vilket leder till felaktiga subcellulära lokalisering.
2. Transfektion av celler och cellodling
OBS: En mängd olika celler är mottagliga för FPP analys, inklusive HEK293, HeLa, COS-7 och CHO-celler 14. Följande beskrivning är baserad på att uttrycka membranproteiner i HEK293-celler.
- Grow humana embryonala njurceller (HEK293) som vidhäftande monoskikt i 6 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS), 1% natriumpyruvat, och 250 | ig / ml penicillin / streptomycin vid 37 ° C med 5% CO2. Utför allt arbete med celler i ett laminärt flöde vävnadskultur huva. Odla celler i odlingsmedium tills ~ 80% konfluenta i en T-75 kolv.
- Transfektera celler använder någon standard högeffektiv, låg toxicitet transfektion metod, inklusive lipid-, viral- eller elektroporation-baserade tekniker för att generera transient eller stabilt uttryck. Typiskt 2 pg av plasmid-DNA per 1 x 10 6 celler ger god reproducerbar proteinuttryck. Upprätt celler för 5-48 h i lämpligt vävnadsodlingsmedium vid 37 ° C i en CO 2 kapabel vävnadsodlingsinkubator.
- Övervaka celler för expression av GFP-fusionsproteinet med användning av epifluorescensmikroskopi, använder den inneboende fluorescenssignal av GFP, med användning av lämpliga filteruppsättningar enligt tillverkarens protokoll. Fluorescenssignalen når oftast ett maximum inom 24-72 timmar efter transfektion. Använd celler när fluorescenssignalen når en maximal nivå. Övervaka proteinexpressionsnivåer genom immunoblotanalys med användning av antikroppar riktade mot antingen det intressanta proteinet eller GFP-delen.
- För experimentella analysplatt celler på belagda täck. Visa antingen under en konfiguration levande cell eller efter fixering och montera på mikroskopi diabilder. Plate celler för att uppnå 60% -80% konfluens inom 24-48 h.
- Coat täckglas med poly-lysin-lösning (0,1 mg / ml), så att hela ytan täcks. Inkubera i 30 min under en ultraviolett ljus vid rumstemperatur, följt av 60 min i en cellodlingsinkubator vid 37 ° C. Ta bort överflödig poly-lysin och skölj täck i PBS 3 gånger.
- Alternativt, platta cellerna på en cover-glas kamrar bestående av cellodlingsplattor med en optisk glas botten för att tillåta direkt avbildning med oljeimmersions mål. Själva mikroskopi inställning beror på vilken utrustning som finns tillgänglig för utredaren, men bör kunna snabba förändringar lösnings. Beroende på celltyp och cellform, bör cellerna vara cirka 60-90% sammanflytande vid tiden för FPP-analysen.
3. Fluorescensmikroskopi Setup
- Använd en hög numerisk apertur (NA) oljeimmersionsobjektiv för maximal signal insamling och rumslig upplösning, såsom en 60X, 1,42 NA oljeimmersionsobjektiv. Använd the efter laser för att stimulera fluoroforema: Argon gas 488 nm (GFP och YFP) och 561 diod (RFP, mCherry).
- Bestäm optimal exponering, förstärkning och avskiljningsgrad av bilder för varje konstruktion. Justera laserintensitet och exponeringstid för att minimera fotoblekning (se steg 7.1.2).
- För studier med multipla fluoroforer (t.ex. en löslig markör för membran permeabilization i samförstånd med en membranprotein markör), väljer lämplig filteruppsättningar för att minimera signal överhörning och maximera signal-brusförhållande.
4. Upprätta optimala förutsättningar för Plasma Membrane Permeabilization
- Avlägsna cellodlingsmediet från celler som uttrycker endast lösliga fluorescerande proteiner (t.ex. EGFP, DsRed). Tvätta cellerna 3 gånger (1 min vardera) i KHM-buffert (110 mM kaliumacetat, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Utför experiment med celler och samtliga reagens vid rumstemperatur.
- Placera cellerna on täck (se steg 2.4) i KHM buffert på ett fluorescensmikroskop scenen och samla den första bilden, som representerar kontroll "icke-permeabilized" stadiet.
- För att selektivt permeabilize plasmamembranet, till digitonin (30 | iM) i KHM buffert till cellerna. BEGJUTA celler med buffert (buffert + digitonin) vid en hastighet av 5 ml / min under 10-60 sek.
- Bestäm den optimala digitonin koncentrationen genom att gradvis öka koncentrationen av digitonin. Den optimala digitonin koncentration uppnås när det finns total förlust av fluorescenssignal från lösligt EGFP inom 10-60 sekunder av digitonin ansökan. För många celler tillämpning av 10-50 iM digitonin är tillräcklig för att permeabilisera cellmembranet.
- För alla program använder lägsta möjliga koncentration av digitonin. Samla bilder efter digitonin permeabilisering för permeabiliserad bakgrundssignal.
- Kontrollera att GFP-proteinet chimär av intresse är membran iintegrerades genom att bekräfta cellulär retention av fluorescenssignalen efter digitonin permeabilisering av plasmamembranet 16.
- Uttrycker en organell specifikt fluorescerande protein 23. Mitokondriella proteiner fungerar bra i detta avseende 16, t.ex. pDsRed2-Mito vektor. Bestäm optimala expressionsbetingelser som beskrivs i steg 2.1.
- Kontrollera att digitonin koncentrationen är lämplig för den celltyp som används genom att säkerställa att morfologin av intracellulära organeller förblir konstant över långvarig (upp till 60 min) exponering för digitonin.
OBS: Använd standard immunofluorescensmikroskopi protokoll som använder antikroppar mot olika cellulära fack, såsom lysosomer (t.ex. LAMP1), Golgi (t.ex. TGN38), endoplasmatiska retiklet (t.ex. kalnexin), endosomer (t.ex. Rab5), mitokondrier (t.ex. cytokrom c). Om intracellulär organell morfologi / integritets förändringar dramatiskt over 60 min, är det troligt att den digitonin koncentrationen var alltför hög och kräver en minskning av digitonin koncentration och / eller exponeringstid.
OBS: Digitonin är giftigt vid inandning och hudkontakt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE).
5. Proteas Behandling av fluorescerande proteiner
- Tvätta cellerna i KHM buffert och sedan lägga proteas (proteinas K; 50 ug / ml i KHM buffert) direkt på cellerna. BEGJUTA celler vid en flödeshastighet av 5 ml / min med användning av en gravitations matas perfusionssystem att kontinuerligt bad beredningen.
- Butikslösningar i 50 ml sprutor och polyetenrör anslutet oberoende reservoarer till ett grenrör med en enda utlopp vid badet (5 ml / min flödeshastighet). Placera ett sug pipett för att hålla en konstant (0,5 ml) bad volym och uppnå lösning utbyte genom att manuellt växla mellan perfusion reservoarer.
- Samla bilder för att avgöra om fluorescent signal kvarstår eller försämras. En förlust av> 90% av den initiala signalintensiteten över 30-60 sek är förenlig med proteolytisk nedbrytning av GFP-proteinchimär (se Representativa resultat).
- Om ingen signal nedbrytning observeras med proteinas K, när en sådan förlust förväntas, byt proteinas K-lösning med trypsin (4-8 mM) i KHM buffert. Om så är nödvändigt, använda en blandning av proteinas K och trypsin. Det finns inget behov för att släcka proteasaktivitet.
6. alternativt tillvägagångssätt för Plasma membranproteiner med externa domäner
- För plasmamembranproteiner, utför analysen för externa fluorescerande proteiner chimärer före digitonin permeabilisering. Tvätta cellerna på täckglas i KHM buffert (5 ml / min x 3 min), och ta en bild för pre-proteas behandling och kvantifiera pre-proteas fluorescenssignal som i steg 7.
- Exponera celler att proteas (proteinas K; 50 ^ g / ml eller trypsin 4-8 mM i KHM buffert) i than frånvaro av digitonin genom perfusion av cellerna med KHM media innehållande proteas (flödeshastighet 5 ml / min). Samla bilder av fluorescerande proteinet, för att avgöra hur snabbt signalen försvinner eller hur länge signalen kvarstår.
- Före digitonin permeabilisering, släcka all proteasaktivitet, genom tvättning av cellerna tre gånger (1 min var) i cellodlingsmedier innehållande 10% serum (FBS).
- Tvätta cellerna genom perfusion med KHM buffert (flödeshastighet av 5 ml / min) under 2 min. Skaffa en pre-permeabilisering bild. Permeabilisera cellmembran såsom beskrivits i Steg 4.
- Samla bilder efter proteas tillägg som beskrivs i steg 5.
7. Bildanalys
- Använd ett inverterat mikroskop med förmåga att "levande cell" inspelning, där förlust av fluorescenssignal kan övervakas i realtid. För kontinuerlig övervakning, anställa identiska parametrar (exponeringstid, gain, laser intensitet, etc.).
- Bestäm experimental parametrar genom att observera fluorescenssignalen från GFP-proteinet av intresse under kontroll förhållanden (dvs, KBH buffert ensam). Justera förstärkningen, laserintensitet och exponeringstidsinställningarna i datorstyrd mikroskop för att säkerställa att det inte finns någon märkbar förlust av signalintensitet under en 10-20-minutersperiod.
OBS: Signal intensiteten är inte ett absolut värde, men bygger på mikroskopsystemet och inställningar tillgängliga för varje PI. Övervaka förändringar i relativa fluorescensintensiteten.
- Bestäm experimental parametrar genom att observera fluorescenssignalen från GFP-proteinet av intresse under kontroll förhållanden (dvs, KBH buffert ensam). Justera förstärkningen, laserintensitet och exponeringstidsinställningarna i datorstyrd mikroskop för att säkerställa att det inte finns någon märkbar förlust av signalintensitet under en 10-20-minutersperiod.
- Alternativt behandla celler vid bestämda tidpunkter i digitonin följt av proteas, och fixa celler före montering på täck för avbildning. Bestäm tidpunkter empiriskt följa instruktionerna i steg 4 och 5. För den inledande undersökningen, börjar på 0, 30, 60, 120 och 300 sek efter tillägg av digitonin eller proteas.
- Fix-celler (20 min vid rumstemperatur) med användning av en tillräcklig mängd fixativ (3,7% paraformaldehyd i PBS) för att till fullo dränka the celler.
- Släck restparaformaldehyd genom sköljning celler med PBS innehållande 20 mM glycin (3 x 5 min).
- Montera täck genom att ta bort överflödig vätska från täckglas och invertera täck på 50 il monterings media på ett glas objektglas för avbildning. Låt objektglasen torka över natten innan avbildning.
- Samla fluorescens mikroskopi bilder (under lämpliga filter apparater som är kompatibla med fluoroforen som används) med hjälp av videobilden capture-funktionen på en datorstyrd fluorescensmikroskop.
- Kvantifiera fluorescerande signalstyrkorna som funktion av inkubation skick. Erhåll medelvärdet pixelintensiteten inom ett område av intresse (ROI) som innesluter en individuell cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plasma Membrane Permeabilization
Effektiv plasmamembranet permeabilisering bestäms av användningen av lösliga fluorescerande proteiner (t.ex. GFP, DsRed) (steg 4). Dessa proteiner, uttryckt i celler, är fria att diffundera i cytosolen, och försvinner när plasmamembranet permeabilized använder digitonin (Figur 2). En fullständigt försvinnande av fluorescerande signal bör ske inom 10-60 sekunder av digitonin ansökan. Bekräftelse på att proteinet av intresse är förknippad med intracellulära organeller uppnås genom att notera bibehållandet av fluorescerande signal efter digitonin permeabilization.
Proteasbehandling
Efter framgångsrika generationen av fluorescerande chimärer mellan proteinet av intresse och fluorescerande protein (GFP, YFP, etc.) (steg 1) och uttryck av det fluorescerande proteinet i celler (steg 2), behandling av permeabiliserade celler med proteas kommer att ge information om huruvida fluoroforen (och dess angränsande proteindomän) är i cytosolen och tillgänglig för proteasspjälkning, eller ligger inom en organell lumen och därmed skyddas från proteasspjälkning (Steg 4). LMTK2 är ett membran förankrad kinas 15 och fluorescens proteas skyddsanalyser har använts för att bestämma dess membran topologi 16. Karboxylgruppen svans LMTK2 var smält till GFP och uttryckas transient. Fluorescerande LMTK2-GFP-signal förlorades snabbt efter tillsats av proteinas K, som anger läget för karboxylterminalen av LMTK2 är belägen inuti cytosolen (Figur 3). Caveolin-GFP (Cav1-GFP) 17 är ett plasmamembranprotein med en GFP-bunden till den cytosoliska domänen. Som med LMTK2, är signalen från caveolin-YFP digitonin okänslig, men känsliga för efterföljande tillsats av proteas (Figur 3).
t "> luminal lösliga proteiner kan också identifieras med användning av FPP-protokollet. I detta exempel är den kvarhållande i ER signalen KDEL bifogad DsRed. I motsats till signalerna från LMTK2 och caveolin, är okänslig för både signalen från KDEL-DsRed digitonin och proteas, såsom digitonin är oförmögen att permeabilisera ER-membranet och den fluorescerande signalen är skyddad från proteas nedbrytning. Ett exempel på en membrandomän belägen inuti hålrummet i en organell ges av den mitokondriella proteinet är subenhet VIII av human cytokrom c oxidas 18,19. pDsRed-Mit, kodar det röda fluorescerande proteinet från Discosoma sp. fuserad till mitokondriell målsökningssekvensen från cytokrom c oxidas. I celler som uttrycker pDsRed-Mito, är fluorescerande signal ses i cellen. Efter digitonin permeabilization, fluorescenssignalen förknippas med pDSRed-Mito är stabil. Dessutom efter tillägg av proteinas K, fluorescens associerad med pDsRed-Mito kvarstår, conförenlig med fluoroforen i mitokondrierna och inte exponeras till cytosolen och sålunda skyddas från proteasaktivitet (Figur 3).Extracellulära domänerna
Proteas behandling av icke-permeabiliserade celler bör snabbt släcka fluorescensen signal när den fluorescerande delen fäst till ett membranprotein är vänd mot cellens yttre. Den glykosylfosfatidylinositol (GPI) förankrat protein PrP 20 tjänar som ett utmärkt exempel. En konstruktion innehållande den gula fluorescerande protein (YFP) fäst till aminoterminalen av PrP (YFP-PrP) 21,22, en generös gåva från Dr. Ehud Cohen, från Hebreiska universitetet i Jerusalem. Före proteasbehandling, den fluorescerande signalen från den extracellulära YFP var ljus (Figur 4). Efter proteasbehandling, försvann den extracellulära fluorescenssignalen snabbt.
Tid Överväganden
Figur 1: Selektiv permeabilisering av plasmamembranet (a) tecknad modell av FPP-analysen visar en enda cell går igenom det experimentella protokollet.. Den röda symbolen representerar rött fluorescerande protein (RFP) i cytosolen, de gröna och blå symboler representerar transmembranproteiner med fluorescerande taggen antingen inför organellen lumen (blå) eller cytosolen (grön). (B) Efter digitonin permeabilization, gratis cytosolisktproteiner diffundera bort, vilket minskar RFP signalen. (C) Efter applicering av proteinas K är cytosoliskt grön signal degraderas, medan den blå signalen skyddas från nedbrytning genom sin närvaro i organell lumen.
Figur 2: Digitonin behandling permeabilizes plasmamembranet och frisätter cytosoliskt GFP (a) tecknad av en enda cell som uttrycker lösligt GFP, före och efter digitonin behandling.. (B) Digitonin behandling permeabilizes plasmamembranet och frisätter cytosoliskt GFP. En region av intresse (ROI) ritas runt CHO-celler som uttrycker lösligt GFP. Efter behandling med digitonin (50 M), har bilder tagna före och efter tillsats av digitonin, och vid de angivna tidpunkterna. Scale bar, 10 | im. (C) kvantifiering av fluoreScence intensiteter av den fullständiga tidsserier (af) visas.
Figur 3: FPP avslöjar topologin i endosomala protein LMTK2 (a) tecknad av FPP som visar förlust av DsRed (röda bollar) men retention av LMTK2-GFP (gröna bollar) efter digitonin permeabilisering, följt av signalförlust på tillämpning av proteinas K. . (b) FPP analys av CHO celler som uttrycker DsRed och LMTK2-GFP. Bilder togs före och efter digitonin behandling, och efter proteinas K, såsom anges. Skala bar: 10 pm.
Figur 4: (a) tecknad modell som visar topologin och läget av YFP-PrP (grön) före och efter proteinas K behandling. CHO-celler som uttryckerYFP-PrP utsattes för proteinas K för 100 sek. (B) Bilder tagna före och efter proteasbehandling visas på de angivna tider. YFP-PrP-signalen var helt förlorad efter proteas i frånvaro av digitonin. Gul visar regionen av intresse (ROI) som användes för kvantifiering som visas i (c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Korrekt orientering och topologi av membranproteiner är avgörande för deras rätta funktion. Trots vikten av att förstå membranprotein topologi, det finns många proteiner för vilka sådana uppgifter saknas helt. FPP ger ett enkelt och effektivt sätt att bestämma membranprotein topologi, och en som kan utföras av de flesta laboratorier. FPP tillvägagångssätt ger betydande fördelar jämfört med tidigare metoder för att bestämma protein topologi. Till exempel finns det ingen anledning att ha en panel av multipla antikroppar riktade igen olika domäner av proteinet av intresse 31. I många fall en sådan panel av antikroppar inte är tillgänglig; Detta gäller särskilt för nyligen klonade proteiner. Som analysen kan utföras på en enda cell nivå, inte krävs stora biokemiska mängder protein för nedströms biokemiska analyser såsom proteolys eller SDS-PAGE. I själva verket är relativt få transfekterade celler som behövs för att entydigt tilldelaen topologi till proteinet av intresse. Detta är viktigt om utredaren utvärderar topologi i svåra att transfektera celler som epitelceller eller nervceller. Enkel tillägg av en GFP-del till antingen karboxyl- eller aminoterminalen av proteinet kan lätt uppnås genom att använda många kommersiellt tillgängliga GFP innehåller plasmider, och i de flesta fall, inte tillägg av GFP-delen inte hindra en korrekt proteinveck eller subcellulär lokalisering. Dock måste utredaren bekräfta att detta är sant för sitt protein, eftersom det finns risk för GFP att påverka proteinet av intresse 23,24. Många proteiner finns redan tillgängliga som GFP fusionsproteiner, vilket kräver minimal extra ansträngning för att initiera topologiska studier. Även kontinuerlig övervakning av fluorescens ger en snabb och effektiv metod för att bestämma protein topologi, för utredarna som inte har tillgång till live-cell imaging utrustning, är analysen lätt anpassas till en formaldehydfixering appmört använder standard epifluorescence av konfokalmikroskopi.
Det finns dock vissa begränsningar i användbarheten av FPP-analysen. Bör proteolytisk behandling eller andra posttranslationella modifieringar resultera i något olika membran topologier för proteinet av intresse kommer FPP-analysen endast bedöma den dominerande proteinform. Dessutom kan lägga en GFP molekyldel till termini av vissa proteiner påverka deras funktion, t ex störa karboxylterminala PDZ-domäner. Ändå ger FPP-analysen ett enkelt sätt att upprätta orientering och topologi i många membranproteiner.
Det är viktigt att de första försöken utföras för att bestämma rätt koncentration av digitonin att frigöra intracellulära lösliga GFP. Om GFP inte diffunderar ut ur cellen efter digitonin ansökan, bör ökas koncentrationen av digitonin successivt, för att bestämma den minsta koncentration redras för att underlätta frisättning. Dock kommer för mycket digitonin påverka morfologin av intracellulära vesiklar, vars integritet bör bekräftas efter digitonin ansökan. Organeller i vissa celler är mycket känsliga och kan kräva en mer stabiliserande buffertsammansättning 25. Om fluorescenssignalen från chimären som utvärderas är låg, välja en enda klon med en högre expressionsnivå, eller utför en övergående uttryck, kommer ofta att öka signalstyrkan till en acceptabel nivå. Söker ut nyare, bör ljusare plasmider också beaktas med låg signalstyrka. Slutligen bör man se till att signalförlust sett beror på proteas nedbrytning och inte fotoblekning av fluoroforer. Minska ljusintensitet och / eller förvärv takten kommer att bidra till att minska fotoblekning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
- Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
- Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems. Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).
- Kyte, J., Doolittle, R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).
- Ott, C. M., Lingappa, V. R. Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict. J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).
- Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins. The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).
- Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10, 673-676 (1997).
- Geest, M., Lolkema, J. S. Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).
- Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36, 148-171 (2005).
- Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Zamyatnin, A. A., et al. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 3, 205-210 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. Do you know the sex of your cells? American journal of physiology. Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).
- Wang, H., Brautigan, D. L. A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2. J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).
- Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2). Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).
- Tagawa, A., et al. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters. J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol. 5, 635-642 (1995).
- Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases. J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).
- Ben-Gedalya, T., et al. Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments. J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).
- Rogers, M., et al. Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system. J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).
- Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER. Traffic. 4, 491-501 (2003).
- Brandee, A. P., et al. Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
