Introduction
Las membranas de plasma, así como las numerosas membranas intracelulares, sirven como barreras que separan dos compartimentos acuosos. En el caso de la membrana plasmática, la separación es entre el exterior y el interior de la célula; para orgánulos intracelulares es entre el citoplasma y el lumen de orgánulos. Por ejemplo, la membrana del retículo endoplasmático (ER) separa un ambiente oxidante dentro del lumen del ER a partir de un ambiente reductor 1 citosólica. Las proteínas de membrana son sintetizadas en los ribosomas ER-asociados, y lograr su topología final dentro de la membrana del RE 2. La adquisición de la orientación de la membrana apropiado y la topología de proteínas es crítica para su función normal. Topología correcta permite dominios correspondientes de proteínas de membrana para interactuar con sus parejas de unión, permite modificaciones post-traduccionales críticos que se produzcan, y en el caso de proteínas de membrana de plasma, permite a la célula para interactuar con y responder to su entorno. Para apreciar completamente la función de una proteína de la membrana, es claramente imprescindible saber que la proteína está orientado con respecto a la membrana dentro de la cual reside, es decir, su topología de la membrana. Además de la adquisición de conocimiento científico básico, la comprensión de la topología de una proteína de la membrana y qué aspectos de una proteína de superficie están expuestos a diferentes ambientes ha marcado implicaciones clínicas ya que las proteínas de membrana constituyen la mayoría de dianas farmacológicas 3. Hasta hace poco, los enfoques para la determinación de la topología de la proteína de membrana han requerido una inversión considerable en tiempo y dinero o han requerido reactivos que son difíciles de conseguir.
Ambos enfoques experimentales y en silico se han empleado para determinar la topología de la membrana de las proteínas que residen dentro de la membrana plasmática. Desde las primeras predicciones de dominios de membrana que abarca basadas en la hidrofobicidad evaluado de indiviaminoácidos dobles 3, numerosos algoritmos predictivos ya están disponibles en el Internet, y simplemente requieren el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, los supuestos son a menudo el centro de este tipo de programas de modelado, los supuestos que pueden conducir a las asignaciones incorrectas de topología 4,5. Además, aunque estas predicciones basadas en la informática pueden asignar provisionalmente regiones que abarcan la membrana, que no siempre determinan si el amino o carboxi de las proteínas están en el citoplasma, orgánulos o lumen exterior de la célula. Incluso con el aumento de potencia de cálculo, y el uso de algoritmos de aprendizaje 6, esos datos sigue siendo un modelo, y debe ser validado a partir de datos experimentales adquiridos. Determinación experimental directa de topología de la membrana se ha realizado usando paneles de anticuerpos monoclonales con epítopos conocidos distribuidas a lo largo de la proteína, donde se ha hecho la evaluación de su inmunorreactividad antes y después de la permeabilización celular. Esteenfoque requiere un conjunto de anticuerpos, que pueden no estar disponibles para la proteína de interés.
Una estrategia alternativa es diseñar epítopo etiquetas tales como myc o hemaglutinina (HA) en distintos lugares de la proteína, de nuevo seguido por la determinación de la inmunorreactividad antes y después de permeabilización de la membrana. Además de las etiquetas inmunogénicas, etiquetas enzimáticas (incluyendo la fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, o β-lactamasa) y modificaciones químicas como el escaneo cisteína han sido empleados para determinar la proteína de membrana topología 7,8. Un método adicional empleado para el mapeo topológica de proteínas de membrana de plasma se basa en un enfoque ligeramente diferente a etiquetas de epítopo. En este método, la secuencia de etiqueta es la secuencia consenso de glicosilación ligada a N NXS / T. Puesto que la glicosilación sólo se produce cuando tal secuencia está presente en el lumen de la vía de biosíntesis, la presencia de la etiqueta en un luminal frenteun compartimento citosólico se observa fácilmente como un cambio masivo en geles de SDS-PAGE. Este enfoque ha sido aplicado al canal CFTR 9 ion multispanning. Aunque se han utilizado todos estos enfoques, es claro que todos ellos requieren inversiones considerables en la biología molecular y la secuencia para generar los constructos múltiples.
Para determinar la información topológica con respecto a las proteínas transmembrana localizados dentro de los orgánulos intracelulares ha demostrado ser más difícil. La aplicación de tecnologías basadas en fluorescencia sin embargo, ha hecho que la determinación de la topología de la membrana mucho más simple. La técnica de la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) se basa en la interacción entre dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente, la restauración de las propiedades fluorescentes de que la proteína de 10. Aunque se ha descrito inicialmente para la determinación de las interacciones proteína-proteína in vivo 10, este enfoque también se ha utilizadopara determinar la topología de la proteína de membrana en células de plantas 11. Sin embargo, este enfoque también es intensiva en tiempo, ya que requiere la generación no sólo de proteínas de fusión con la proteína de interés, sino también una variedad de proteínas de fusión dirigidas al citosol u orgánulo lumen, y requiere el conocimiento de que intracelular membranas de la proteína de interés reside en .
Un enfoque alternativo más sencillo para determinar la topología de proteínas de membrana se ha descrito 12. El ensayo, la fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP) requiere la generación de una proteína de fusión entre GFP y el gen de interés. El enfoque se basa en la accesibilidad relativa de las proteasas no específicas a la fracción GFP; dependiendo de si GFP está protegido de proteólisis por residente en el lumen de los orgánulos intracelulares o se expone a la proteolisis por estar presente en el citosol. Por lo tanto, si el resto GFP en la proteína de interés se enfrenta el citoplasma, que estará expuesto aactividad de la proteasa y la señal de fluorescencia pierden. Por el contrario, si el resto GFP en la proteína de interés se enfrenta a un entorno "protegido" de la proteasa (como el lumen de Golgi), entonces persistirá la señal de fluorescencia.
Para permitir proteasas para entrar en la célula, pero no entrar en compartimentos intracelulares de membrana se utiliza el digitonina drogas unión colesterol. El colesterol es el esterol dominante en los vertebrados, y se enriqueció específicamente en la membrana plasmática con respecto a los compartimentos intracelulares. La toxina glicósido, digitonina, se extrae de la Digitalis purpurea planta. Digitonina tiene una afinidad por las membranas ricas de colesterol, donde se lleva a membrana selectiva permeabiliztion 14,16 (Figura 1). Además de permitir la salida de pequeños componentes citosólicos, digitonina permeabilización también permite la entrada de moléculas exógenas, tales como proteinasa K o tripsina. El protocolo FPP se aprovecha de la fact que la membrana plasmática contiene hasta 80% de colesterol celular 17, mientras que otros orgánulos, tales como ER, Golgi, endosomas, las mitocondrias, que tienen muy bajo contenido de colesterol, 14 permanecen intactos. La incorporación selectiva de colesterol en la membrana plasmática se ha observado en muchas células eucariotas, permitiendo el uso de la membrana plasmática de permeabilización digitonina-dependiente en diversas especies eucariotas tales como S. cerevisiae a humano 14,18. El ensayo FPP proporciona un medio simple, rápido y bastante robustas de determinar (a) si una proteína es unida a la membrana / asociado o libremente difusible en el citosol y (b) qué dominio de una proteína de membrana se enfrenta el citosol o de orgánulos lumen. En caso de una proteína de membrana tienen múltiples orientaciones, la señal será surgir de la forma dominante y formas menores no será detectado. Si bien puede haber cierta preocupación de que la adición de un resto de GFP a la proteína de interés puede afectar a su función y/ O localización subcelular, esto es en realidad más teórico que real. De hecho, muchos estudios han demostrado claramente que la etiqueta de las buenas prácticas agrarias no altera las propiedades de la proteína 19,20.
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Protocol
1. Generación y Validación de quimeras de proteína fluorescente
- Anexar la proteína verde fluorescente (GFP) al extremo amino o carboxilo de la proteína de interés el uso de estrategias de DNA recombinante estándar 13.
NOTA: Aunque hemos utilizado ampliamente GFP, otras variantes tales como la proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), DsRed y mCherry se pueden emplear. Las mejoras en la eficiencia fluoróforo plegable, brillo y fotoestabilidad constantemente se están haciendo, y los investigadores deben hacer uso de las construcciones de última generación.- Confirmar secuencia de ADN correcta y asegurar que el resto de GFP es en marco con la proteína de interés. Realizar secuenciación utilizando estrategias de ADN recombinante estándar 21.
NOTA: Muchas instituciones cuentan con instalaciones de ADN del núcleo, lo que se recomienda al investigador en contacto para obtener información adicional. - Para las proteínas de membrana individuales o dobles pase, generarambas versiones de terminales amino y carboxilo de las proteínas de fusión 19.
- Para las proteínas multi-GFP que abarca insertar dentro de bucles extramembrane putativo, así como los extremos. Tenga especial cuidado al generar quimeras transmembrana con la proteína de fusión fluorescente unido al extremo amino terminal de la proteína diana como las secuencias señal se escinden a menudo por proteolisis una vez que la proteína ha pasado a través de la translocon ER.
- En el caso de secuencias de señal existentes, inserte el fluorescente proteína de fusión distal al sitio de escisión para generar una proteína madura que contiene una proteína fluorescente etiquetada amino-terminal intacto. Emplear estrategias estándar de ADN recombinante para la generación de quimeras 21.
- Confirmar secuencia de ADN correcta y asegurar que el resto de GFP es en marco con la proteína de interés. Realizar secuenciación utilizando estrategias de ADN recombinante estándar 21.
- Determinar la presencia de la señal fluorescente debidamente localizado suficiente en la línea celular de interés.
- Observar las células bajo microscopio de epifluorescencia usando la fluorescencia intrínseca de GFP bajo appropricomió filtro establecer condiciones. Para los conjuntos de filtros de GFP que abarcan 510-560 nm, confirman que los filtros correctos se utilizan para el fluoróforo empleado.
NOTA: Se consigue una señal suficiente cuando la evaluación por el ojo proporciona una señal suficientemente fuerte que la estructura celular en el que reside la señal se resuelve fácilmente por encima del fondo. Además, el patrón de tinción de la proteína GFP debe ser coherente con la de marcadores para el organelo apropiado, y preferiblemente idéntica a la de la proteína nativa sin etiquetar.
- Observar las células bajo microscopio de epifluorescencia usando la fluorescencia intrínseca de GFP bajo appropricomió filtro establecer condiciones. Para los conjuntos de filtros de GFP que abarcan 510-560 nm, confirman que los filtros correctos se utilizan para el fluoróforo empleado.
- Determinar si un enfoque de transfección estable o transitoria se utilizará basa en que se evalúa la proteína.
NOTA: Los transfectantes estables generalmente ofrecen los niveles más bajos de expresión de los sistemas transitorios. Aunque la expresión transitoria proporciona la expresión de alto nivel de proteínas y la intensidad de aumento de la señal (~ 5-24 hr después de la transfección dependiendo de la proteína), también puede dar lugar a artefactos tales como la sobreexpresión de la proteína Aggrdele- o la saturación de las vías de la proteína diana, dando lugar a la localización subcelular errónea.
2. La transfección de células y cultivo celular
NOTA: Una variedad de células son susceptibles de análisis FPP, incluyendo HEK293, HeLa, COS-7 y las células CHO 14. La siguiente descripción se basa en la expresión de proteínas de membrana en células HEK293.
- Cultivar células de riñón embrionario humano (Hek293) como monocapas adherentes en 6 ml de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 1% de piruvato de sodio y 250 g / ml de penicilina / estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO 2. Realizar todos los trabajos con células en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar. Se cultivan las células en medio de cultivo hasta ~ 80% de confluencia en un matraz T-75.
- Transfectar células utilizando cualquiera de alta eficiencia estándar, método de transfección de baja toxicidad, incluyendo lípidos, tecnologías viral- o basadas en la electroporación para generar transient o expresión estable. Normalmente 2 g de ADN plásmido por 1 x 10 6 células da buena expresión de la proteína reproducible. Mantener las células de 5-48 horas en medio de cultivo tisular apropiado a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos capaz CO 2.
- Supervisar las células para la expresión de la proteína GFP-fusión mediante microscopía de epifluorescencia, utilizando la señal de fluorescencia intrínseca de GFP, usando conjuntos de filtros apropiados de acuerdo con el protocolo del fabricante. La señal de fluorescencia generalmente alcanza un máximo dentro de 24 a 72 horas después de la transfección. Utilice células cuando la señal de fluorescencia alcanza un nivel máximo. Monitorear los niveles de expresión de proteínas por el análisis de inmunoblot utilizando anticuerpos dirigidos contra la proteína de interés o el resto de GFP.
- Para experimentales células de la placa de análisis sobre cubreobjetos recubiertos. Ver sea bajo una configuración de célula viva o después de la fijación y montaje en portaobjetos de microscopía. Células de la placa para alcanzar el 60% y el 80% de confluencia entre las 24-48 horas.
- Cubreobjetos capa con solución de poli-lisina (0,1 mg / ml), de modo que toda la superficie está cubierta. Incubar durante 30 min bajo una luz ultravioleta a temperatura ambiente, seguido de 60 min en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C. Retire el exceso de poli-lisina y enjuague los cubreobjetos en PBS 3 veces.
- Alternativamente, la placa de las células en un cubreobjetos cámaras que consiste en placas de cultivo celular con un fondo de cristal óptico para permitir que la imagen directa con los objetivos de inmersión en aceite. La configuración real microscopía depende del equipo disponible para el investigador, pero debe ser capaz de cambios rápida solución. Dependiendo del tipo celular y celular de la forma, las células deben estar alrededor de 60-90% de confluencia en el momento del ensayo FPP.
3. Configuración de microscopía de fluorescencia
- Utilice un alto objetivo de inmersión en aceite apertura numérica (NA) para la recogida de señal máxima y la resolución espacial, tal como un 60X, 1,42 NA objetivo de inmersión en aceite. Utilice ªe siguiente lasers para estimular los fluoróforos: de gas argón de 488 nm (GFP y YFP) y 561 de diodos (RFP, mCherry).
- Determinar la tasa óptima exposición, la ganancia y la captura de imágenes para cada construcción. Ajusta la intensidad del láser y el tiempo de exposición para minimizar photobleaching (véase el paso 7.1.2).
- Para los estudios que utilizan múltiples fluoróforos (por ejemplo, un marcador soluble para la permeabilización de la membrana en concierto con una proteína marcadora de membrana), elija filtro apropiado establece para minimizar la señal diafonía y maximizar la relación señal-ruido.
4. El establecimiento de condiciones óptimas para la membrana plasmática Permeabilización
- Retire el medio de cultivo celular a partir de células que expresan sólo las proteínas fluorescentes solubles (por ejemplo, EGFP, DsRed). Lavar las células 3 veces (1 min cada uno) en tampón de KHM (acetato de potasio 110 mM, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Realizar experimentos con células y todos los reactivos a temperatura ambiente.
- Coloque las células on cubreobjetos (véase el paso 2.4) en tampón de KHM en una platina del microscopio de fluorescencia y recoger la primera imagen, que representa el control de fase 'no permeabilizadas'.
- Para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática, añadir digitonina (30 mM) en tampón de KHM a las células. Perfundir células con tampón (tampón de digitonina +) a una velocidad de 5 ml / min durante 10-60 seg.
- Determinar la concentración óptima de digitonina aumentando gradualmente la concentración de digitonina. La concentración de digitonina óptima se logra cuando hay una pérdida completa de señal de fluorescencia de EGFP soluble dentro de 10-60 seg de aplicación digitonina. Para muchas células aplicación de 10-50 mu M de digitonina es suficiente para permeabilizar la membrana celular.
- Para todas las aplicaciones utilizan la concentración más baja posible de digitonina. Recoge imágenes después digitonin permeabilización de la señal de fondo permeabilizada.
- Confirme que la quimera de la proteína GFP de interés es la membrana entegrated mediante la confirmación de retención celular de la señal de fluorescencia después de la permeabilización de digitonina de la membrana plasmática 16.
- Expresar una proteína fluorescente orgánulo específico 23. Las proteínas mitocondriales funcionan bien en este sentido 16, por ejemplo, pDsRed2-Mito vector. Determinar las condiciones óptimas de expresión tal como se describe en el paso 2.1.
- Confirmar que la concentración de digitonina es apropiado para el tipo de célula empleada por asegurar que la morfología de los orgánulos intracelulares permanece constante a lo largo prolongado (hasta 60 min) la exposición a la digitonina.
NOTA: Use protocolos de microscopía de inmunofluorescencia estándar utilizando anticuerpos contra diversos compartimentos celulares, tales como los lisosomas (por ejemplo, LÁMPARA1), de Golgi (por ejemplo, TGN38), retículo endoplásmico (por ejemplo, calnexina), endosomas (por ejemplo, Rab5), mitocondrias (por ejemplo, el citocromo c). Si orgánulos intracelulares cambios morfología / integridad dramáticamente over 60 min, es probable que la concentración de digitonina era demasiado alto, y requiere una reducción en la concentración de digitonina y / o tiempo de exposición.
NOTA: Digitonina es tóxico por inhalación y por contacto con la piel. Llevar equipo de protección personal (EPP) apropiado.
5. Proteasa Tratamiento de proteínas fluorescentes
- Lavar las células en tampón de KHM y luego añadir la proteasa (proteinasa K; 50 mg / ml en tampón KHM) directamente sobre las células. Perfundir células a una velocidad de flujo de 5 ml / min usando un sistema de perfusión por gravedad a Bath continuamente la preparación.
- Soluciones de las tiendas en 50 ml jeringas y tubos de polietileno conectados reservorios independientes a un colector con una sola salida en el baño (tasa de flujo de 5 ml / min). Coloque una pipeta de succión para mantener una (0,5 ml) volumen de baño constante y lograr el intercambio de solución al cambiar manualmente entre reservorios de perfusión.
- Recoger las imágenes para determinar si el fluorseñal escent persiste o se degrada. Una pérdida de> 90% de la intensidad de la señal inicial de más de 30-60 segundos es consistente con la degradación proteolítica de la quimera de la proteína GFP (ver resultados representativos).
- Si no hay degradación de la señal se observa con proteinasa K, cuando se prevé dicha pérdida, reemplace la solución de proteinasa K con tripsina (4-8 mM) en tampón KHM. Si es necesario, utilizar una mezcla de proteinasa K y tripsina. No hay necesidad de apagar la actividad de la proteasa.
6. Enfoque alternativo para la Membrana Plasmática Proteínas con dominios externos
- Para las proteínas de la membrana plasmática, lleve a cabo el ensayo de proteínas fluorescentes externos quimeras antes de digitonin permeabilización. Lavar las células sobre cubreobjetos en tampón KHM (5 ml / min x 3 min), y tomar una imagen para el tratamiento pre-proteasa y cuantificar la señal de fluorescencia pre-proteasa que en el paso 7.
- Exponer las células de la proteasa (proteinasa K; 50 mg / ml o tripsina 4-8 mM en tampón KHM) en tque ausencia de digitonina por perfusión de las células con KHM medios que contienen proteasa (velocidad de flujo 5 ml / min). Recoge imágenes de la proteína fluorescente, para determinar la rapidez con la señal desaparece o cuánto tiempo la señal persiste.
- Antes de permeabilización digitonina, apagar toda la actividad de la proteasa, por lavado de las células tres veces (1 min cada uno) en medios de cultivo celular que contiene 10% de suero (FBS).
- Lavar las células por perfusión con tampón de KHM (velocidad de flujo de 5 ml / min) durante 2 min. Adquirir una imagen pre-permeabilización. Permeabilizar la membrana celular como se describe en el paso 4.
- Recoge imágenes después de la adición de la proteasa como se describe en el Paso 5.
Análisis 7. Imagen
- Utilice un microscopio invertido capaz de "células vivas" de grabación, en el que la pérdida de la señal de fluorescencia se puede monitorizar en tiempo real. Para el monitoreo continuo, emplear parámetros idénticos (tiempo de exposición, la ganancia, la intensidad del láser, etc.).
- Determinar experparámetros imental mediante la observación de la señal de fluorescencia de la proteína GFP de interés en condiciones de control (es decir, KBH tampón solo). Ajuste los ajustes de tiempo de ganancia, la intensidad del láser y la exposición en el microscopio dirigido por ordenador para asegurar que no hay pérdida apreciable de intensidad de la señal durante un período de 10-20 min.
NOTA: La intensidad de la señal no es un valor absoluto, sino que se basa en el sistema de microscopio y los ajustes disponibles para cada IP. Monitorear cambios en la intensidad de fluorescencia relativa.
- Determinar experparámetros imental mediante la observación de la señal de fluorescencia de la proteína GFP de interés en condiciones de control (es decir, KBH tampón solo). Ajuste los ajustes de tiempo de ganancia, la intensidad del láser y la exposición en el microscopio dirigido por ordenador para asegurar que no hay pérdida apreciable de intensidad de la señal durante un período de 10-20 min.
- Por otra parte, el tratamiento de las células en el conjunto de los puntos de tiempo en digitonin seguido de proteasa, y fijar las células antes de montar en cubreobjetos para imágenes. Determinar empíricamente puntos de tiempo después de procedimientos en los pasos 4 y 5. Para la investigación inicial, comienzan en 0, 30, 60, 120 y 300 de post seg adición de digitonin o proteasa.
- Fijar las células (20 min a temperatura ambiente) utilizando una cantidad suficiente de fijador (3,7% de paraformaldehído en PBS) para sumergir completamente ésimocélulas e.
- Se inactiva paraformaldehído residual mediante lavado las células con PBS que contenía glicina 20 mM (3 x 5 min).
- Mount cubreobjetos de eliminar el exceso de líquido de la cubreobjetos e invirtiendo el cubreobjetos sobre soporte de montaje 50 l en un portas para la imagen. Deje que se sequen durante la noche antes de exponer.
- Recoger imágenes de microscopía de fluorescencia (bajo los filtros apropiados establece compatible con el fluoróforo se utiliza) mediante el uso de la función de captura de imagen de vídeo en un microscopio de fluorescencia controlado por ordenador.
- Cuantificar las intensidades de señal fluorescente como una función de la condición de incubación. Obtener la intensidad media de píxeles dentro de una región de interés (ROI) que encierra una celda individual.
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Representative Results
Membrana plasmática Permeabilización
Efficient permeabilización de la membrana de plasma se determina por el uso de proteínas fluorescentes solubles (por ejemplo, GFP, DsRed) (paso 4). Estas proteínas, cuando se expresa en las células, son libres para difundir en el citosol, y se pierden cuando la membrana plasmática se permeabilizan utilizando digitonina (Figura 2). Una desaparición completa de la señal fluorescente debe ocurrir dentro de 10 a 60 segundos de aplicación digitonin. La confirmación de que la proteína de interés se asocia con orgánulos intracelulares se logra observando la retención de señal fluorescente tras la permeabilización de digitonina.
Proteasa Tratamiento
Después de la generación exitosa de quimeras fluorescentes entre la proteína de interés y la proteína fluorescente (GFP, YFP, etc.) (Paso 1) y la expresión de la proteína fluorescente en las células (Paso 2), el tratamiento células de permeabilizadas con proteasa proporcionarán información acerca de si el fluoróforo (y su dominio de la proteína adyacente) están en el citosol y accesibles a las proteasas, o se encuentran dentro de un lumen de orgánulos y por lo tanto protegidos de la digestión de la proteasa (paso 4). LMTK2 es una membrana anclada quinasa 15, y ensayos de protección de proteasa de fluorescencia se han utilizado para determinar su topología de la membrana 16. La cola carboxilo de LMTK2 fue fusionado a GFP y expresó transitoriamente. Señal de LMTK2-GFP fluorescente se perdió rápidamente después de la adición de proteinasa K, lo que indica la ubicación del extremo carboxilo de LMTK2 que se encuentra en el citosol (Figura 3). Caveolina-GFP (Cav1-GFP) 17 es una proteína de membrana de plasma con un GFP-resto unido al dominio citosólico. Como con LMTK2, la señal de caveolina-YFP se digitonina insensible, pero sensible a la posterior adición de la proteasa (Figura 3).
t "> proteínas solubles Luminal también pueden identificarse utilizando el protocolo de FPP. En este ejemplo, la señal de retención KDEL ER se añade a DsRed. En contraste con las señales de LMTK2 y caveolina, la señal de la KDEL-DsRed es insensible a tanto digitonina y proteasa, como digitonina no es capaz de permeabilizar la membrana del ER y la señal fluorescente está protegida de la degradación por proteasas. Un ejemplo de un dominio de membrana situado dentro del lumen de un orgánulo está dada por la proteína mitocondrial es la subunidad VIII de la citocromo c oxidasa humana 18,19. pDsRed-Mit, codifica la proteína fluorescente roja de Discosoma sp. fusionada a la secuencia de direccionamiento mitocondrial de citocromo c oxidasa. En las células que expresan pDsRed-Mito, la señal fluorescente se ve en la célula. Después de permeabilización digitonina, la señal fluorescente asociado con pDsRed-Mito permanece estable. Además, después de la adición de proteinasa K, la fluorescencia asociada con pDsRed-Mito persiste, conconsistente con el fluoróforo en la mitocondria y no expuestos al citosol y por lo tanto protegido de la actividad de la proteasa (Figura 3).Extracelular Dominios
El tratamiento con proteasa de células no permeabilizadas debe apagar rápidamente la señal de fluorescencia cuando el resto fluorescente unido a una proteína de la membrana se enfrenta el exterior de la célula. El glicosilfosfatidilinositol (GPI) proteína anclada PrP 20 sirve como un excelente ejemplo. Una construcción que contiene la proteína fluorescente amarilla (YFP) unido al extremo amino terminal de PrP (YFP-PrP) 21,22, un generoso regalo del doctor Ehud Cohen, de la Universidad Hebrea de Jerusalén. Antes de tratamiento con proteasas, la señal fluorescente de la YFP extracelular era brillante (Figura 4). Después del tratamiento de proteasa, la señal de fluorescencia extracelular desapareció rápidamente.
Consideraciones de tiempo
Figura 1: permeabilización selectiva de la membrana plasmática (a) modelo de la historieta del ensayo FPP que muestra una sola célula va a través del protocolo experimental.. El símbolo rojo representa la proteína fluorescente roja (RFP) en el citosol, los símbolos verdes y azules representan proteínas transmembrana con la etiqueta fluorescente ya sea dirigida a la luz de orgánulos (azul) o citosol (verde). (B) Después de permeabilización digitonin, libre citosólicoproteínas difunden distancia, reduciendo la señal de solicitud de propuesta. (C) Después de la aplicación de la proteinasa K, la señal verde citosólica se degrada, mientras que la señal azul está protegido de la degradación por su presencia en el lumen del orgánulo.
Figura 2: Tratamiento Digitonina permeabiliza la membrana plasmática y comunicados de las buenas prácticas agrarias citosólica (a) de la historieta de una sola célula que expresa GFP soluble, antes y después del tratamiento digitonin.. (B) tratamiento digitonina permeabiliza la membrana plasmática y comunicados de GFP citosólica. Una región de interés (ROI) se dibuja alrededor de las células CHO que expresan GFP soluble. Tras el tratamiento con digitonina (50 mM), las imágenes fueron tomadas antes y después de la adición de digitonina, y en los puntos de tiempo indicados. Barra de escala, 10 micras. (C) La cuantificación de la Fluorese muestra intensidades scence de la serie temporal completa (af).
Figura 3: FPP revela la topología de la proteína LMTK2 endosomal (a) de la historieta de FPP que muestra la pérdida de DsRed (bolas rojas) pero la retención de LMTK2-GFP (bolas verdes) después de la permeabilización de digitonina, seguido por la pérdida de señal en la aplicación de proteinasa K. . (b) ensayo de FPP de células CHO que expresan DsRed y LMTK2-GFP. Las imágenes fueron tomadas antes y después de digitonina tratamiento, y después de proteinasa K, como se indica. Barra de escala: 10 micras.
Figura 4: (a) modelo de dibujos animados que muestra la topología y la ubicación de YFP-PrP (verde) antes y después de proteinasa K tratamiento. Células CHO que expresanYFP-PrP fueron sometidos a la proteinasa K para 100 seg. (B) Las fotografías tomadas antes y después del tratamiento de la proteasa se muestran a los tiempos indicados. Señal de YFP-PrP se perdió completamente tras la proteasa en ausencia de digitonina. Yellow región muestra de interés (ROI) que se utiliza para la cuantificación se muestra en (c).
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Discussion
La orientación correcta y la topología de proteínas de membrana es esencial para su correcto funcionamiento. A pesar de la importancia de comprender la topología de proteínas de membrana, hay muchas proteínas para los que dichos datos se carece por completo. FPP proporciona una manera fácil y eficiente de la determinación de la topología de proteínas de membrana, y uno que puede ser realizado por la mayoría de los laboratorios. El enfoque FPP ofrece ventajas significativas sobre los métodos anteriores para la determinación de la topología de la proteína. Por ejemplo, no hay necesidad de tener un panel de múltiples anticuerpos dirigidos de nuevo diversos dominios de la proteína de interés 31. En muchos casos, un panel de anticuerpos tales no está disponible; esto es especialmente cierto para las proteínas recién clonados. A medida que el ensayo se puede realizar en un solo nivel celular, no se requieren grandes cantidades bioquímicas de la proteína para bioquímica aguas abajo de análisis como la proteólisis o SDS-PAGE. De hecho, se necesitan relativamente pocas células transfectadas para asignar de forma inequívocauna topología de la proteína de interés. Esto es importante si el investigador está evaluando la topología en los discos para transfectar células tales como las células epiteliales o neuronas. La simple adición de un resto de GFP ya sea a la carboxilo o amino terminal de la proteína se puede lograr fácilmente usando numerosos GFP comercialmente disponible que contiene plásmidos, y en la mayoría de los casos, la adición de la fracción de GFP no obstaculice el plegamiento de proteínas adecuada o localización subcelular. Sin embargo, el investigador debe confirmar que esto es cierto para su proteína, ya que existe el potencial de GFP para afectar a la proteína de interés 23,24. Muchas proteínas ya están disponibles como proteínas de fusión GFP, por lo que requiere un mínimo esfuerzo adicional para iniciar estudios topológicos. Aunque la monitorización continua de la fluorescencia proporciona un medio rápido y eficaz para determinar la topología de la proteína, los investigadores que no tienen acceso a vivir de células equipos de imagen, el ensayo se adapta fácilmente a una aplicación de fijación de formaldehídocucaracha usando epifluorescencia estándar de la microscopía confocal.
Sin embargo, hay algunas limitaciones en la aplicabilidad del ensayo FPP. En caso de procesamiento proteolítico, u otras modificaciones post-traduccionales como resultado ligeramente diferentes topologías de membrana para la proteína de interés, el ensayo FPP sólo evaluará la forma de proteína dominante. Además, añadiendo un resto de GFP a los extremos de algunas proteínas puede afectar a su función, por ejemplo interferir con dominios PDZ terminales carboxilo. Sin embargo, el ensayo FPP proporciona un método simple para establecer la orientación y la topología de muchas proteínas de membrana.
Es crítico que se llevaron a cabo experimentos iniciales para determinar la concentración correcta de digitonina para liberar GFP intracelular soluble. Si la GFP no se difunde fuera de la célula después de la aplicación de digitonina, la concentración de digitonina debe aumentarse gradualmente, para determinar la concentración mínima recesarias para facilitar la liberación. Sin embargo, demasiado digitonina afectará a la morfología de las vesículas intracelulares, cuya integridad debe ser confirmada después de la aplicación de digitonina. Orgánulos en algunas células son muy sensibles y pueden requerir una composición tampón más estabilización 25. Si la señal de fluorescencia de la quimera que se está evaluando es baja, la selección de un único clon con un mayor nivel de expresión, o la realización de una expresión transitoria, a menudo aumentará la intensidad de la señal a un nivel aceptable. La búsqueda de nuevos, plásmidos brillantes también se deben considerar con baja intensidad de señal. Por último, se debe tener cuidado para asegurar que la pérdida de la señal de visto es debido a la degradación de proteasa y no a photobleaching de fluoróforos. La reducción de la intensidad de luz y / o velocidad de adquisición ayudará a reducir fotoblanqueo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
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