Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52903
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

Abstract

تقنية المعروضة هنا يسمح احد لتحليل في الخطوة التي بروتين الهدف، أو بدلا من ذلك جزيء صغير، تتفاعل مع مكونات مسار الإشارات. وتستند هذه الطريقة، من جهة، على التعبير عن محرض من بروتين معين لبدء الحدث الإشارات في خطوة محددة ومقررة مسبقا في شلال يشير المحدد. التعبير يصاحب ذلك، من ناحية أخرى، من الجينات في المصالح ثم يسمح للمحقق لتقييم ما إذا كان النشاط من البروتين المستهدف أعرب يقع المنبع أو المصب لهذا الحدث مما يشير بدأت، اعتمادا على قراءات من مسار الإشارات التي يتم الحصول عليها. هنا، تم اختيار سلسلة أفكارك كمسار إشارات محددة لإثبات وظائف البروتوكول. البكتيريا المسببة للأمراض، مثل الكوكسيلا البورنيتية، نقل من البروتينات المستجيب التي تتداخل مع الحث موت الخلايا المضيفة في الخلية المضيفة لضمان بقاء البكتيريا في الخلية وللترويج لنشر في الكائن الحي. وC. بروتين المستجيب البورنيتية CaeB يمنع بشكل فعال موت الخلايا المضيفة بعد استحثاث موت الخلايا المبرمج مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو مع staurosporine. لتضييق على الخطوة التي CaeB يتداخل مع انتشار الإشارة أفكارك، وأعرب عن البروتينات المحددة مع جيدا اتسم بالنشاط المساعد على أفكارك عابر بطريقة الدوكسيسيكلين محرض. إذا يعمل CaeB المنبع من هذه البروتينات، وموت الخلايا المبرمج المضي قدما دون عوائق. إذا يعمل CaeB المصب، سيتم تحول دون موت الخلايا. كانت البروتينات الاختبار المختارة باكس، الذي يعمل على مستوى الميتوكوندريا، وكاسباس 3، وهو الأنزيم البروتيني الجلاد كبير. CaeB يتداخل مع موت الخلايا الناجم عن باكس التعبير، ولكن ليس عن طريق كاسباس 3 التعبير. CaeB، وبالتالي يتفاعل مع تتالي أفكارك بين هذه البروتينات اثنين.

Introduction

الفوعة للعوامل الممرضة سلبية الغرام البكتيرية تعتمد على أنظمة إفراز المتخصصة لخطف الخلايا المضيفة حقيقية النواة. البكتيريا تستخدم هذه النظم إفراز لحقن البروتينات الفوعة البكتيرية (المؤثرات) في الخلية المضيفة لتعديل مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية والكيمياء الحيوية. قدمت دراسة البروتينات المستجيب ليس فقط نظرة ملحوظة في الجوانب الأساسية للمضيف / التفاعلات الممرض ولكن أيضا في البيولوجيا الأساسية للخلايا حقيقية النواة 1. وقد تبين أن التشكيل من موت الخلايا المبرمج الخلية المضيفة أن تكون آلية الفوعة هامة لكثير من الكائنات الممرضة داخل الخلايا، كما تم تحديد عدد من البروتينات المستجيب تحوير الخلايا 2-9. ومع ذلك، آلياتها الجزيئية دقيقة من النشاط لا تزال بعيدة المنال في كثير من الحالات.

موت الخلايا المبرمج، وهو شكل من موت الخلية المبرمج، يلعب دورا هاما في الاستجابة المناعية للإصابة 10. مسارين الرئيسية المؤدية إلى موت الخلايا المبرمج لهاتم تحديد: استهداف الميتوكوندريا (موت الخلايا المبرمج الجوهرية) أو تنبيغ المباشر للإشارة عن طريق مستقبلات موت الخلايا في الغشاء البلازمي (موت الخلايا المبرمج خارجي). يتم تشغيل مسار موت الخلايا الذاتية أو بوساطة الميتوكوندريا بواسطة إشارات بين الخلايا وتتضمن تفعيل باكس وباك، وهما عضوان الموالية لأفكارك من عائلة بي سي إل 2. وتتكون هذه العائلة من البروتينات منظم المؤيدة والمضادة للأفكارك التي تتحكم في موت الخلايا 11-14. تفعيل الخلايا يؤدي إلى oligomerization من باكس وباك تليها permeabilization لاحق من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، مما أدى إلى الإفراج السيتوكروم C إلى السيتوبلازم. الإفراج السيتوكروم C يبدأ تفعيل caspases المستجيب 3 و 7 من خلال تفعيل كاسباس 9 في apoptosome 15. وهذا يؤدي إلى التحلل البروتيني من ركائز مختارة، من بين أمور أخرى، يؤدي إلى تعرض فسفاتيديل على سطح الخلية 16 و يحرر الدناز مخصص أن شظايا الفصلromatin 17،18.

من أجل تحديد مكان ضمن سلسلة أفكارك بروتين المستجيب الفردية يتدخل، كان يعمل بنظام التعبير محرض 19. وكانت الأجهزة التنظيمية للتعبير مشروط من الجينات المحورة أداة لا تقدر بثمن في تحليل وظيفة البروتين داخل الخلية أو أهميتها بالنسبة للأنسجة، جهاز والتنمية الكائن الحي، وكذلك أثناء بدء والتقدم والحفاظ على المرض 20-23. عادة، ونظم التحكم محرض، مثل نظام تيت 24 يعملون هنا، تشكل وحدة النسخ الاصطناعية (انظر الشكل 1). عنصر واحد هو عامل النسخ هندسيا بشكل مصطنع دعا نقل واكتساب التكنولوجيا (التي تعتمد على التتراسيكلين النسخ المنشط)، التي شكلتها انصهار النسخ كاظمة البكتيرية TetR 25 إلى مجال البروتين الثدييات التي تتوسط تفعيل النسخي أو إسكات 24،26. العنصر الثاني هو هجينالمروج، ووصف TRE (عنصر التتراسيكلين استجابة)، التي تتألف من الحد الأدنى من المروج حقيقية النواة، التي تحتوي على ما لا يقل عن TATA مربع وموقع بدء النسخ، وانضم إلى تكرار متعددة من موقع ملزم DNA وما شابه ذلك لTetR، TETO 24،25. العنصر الثالث هو يجند الطبيعي للTetR، التتراسيكلين أو أحد مشتقاته، مثل anhydrotetracycline أو دوكسي 25. على يجند بالإضافة إلى مستنبت، TetR يفقد تقارب من أجل تيتو وتنأى عن TRE. ونتيجة لذلك، يتم إلغاء نسخ من الجين المستهدف. التعبير التحوير يمكن، بالتالي، أن تسيطر بإحكام بطريقة الزمنية وتعتمد على الجرعة في كل من زراعة الخلايا والحيوانات 20،23،24. مع نقل واكتساب التكنولوجيا، يحدث التحوير التعبير بشكل جوهري، إلا في وجود التتراسيكلين. هذا يمكن أن يكون العيب في دراسة السامة للخلايا أو أنكجنيك البروتينات لأن التتراسيكلين أولا أن يتم إزالتها من النظام، قبل التحوير expressioن يحدث ويمكن رصد آثار البروتين المستهدف على الخلية. هذا يمكن أن يكون مضيعة للوقت وليس دائما كاملة، خصوصا في الحيوانات المعدلة وراثيا 27. لمعالجة هذا القيد، تم استخدام متحولة TetR مع استجابة عكسية لوجود الدوكسيسيكلين لتوليد عامل النسخ الجديدة، rtTA (عكس TTA) 28. فإنه يلزم فقط لتري، وبصورة متزامنة، وينشط النسخ في وجود دوكسي. التسرب المتبقية للنظام، أي، التعبير التحوير في غياب عامل النسخ متجهة الى TRE، منشؤها إما (ط) من آثار الموقف في موقع التكامل الجيني، (ب) من TRE نفسها 29، أو (ج) من غير -specific ملزمة للنقل واكتساب التكنولوجيا / rtTA 28، وقد وجهت عن طريق إدخال كاتم الصوت النسخي إضافية، ووصف تحويل النص إلى كلام (التي تعتمد على التتراسيكلين كاتم الصوت النسخي) 30 إلى النظام. أنها تشكل شبكة تنظيمية مزدوجة مع rtTA (انظر الشكل 1).في غياب الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام بربط TRE والعمل بنشاط على إيقاف أي النسخ المتبقية. في ظل وجود الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام تنأى عن TRE وrtTA بربط حمل في وقت واحد التعبير عن الجينات المستهدفة. هذه طبقة إضافية من الصرامة ضرورية في كثير من الأحيان للتعبير عن البروتينات السامة للخلايا نشطة للغاية 31-34.

باستخدام هذا النظام المزدوج المنظم لرقابة مشددة، ويمكن البدء في سلسلة أفكارك في خطوة محددة تسمح بتحليل ما إذا كان البروتين المستجيب معينة يمكن أن تتداخل مع الخلايا الاستقراء. لا يمكن استخدام هذا الأسلوب فقط لدراسة النشاط المضادة للأفكارك البروتينات المستجيب البكتيرية ولكن أيضا للتعبير عن محرض من البروتينات الموالية لأفكارك أو السامة أو لتشريح التدخل في مسارات إشارات أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جيل من خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن بروتين الاهتمام

  1. إعداد وسائل الاعلام من خلال إضافة FCS المعطل الحرارة و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين إلى المتاحة تجاريا Dulbecco's التعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع GlutaMAX-I، البيروفات، و 4.5 جم / L D-الجلوكوز.
  2. زراعة خلايا HEK293 في وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. دون زراعة الخلايا كل يوم الثالث على التوالي. إزالة وسائل الإعلام وresuspend الخلايا في 15 مل وسائل الإعلام الجديدة. ماصة 1 مل في الجديدة 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة وإضافة 14 مل سائل الإعلام.
  3. تحليل عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  4. البذور خلايا HEK293 في لوحة 6 جيدا في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلايا لكل بئر واحتضان لمدة 24 ساعة.
  5. لترنسفكأيشن استخدام بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للكاشف ترنسفكأيشن. Transfect الخلايا مع pEGFP-C2 أو pEGFP-C2-CaeB باستخدام كاشف ترنسفكأيشن. قبل استخدامها، الاحماء reag ترنسفكأيشنوالأنف والحنجرة وسائل الإعلام اللازمة لRT. استخدام 3: 1 نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لDNA.
    1. في التفاصيل، ماصة 1.5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مباشرة في 50 ميكرولتر من المصل خالية DMEM المتوسطة. لتكوين معقد، ماصة 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي ترميز GFP أو GFP-CaeB إلى ترنسفكأيشن التي تحتوي على كاشف الخليط واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
    2. Transfect الخلايا عن طريق إضافة خليط التفاعل بطريقة الإفلات من الحكمة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ لمدة 24 ساعة.
  6. إضافة 1 ملغ / مل geneticin لاختيار من الحيوانات المستنسخة GFP إيجابية عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
  7. بعد 6 أيام، عزل الخلايا وحيدة عن طريق التدفق الخلوي والفرز في لوحة 96-جيدا إيواء المتوسطة وHEK293 طاف في نسبة 1: 1. توليد HEK293 طاف من الخلايا متموجة HEK293 مثقف أن تم طرد لمدة 15 دقيقة في 4966 ز س.
  8. في اليوم التالي، تحل محل الثقافة المتوسطة مع المتوسط ​​تحتوي على 1.50؛ ملغ / مل geneticin. تغيير وسائل الإعلام مرة واحدة في الأسبوع. إذا كانت الخلايا شكل أحادي الطبقة متموجة، نقلها إلى لوحة 24-جيدا. دون زراعة الخلايا مرتين في الأسبوع في نسبة 1: 5 في وسائل الإعلام التي تحتوي على 1.5 ملغ / مل geneticin. أخيرا، وتحليل نسبة الخلايا GFP إيجابية من خلال تحليل طخة مناعية والتدفق الخلوي.

تحليل 2. من خطوط الخلايا مستقرة خلال تحليل طخة مناعية

  1. إزالة طاف وغسل الخلايا انضمت مرة واحدة مع PBS الدافئ. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة، والحرارة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتخزينها في -20 ° C.
  2. تحميل ما يقرب من 4 × 10 4 خلايا لكل عينة على 12٪ هلام SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، حمولة 6 ميكرولتر من سلم البروتين التجاري باعتباره الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل المواد الهلامية في نظام الكهربائي للهلام في إطار الجهد المستمر من 180 V لل45-60 دقيقة مع 1X Laemmli عازلة على التوالي.
  3. البروتينات وصمة عار على الأغشية PVDF (حجم المسام 0.45 ميكرون) في الجهد المستمر من 16 V لمدة 60 دقيقة باستخدام ترانس وصمة عار SD نقل خلية شبه الجافة.
  4. الأغشية كتلة في 10 مل من 5٪ غير دهن الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني / 0.05٪ توين 20 (MPT) لمدة 1 ساعة على RT.
  5. تمييع 4 ميكرولتر من مكافحة GFP الأضداد في 4 مل من MPT واحتضان الأغشية O / N عند 4 درجات مئوية.
  6. تنفيذ ثلاث خطوات الغسيل 10 دقيقة مع 10 مل من PBS / توين 20 بنسبة 0.05٪.
  7. احتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر من الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية في 4 مل من MPT.
  8. بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 2.6) وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين.

3. تحليل الخلايا باستخدام عداد الكريات التدفق.

  1. الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني. استخدام الخلايا HEK293 كما سيطرة سلبية لضبط الشوري الأمامatter (FSC) والجانب مبعثر (SSC) بحيث الخلايا هي على نطاق واسع. رسم بوابة على الخلايا الحية من خلال استبعاد الحلل خلية، وحدات العمل والحطام الخلية.
  2. ضبط أنبوب مضخم (PMT) مكاسب بحيث الخلايا غير ملوثين هي في أقصى اليسار من الرسم البياني للقناة FL1 (488 نانومتر الأرجون ليزر).
  3. لتحليل كثافة مضان من HEK293-GFP وHEK293-GFP-CaeB خلايا فتح الرسم البياني للقناة FL1 والحصول على 10000 الأحداث على السكان بوابات.
  4. تحليل البيانات باستخدام FACS التجارية برامج التحليل.

4. ترنسفكأيشن من مستقر خط الخلية مع محرض نظام ناقلات التعبير

  1. البذور خلايا HEK293 يعبرون عن ثابت GFP أو GFP-CaeB في لوحة ال 12 أيضا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 5 خلايا / جيد.
  2. 19 ساعة بعد البذر، وشارك في transfect الخلايا مع البلازميد منظم والبلازميد استجابة إما ترميز باكس أو كاسباس تنشيط 3.
    1. شارك في transfect الخلايا HEK293 مستقرةمع 100 نانوغرام من pWHE125-P منظم البلازميد (الشكل 2) و 100 نانوغرام من البلازميدات استجابة pWHE655-hBax أو pWHE655-revCasp3 (الشكل 3) و 0.4 ميكرولتر من polyethylenimine.
    2. إعداد DNA وpolyethylenimine ترنسفكأيشن كاشف كل في 75 ميكرولتر من غروب MEM المتوسطة واحتضان لمدة 5 دقائق بالضبط في RT. لتكوين معقد، واحتضان كل من الخلائط معا لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. إضافة polyethylenimine / DNA حل قطرة من الحكمة إلى الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.

5. استحثاث موت الخلايا المبرمج

  1. 5 ساعة بعد ترنسفكأيشن، لحث التعبير من البروتينات الموالية لأفكارك طريق إضافة 1 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين لثقافة المتوسط. احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.

تحليل 6. من الخلية المضيفة موت الخلايا المبرمج من قبل تحليل طخة مناعية

  1. تفقد الخلايا قبل ساعةarvesting تحت المجهر الضوئي للتحقق من تحريض موت الخلايا. الخلايا أفكارك هي اكتشافها من خلال وجود هيئات أفكارك في الخلايا المحيطة بها الموت.
  2. إزالة طاف وغسل الخلايا انضمت مرة واحدة مع PBS الدافئ. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة، والحرارة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتخزينها في -20 ° C.
  3. تحميل ما يقرب من 4 × 10 4 خلايا لكل عينة على 12٪ هلام SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، حمولة 6 ميكرولتر من سلم البروتين التجاري باعتباره الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل المواد الهلامية في نظام الكهربائي للهلام في إطار الجهد المستمر من 180 V لل45-60 دقيقة مع 1X Laemmli عازلة على التوالي.
  4. البروتينات وصمة عار على الأغشية PVDF (حجم المسام 0.45 ميكرون) في الجهد المستمر من 16 V لمدة 60 دقيقة باستخدام ترانس وصمة عار SD نقل خلية شبه الجافة.
  5. الأغشية كتلة في 10 مل من 5٪ غير دهن الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني / 0.05٪ توين 20 (MPT) لمدة 1 ساعة على RT.
  6. تمييع 4 μل المضادة للالمشقوق بولي البلمرة ADP-ريبوز (PARP) الأجسام المضادة في 4 مل من MPT واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
  7. تنفيذ ثلاث خطوات الغسيل 10 دقيقة مع 10 مل من PBS / توين 20 بنسبة 0.05٪.
  8. احتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 4 مل MPT.
  9. بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7) وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين.
  10. إزالة الأجسام المضادة ملزمة 30 دقيقة حضانة في RT مع 7 مل البقعة الغربية تجريد العازلة.
  11. بعد ثلاثة يغسل مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7)، تحقيق الأغشية مع 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة الأكتين في 4 مل من MPT O / N عند 4 درجات مئوية.
  12. بعد ثلاث خطوات غسل MPT (كما هو موضح في 6.7)، واحتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر من حوالأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق rseradish الثانوية مخففة في 4 مل من MPT.
  13. بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7 وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين.
    ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات الحضانة على شاكر لوحة للمرة المشار إليه ودرجة الحرارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أولا، تم إنشاء خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت وبروتين من الفائدة (CaeB) كما بروتين GFP الانصهار. كعنصر تحكم، قد تولدت أيضا خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت GFP. تم التحقق من التعبير عن GFP وGFP-CaeB عن طريق تحليل طخة مناعية. لطخة مناعية ممثل (الشكل 4A) يوضح التعبير مستقر وقابل للكشف بشكل واضح من GFP وGFP-CaeB. ومع ذلك، هذا الاختبار لا يمكن تحديد ما إذا كانت جميع خلايا تعبر عن GFP أو GFP-CaeB. لذلك، تم تحليل ستابلي خطوط الخلايا HEK293 أيضا التدفق الخلوي. كما هو مبين في الشكل 4B، وأعرب أكثر من 90٪ من الخلايا في كل من خطوط الخلايا GFP. وهكذا، هذه خطوط الخلايا مستقرة يمكن استخدامها لإجراء مزيد من التحليل وظيفة CaeB. في الخطوة التالية، ويعاير النشاط المناهض للأفكارك من CaeB عن طريق تحليل طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد PARP المشقوق. انشقاق بروتين من PARP النووي يعطل النشاط إصلاح الحمض النووي وهو علامة نموذجية من termiمراحل نال من موت الخلايا المبرمج. لم يتم الكشف عن انشقاق من PARP في HEK293-GFP أو خلايا HEK293-GFP-CaeB، مما يدل على أن أيا من التعبير عن GFP، ولا من GFP-CaeB غير سامة للخلايا. ومع ذلك، عندما تم علاج الخلايا مع staurosporine، وهو محفز قوي للموت الخلايا المبرمج الجوهرية، تم الكشف عن انشقاق من PARP (الشكل 5). الأهم من ذلك، تظهر خلايا HEK293-GFP-CaeB تخفيض الانقسام من PARP، مما يدل على النشاط المناهض للأفكارك من الكوكسيلا البورنيتية النوع الرابع البروتين نظام إفراز المستجيب CaeB 7.

تحليل في الخطوة التي CaeB يتداخل مع مسار أفكارك، كان يعمل على نظام تيت أون. في التفاصيل، و transfected الخلايا HEK293-GFP أو HEK293-GFP-CaeB مع البلازميد منظم يعبرون بشكل جوهري على كاظمة المزدوج / الإعداد التي تسيطر عليها دوكسي المنشط (الشكل 2) والترميز pTRE استجابة البلازميد إما كامل طول باكس البشري أو شكل تفعيلها لل كاسباس الإنسان 3، ووصف revCasp 3 (الشكل 3). وينظم هذا النظام بإحكام، كما يدل على ذلك عدم وجود PARP الانقسام تحت غير الذي يحفز الظروف (الشكل 6). أدت إضافة دوكسي إلى الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في التعبير عن باكس أو revCasp 3. إذا يتدخل CaeB مع مسار أفكارك المصب باكس، ثم يجب أن يكون قد تم حظره إشارة أفكارك الناتجة عن التعبير وتفعيل لاحق من قبل باكس CaeB التعبير. في الواقع، وخلايا HEK293 يعبرون عن ثابت GFP-CaeB تمنع عميقا موت الخلايا المبرمج من قبل التعريفي التي تسيطر عليها دوكسي باكس التعبير، في حين أن الخلايا HEK293-GFP عرض واضح PARP الانقسام. هذه النتيجة تشير إلى أن CaeB كتل الخلايا تحريض المصب من تفعيل باكس. بعد ذلك، تم تحليل ما إذا CaeB يمكن أن تتداخل مع كاسباس 3 التنشيط - حدث في وقت متأخر من مسار أفكارك. خلايا HEK293-GFP، وكذلك خلايا HEK293-GFP-CaeB، انشقاق المعرض PARP (الشكل 6)، مشيرا إلى أنه بمجرد أن كاسباس المستجيب 3 وأكتيفلا يمكن ATED، CaeB منع موت الخلايا المبرمج من الحدوث. معا المتخذة، وتظهر هذه البيانات التي CaeB يعمل بين باكس وكاسباس 3 التنشيط.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي للنظام التنظيمي التتراسيكلين. ويتألف نظام تيت-على اثنين من البلازميدات مختلفة، البلازميدات التنظيمية والاستجابة لها. البلازميد التنظيمي بترميز transsilencer تيت-استجابة (تحويل النص إلى كلام، شغل دائرة) وtransactivator عكس تيت متجاوبة (rtTA، دائرة مفتوحة). يتم التعبير عن كل من البروتينات بشكل جوهري تحت سيطرة القوي، التأسيسي استطالة عامل 1 ألفا المروج (P EF-1A). TTS وrtTA هي عوامل النسخ خيالية تتكون من مجال حقيقيات النوى النسخي التنظيمي (كاتم الصوت أو المنشط، على التوالي)، وكاظمة التتراسيكلين البكتيري (TetR). TetR يتوسط DNA ملزمة لسبعة تيت (تيتو) تسلسل على البلازميد استجابة يقع TETO المنبع للمحرض الحد الأدنى من الفيروس المضخم للخلايا المروج (P CMV)، جنبا إلى جنب تشكيل العنصر تيت المراعية لل(TRE). في ظل ظروف غير المحفزة، تحويل النص إلى كلام لا بد أن TRE منع التعبير. بعد إضافة الدوكسيسيكلين (دوكس، شغل الماس)، يتفاعل مع rtTA دوكس مما يؤدي إلى تغيرات متعلق بتكوين والتنشيط. تنشيط rtTA يستبدل تحويل النص إلى كلام على البلازميد ردا على ذلك، يسمح النسخ من الجينات المستهدفة منها باكس وكاسباس 3، مما يؤدي إلى تحريض موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. نظرة تخطيطية للالبلازميد pWHE125 التنظيمية. عناصر أساسية لنشر في البكالورياالبكتيرات، بما في ذلك أصل التكرار (أوري PBR) وكاسيت مقاومة المضادات الحيوية ضد الأمبيسلين (الأمبير R)، وللتعبير عن تيت-transregulators، مثل قوي، التأسيسي الفورية المبكرة المروج / محسن من الفيروس المضخم للخلايا البشرية (P / E hCMV)، وهو موقع الريبوسوم الداخلية ملزم من شلل الأطفال للفيروسات (PV-IRES) والموقع بوليا من فيروس قردي 40 (SV40 بوليا) يتم عرضها. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. نظرة تخطيطية للالبلازميد استجابة. عناصر أساسية لانتشار البكتيريا، بما في ذلك أصل التكرار (أوري PBR) والمقاومة للمضادات الحيوية كاسيت (الأمبير R)، وللتعبير محرض في حقيقيات النوى، مثل expressi التحويرعلى شريط كاسيت مع المروج تيت التي تعتمد على الحد الأدنى من TREtight (P TREtight)، الجينات في المصالح البشرية باكس (hBax) وموقع بوليا من فيروس قردي 40 (SV40 بوليا)، ويصور. ويحيط الكاسيت التحوير التعبير يكرر جنبا إلى جنب مباشرة من نسختين من الدجاج HS4 تسلسل عازل الأساسية (HS4 الأساسية). بالإضافة إلى ذلك، كاسيت المقاومة G418 تتألف من الفئران فسفوغليسرات كيناز 1 المروج (P mPGK)، مقاومة الجينات بالنيوميسين (G418 R) وموقع بوليا كيناز ثيميدين الإنسان (TK بوليا) موجود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. HEK293-GFP وHEK293-GFP-CaeB تعبر عن ثابت البروتينات الفلورية الخضراء. (A) لست] خلية كاملة من HEK293-GFP وتم immunoblotted خلايا HEK293-GFP-CaeB لGFP لإظهار التعبير مستقرة. يظهر (B) التدفق الخلوي ممثل (FACS) تحليل HEK293-GFP والخلايا HEK293-GFP-CaeB للتدليل على شدة التعبير GFP. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
وعولج الشكل 5. آثار التعبير عن GFP-CaeB على يسببها staurosporine موت الخلايا المبرمج. HEK293-GFP والخلايا HEK293-GFP-CaeB مع 4 ميكرومتر staurosporine عن 6 ساعات للحث على موت الخلايا المبرمج الجوهرية. تم تحليل الخلايا التي المشقوق تحليل PARP طخة مناعية. تم تخفيض PARP الانقسام في الخلايا HEK293-GFP-CaeB بالمقارنة مع خلايا HEK293-GFP. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبرمن هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. استخدام النظام تيتون لتضييق نقطة عمل CaeB. وكان المستحث (A) موت الخلايا المبرمج من قبل التعبير عن باكس في HEK293-GFP والخلايا HEK293-GFP-CaeB. تم تحليل الخلايا التي المشقوق تحليل PARP طخة مناعية. تم تخفيض PARP الانقسام في الخلايا HEK293-GFP-CaeB بالمقارنة مع خلايا HEK293-GFP. وكان المستحث (B) موت الخلايا المبرمج من قبل التعبير عن revCasp 3 في HEK293-GFP والخلايا HEK293-GFP-CaeB. تم تحليل الخلايا التي المشقوق تحليل PARP طخة مناعية. كان PARP انشقاق مماثل في خلايا HEK293-GFP-CaeB وHEK293-GFP. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العديد من أنواع البكتيريا المسببة للأمراض تؤوي أنظمة إفراز لإفراز أو نقل من البروتينات المستجيب البكتيرية إلى داخل الخلية المضيفة. هذه البروتينات المستجيب لديها القدرة على تعديل العمليات ومسارات في الخلية المضيفة، مما يسمح للبكتيريا من أجل البقاء وتكرار داخل مكانة داخل الخلايا في كل منها. وفهم الأنشطة البيوكيميائية والآليات الجزيئية من البروتينات المستجيب مساعدة نحو فهم أفضل للالمرضية ويمكن أن تساعد على تطوير أدوات علاجية جديدة لمكافحة المرض. وعلاوة على ذلك، حيث أن البروتينات المستجيب كثيرا ما تمارس وظيفتها عن طريق محاكاة أنشطة الخلية المضيفة، فإنها يمكن أن تستخدم أيضا لمعرفة المزيد عن بيولوجيا الخلايا حقيقية النواة 1. ومع ذلك، ودراسة النشاط الكيميائي الحيوي للبروتين المستجيب واحد وقد ثبت أن تكون معقدة لعدة أسباب: 1) التكرار وظيفية بين البروتينات المستجيب، 2) تنظيم الزمني الاشتباك من البروتينات المستجيب، و3) يالحظالبروتين تور العمل في سياق مع بروتين المستجيب آخر، والتدخل في وظيفتها. ولذلك، فإن نشاط بروتين المستجيب تدرس عادة من قبل دراسات overexpression. وللأسف، فإن استخدام overexpression عابرة للبروتين المستجيب له أيضا العديد من السلبيات. وبالتالي، فحوصات تحليل خلية واحدة فقط يمكن أن تستخدم، ونشاط البروتين المستجيب لا يمكن تحليلها إذا كان النشاط من البروتين المستجيب يعتمد على نشاط البروتين المستجيب آخر. للتغلب على ما لا يقل عن العيب الأول، ويمكن استخدام خطوط الخلايا مستقرة. في حالة التعبير عن بروتين المستجيب هي سامة للخلية، هذه ليست مناسبة. في هذا السيناريو، يمكن إنشاء خطوط الخلايا مستقرة ومحرض باستخدام نظام مماثل كما وصفنا هنا للتعبير عابر البروتينات المسببة للموت الخلايا المبرمج (انظر أدناه). ومع ذلك، لدينا النتائج (الشكل 5) تدل على أن التعبير عن CaeB يحمي الخلايا من تمر موت الخلايا المبرمج وبالتالي فهو لاسامة. هناك عدد قليل من الخيارات في تشريح في الخطوة التي ضمن سلسلة أفكارك CaeB يتداخل مع الخلايا الاستقراء. واحد الاحتمالات هو تحديد الشريك ملزم الخلية المضيفة من CaeB. ومع ذلك، وهذا هو صعبة للغاية، وتحديد الشريك ملزم قد لا تساعد على شرح وجهة عمل CaeB ضمن سلسلة أفكارك. والاحتمال الآخر هو استخدام محرضات موت الخلايا المبرمج مختلفة، ولكن CaeB يمنع موت الخلايا المبرمج تحريض من قبل اثنين من محرضات موت الخلايا المبرمج مختلفة، ضوء الأشعة فوق البنفسجية وstaurosporine 7، مشيرا إلى أن هذا النهج قد أيضا لا يؤدي إلى التعرف على وجهة عمل CaeB. احتمال آخر في تضييق نقطة عمل CaeB، التي تم استغلالها هنا، هو استخدام النظام حيث يمكن أن يتسبب في موت الخلايا المبرمج يشير التعاقبي في خطوات محددة.

في حالة التعبير عن بروتين المستجيب البكتيرية التي تم تحديدها كما البروتين من الفائدة يتدخل بالفعل مع الفيزيولوجيا الخلوية، expre لهايمكن أيضا أن توضع ssion تحت سيطرة نظام التعبير محرض، على سبيل المثال، مثل تلك المستخدمة للتعبير عن البروتين المستهدف. ثم، تعبير عن كل من البروتين من الفائدة والبروتين الهدف سوف يكون ذلك حافزا بصورة متزامنة عند إضافة يجند لزراعة الخلايا مما يسمح للمحقق لمراقبة الخلايا للآثار التفاضلية على فسيولوجيا الخلية إشارة، إخراج النظام.

بوضوح، معربا عن بروتين من الفائدة ومحاولة تحديد نقطة عملها في مسار الخلايا معين عن طريق التعبير محرض من البروتينات المسار المحدد يعمل بشكل أفضل إذا كان البروتين من الفائدة يتداخل مع النشاط الفسيولوجي للمسار المحدد. في هذه الحالة، قراءات هو ببساطة عدم وجود إشارة ترتبط عادة مع الطريق، مثل موت الخلايا في حالة الإشارات أفكارك أو تفعيل النسخ في حالة إشارات Wnt. من حيث المبدأ، والبروتينات التي تنشط مسار معين يمكن أيضا بحث مع هذه ر[يب] نظام الفحص. فليس لديها سوى على إقامتها بشكل مختلف، على سبيل المثال، وذلك باستخدام التعبير محرض من ش سي / / ميرنا ضد بروتين مسار واختبار ما إذا كان البروتين من الفائدة يمكن إنقاذ مسار الإشارات. بدلا من ذلك، مثبطات جزيء صغير من بروتينات معينة يمكن استخدامها لقطع نقل الإشارة ضمن المسار ومن ثم للتحقق من مسار الإنقاذ التي كتبها التعبير محرض من البروتين من الفائدة. ومع ذلك، فإن هذا النوع من النهج سيكون تجريبيا أكثر تحديا من بروتوكول المعروضة أعلاه.

اختيار الجينات الهدف المراد بحثها في مقايسة التدخل، من حيث المبدأ، واضحة. فمن الأفضل لاختبار أكبر عدد ممكن من البروتينات في مسار الإشارات المختارة ممكن لتهذيب التعرف على البروتين من موقع مصلحة للتفاعل مع المسار. وينبغي أن يتم هذا بطريقة متكررة، لأنه ليس ممكنا دائما تجريبيا أو حتى من الممكن رصد جميع ينتراك المحتملينشركاء نشوئها في تجربة واحدة. لذا، فمن الأفضل لاختبار أول عدة بروتينات متباعدة بشكل متساو على طول الطريق بأكمله ومن ثم إلى صقل التجربة باستخدام المعلومات المكتسبة في الجولة الأولى. في مسارات الإشارات، تم تعديل العديد من البروتينات بعد translationally، إما عن طريق تعديل التساهمية، مثل الفسفرة أو sumoylation، أو حدثا المعالجة، مثل بروتين الانقسام. وبالتالي، فإن البروتين منها إما في الحالة الأرضية أو في شكل تفعيلها. إذا كان ذلك ممكنا، فمن الأفضل لاختبار كل من أشكال البروتين لسببين. واحد هو أن الشكل تنشيط يسلم أعلى إشارة خرج 31، والتي تمثل تحديا أكثر صرامة للبروتين من الفائدة. لدينا في إثبات صحة المبدأ سبيل المثال، يشير أفكارك، وكاسباس 3 يتم تفعيلها من خلال انشقاق بروتين وdimerization. هذا الحدث تفعيل يمكن محاكاتها بشكل مصطنع من خلال إعادة ترتيب غير المجهزة الجين كاسباس الموالية. يتم وضع الوحيدات صغيرة مصطنعأمام الوحيدات الكبيرة وكلاهما انضم اليهم رابط. يسمى هذا "كاسباس العكسية" ويمثل النموذج تنشيط الإنزيم عندما أعرب 35. وقد تم اختيار هذا يرجع إلى درجة أعلى من نشاطه. السبب الثاني لبحث كل من الدولة الأرض وأشكال تنشيط بروتين الطريق لأنه يسمح احد لتمييز ما إذا كان البروتين من الفائدة يتداخل مع تفعيل البروتين المستهدف، أو إذا كان يتصرف المصب من البروتين في الطريق. في الحالة الأولى، وموت الخلايا يكون تحول دون إذا يتم التعبير عن شكل للدولة أرض الواقع، ولكن ليس إذا كان النموذج تنشيط موجودا. في الحالة الثانية، سوف لا البروتين يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. وهكذا، واختبار كل من أشكال البروتين تعديل يحسن القرار من النظام التحليلي.

استنساخ الجين المستهدف في ناقلات التعبير محرض يتطلب عدة قرارات. أولا، يجب التعبير عن الجينات المستهدفة تحدث بشكل عابر فقط أم أنه من الأفضل لو متجه هو الصورةtably متكاملة في جينوم خط الخلية المضيفة؟ إذا كنت بحاجة التعبير عابرة فقط، ناقل بسيط مثل pUHC13-3 24، والذي يحتوي على مروج تيت التي تعتمد على وموقع بوليا، أو ناقل ثنائي الاتجاه مثل PBI-2 أو PBI-3 36، والتي الأزواج التعبير عن الجينات التي تهم التعبير عن الجينات مراسل لرصد أسهل في التعبير الجيني الهدف، سوف تكون كافية. إذا كان يفضل التعبير مستقرة، يجب استخدام ناقلات مثل pWHE655 33 (الشكل 3). أنه يحتوي على العوازل التي تكتنف وحدة التعبير التحوير لمنع الآثار الموقف في موقع التكامل الجيني من التداخل مع محرض التعبير التحوير. كما أنه يحتوي على صلة، ولكنه أعرب عن مستقل، ومقاومة كاسيت لG418 لتسهيل اختيار أحداث التكامل ناقلات. النتيجة الصافية لهذه التعديلات هي زيادة في عدد الحيوانات المستنسخة مع خصائص تنظيمية ممتازة 33،37،38. [كدنا حد ذاتهايمكن استنساخ تتابعات من الجينات المستهدفة في هذا ناقلات باستخدام تقييد مواقع فريدة من نوعها لEcoRI وEcoRV 33. وقد وصفت استنساخ ناقلات معربا عن عكس كاسباس 3 كدنا] بالتفصيل في إشارة 33. الاستنساخ من ناقلات معربا عن أجريت باكس الإنسان بالقياس. تم تضخيم [كدنا باكس البشري عن طريق PCR من البلازميد pVenus-باكس 39 باستخدام بادئات قليل النوكليوتيد أن يعرض مواقع تقييد لEcoRI وEcoRV. بعد تنقية جزء PCR والتقييد مع الانزيمات اثنين، كان ligated جزء مع pWHE655 مقيد بالمثل، مما أسفر pWHE655TREtight-باكس. الثانية، التي المروج الحد الأدنى هو الأنسب لالتحوير التعبير؟ والحد الأدنى من المروج الأصلي P hCMV * -1 24 يعرض بعض التسرب الخلية من نوع معين 30، ويرجع ذلك جزئيا إلى وجود عناصر وظيفية استجابة محرض-α الانترفيرون 29. وأدى ذلك إلى تطوير الجيل الثاني تيت التي تعتمد علىالمروجين، ويطلق ΔMtetO، TREtight وSG-TRE، مع تباعد تغير وتسلسل بين العناصر تيتو ومع مختلف الحد الأدنى من تسلسل المروج 33،40-42. لأنها تكشف تقلص إلى حد كبير التسرب في غياب دوكسي. من بين هؤلاء مروجي الجيل الثاني، ΔMtetO لديه أدنى التحوير مستوى التعبير في وجود الدوكسيسيكلين 33. TREtight يتوسط وسيطة وSG-TRE أعلى مستوى من التعبير التحوير 33. المزيد من التعديلات والتقليل التعبير خلفية المروج استجابة التتراسيكلين المزيد من 43،44. وهكذا، واختيار أحد المروجين التتراسيكلين استجابة يمكن أن يتم وفقا لمتطلبات أو القيود المفروضة على التحوير منها.

بغض النظر عن نوع المنهج التجريبي، وضيق من التعبير عن بروتين هدف مهم. على سبيل المثال، استحثاث موت الخلايا المبرمج مع أشكال تفعيلها للبروتينات الموالية لأفكارك يؤدي إلى خليةالموت، حتى عندما يتم التعبير عن كميات ضئيلة فقط من البروتين الهدف منها 31-33. يتم تحقيق الصرامة المطلوبة عن طريق إضافة transsilencer تعتمد على التتراسيكلين لنظام تنظيمي مشروط 30. أنه يضمن أن النسخ من المروج محرض وقمع بنشاط، وهو أمر مهم خصوصا عندما يتم تنفيذ transfections عابرة، لأنها عادة ما تكون المتسرب إلى حد ما في التحوير التعبير عنها 30. إذا سبرت مسارات الإشارات التي لا لحث على موت الخلايا، والشرط لتنظيم صارم لهدف التعبير الجيني قد تكون نظم استرخاء ومحرض من دون transsilencer يمكن استخدامها بدلا من 43،44.

ليس لديها نظام تنظيمي محرض تستخدم لتحقيق مسار الإشارات أن يكون نظام تيت. الميزة الرئيسية لهو أنه قد استخدمت بشكل مكثف في خلايا الثدييات لأكثر من 20 عاما حتى الآن، وأنه هو الأكثر تطورا وأفضل CHaracterized نظام التحكم محرض. ومع ذلك، هناك على الأقل 25 النظم التنظيمية الشرطية الأخرى 45،46 يمكن الاستعانة بدلا من ذلك، أو بالإضافة إلى نظام تيت. قد يكون اثنين أو ثلاثة أنظمة مختلفة محرض مفيدة في الكشف عن متقاربة مسارات إشارات أو لاختبار التكرار إما الجينات المستهدفة أو البروتين من الفائدة.

الإجراء المقدمة هنا يجب أن تعمل مع الكفاءات ترنسفكأيشن التي تنتج في إشارة خرج قوية وموثوق بها من مسار الإشارات المعنية التي يتم بحثها. لأن خطوط الخلايا مستقرة تعبر عن بروتين من الفائدة بطريقة متجانسة (الشكل 4B)، وسبر كل الخلايا التي يتم عابر. مع البلازميد محرض التعبير عن بروتين من الفائدة للتدخل من البروتين في المصالح مع مسار الإشارات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Tags

العدوى، العدد 100، موت الخلايا المبرمج، باكس، كاسباس 3،
تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck,… More

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter