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Immunology and Infection

एक inducible अभिव्यक्ति प्रणाली लागू करने Intracellular संकेतन के साथ बैक्टीरियल विषैलापन कारक के हस्तक्षेप के अध्ययन करने के लिए

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52903
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

Abstract

यहाँ प्रस्तुत तकनीक एक संकेतन मार्ग के घटकों के साथ सूचना का आदान प्रदान, जिनमें से एक पर एक लक्ष्य प्रोटीन, या वैकल्पिक रूप से एक छोटा सा अणु कदम का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। विधि आधारित है, एक हाथ पर, एक विशेष प्रोटीन की inducible अभिव्यक्ति पर चयनित संकेत झरना में एक परिभाषित और पूर्व निर्धारित कदम पर एक संकेतन घटना आरंभ करने के लिए। व्यक्त लक्ष्य प्रोटीन की गतिविधि को प्राप्त किया जाता है कि संकेतन मार्ग की readout पर निर्भर करता है, नदी के ऊपर स्थित या शुरू की संकेत घटना के बहाव है अगर सहवर्ती अभिव्यक्ति, दूसरे हाथ पर, हित के जीन की तो अन्वेषक का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। इधर, apoptotic झरना प्रोटोकॉल कार्यक्षमता प्रदर्शित करने के लिए एक परिभाषित संकेतन मार्ग के रूप में चयनित किया गया था। ऐसे Coxiella burnetii के रूप में रोगजनक बैक्टीरिया, सेल में बैक्टीरियल अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए मेजबान सेल में मेजबान कोशिका मृत्यु प्रेरण के साथ हस्तक्षेप है कि प्रेरक प्रोटीन सरकाना और बढ़ावा देने के लिए उनकेजीव में प्रसार। सी. burnetii प्रेरक प्रोटीन CaeB प्रभावी ढंग से यूवी प्रकाश के साथ या staurosporine के साथ एपोप्टोसिस के शामिल होने के बाद मेजबान कोशिका मृत्यु को रोकता है। कदम CaeB apoptotic संकेत के प्रचार-प्रसार के साथ हस्तक्षेप, जिस पर नीचे संकीर्ण करने के लिए, अच्छी तरह से विशेषता समर्थक apoptotic गतिविधि के साथ चयनित प्रोटीन एक डॉक्सीसाइक्लिन-inducible ढंग से क्षणिक व्यक्त किया गया। CaeB इन प्रोटीनों की नदी के ऊपर कार्य करता है, एपोप्टोसिस निर्बाध आगे बढ़ना होगा। CaeB बहाव के कार्य करता है, कोशिका मृत्यु हिचकते किया जाएगा। चयनित परीक्षण प्रोटीन प्रमुख जल्लाद प्रोटीज है जो माइटोकॉन्ड्रिया के स्तर पर, और कस्पासे 3, में कार्य करता है जो Bax थे। CaeB Bax अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित कोशिका मृत्यु के साथ हस्तक्षेप, लेकिन नहीं कस्पासे 3 अभिव्यक्ति के द्वारा। CaeB, इस प्रकार, इन दो प्रोटीन के बीच apoptotic झरना के साथ सूचना का आदान प्रदान।

Introduction

कई ग्राम नकारात्मक बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की डाह यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं का अपहरण करने के लिए विशेष स्राव सिस्टम पर निर्भर करता है। जीवाणु सेलुलर और जैव रासायनिक गतिविधियों की एक किस्म मिलाना मेजबान सेल में बैक्टीरियल विषैलापन प्रोटीन (प्रभावोत्पादक) इंजेक्षन करने के लिए इन स्राव सिस्टम का उपयोग करें। प्रेरक प्रोटीन का अध्ययन मेजबान / रोगज़नक़ बातचीत के बुनियादी पहलुओं में, लेकिन यह भी कोशिकाओं 1 के मूल जीव विज्ञान में उल्लेखनीय अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है ही नहीं। मेजबान सेल apoptosis के मॉड्यूलेशन कई इंट्रासेल्युलर रोगजनकों के लिए एक महत्वपूर्ण डाह तंत्र होना दिखाया गया है, और एपोप्टोसिस modulating प्रेरक प्रोटीन की एक संख्या 2-9 पहचान की गई है। हालांकि, गतिविधि के अपने सटीक आणविक तंत्र कई मामलों में मायावी रहते हैं।

Apoptosis, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का एक रूप है, संक्रमण 10 के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एपोप्टोसिस के लिए अग्रणी दो मुख्य रास्तेपहचान की गई: प्लाज्मा झिल्ली (बाह्य एपोप्टोसिस) में कोशिका मृत्यु रिसेप्टर्स के माध्यम से माइटोकांड्रिया (आंतरिक एपोप्टोसिस) या संकेत के प्रत्यक्ष पारगमन को लक्षित। आंतरिक या माइटोकांड्रिया की मध्यस्थता कोशिका मृत्यु मार्ग इंट्रासेल्युलर संकेतों से चालू होने और Bax और बक, बीसीएल -2 परिवार के दो समर्थक apoptotic सदस्यों की सक्रियता शामिल है। यह परिवार कोशिका मृत्यु 11-14 नियंत्रण है कि समर्थक और विरोधी apoptotic नियामक प्रोटीन से बना है। Bax और बक कोशिका द्रव्य में साइटोक्रोम सी विज्ञप्ति में जिसके परिणामस्वरूप, माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली के बाद permeabilization के द्वारा पीछा के apoptosis के एक्टिवेशन oligomerization की ओर जाता है। साइटोक्रोम ग रिलीज apoptosome 15 में कस्पासे 9 के सक्रियण के माध्यम से प्रेरक caspases 3 और 7 के सक्रियण शुरू की। यह दूसरों के बीच में, कोशिका की सतह पर 16 phosphatidylserine के प्रदर्शन में यह परिणाम है कि, चयनित substrates के प्रोटियोलिसिस की ओर जाता है और चर्चा टुकड़े कि एक समर्पित DNase मुक्त कर देते हैंromatin 17,18।

एक व्यक्ति प्रेरक प्रोटीन में हस्तक्षेप करने apoptotic झरना के भीतर, एक inducible अभिव्यक्ति प्रणाली 19 नियोजित किया गया था, जहां निर्धारित करने के लिए आदेश में। Transgenes की सशर्त अभिव्यक्ति के लिए नियामक प्रणालियों कोशिका के भीतर एक प्रोटीन के समारोह या ऊतक, अंग और जीव के विकास के लिए इसके महत्व है, साथ ही दीक्षा, प्रगति और रोग 20-23 के रखरखाव के दौरान विश्लेषण में एक अमूल्य उपकरण किया गया है। आमतौर पर, इस तरह के Tet सिस्टम यहां कार्यरत 24 के रूप में inducible नियंत्रण प्रणाली, एक कृत्रिम प्रतिलेखन इकाई (चित्रा 1 देखें) के रूप में। एक घटक ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण या 24,26 मुंह बंद करने की मध्यस्थता करता है कि एक स्तनधारी प्रोटीन डोमेन के लिए जीवाणु प्रतिलेखन repressor tetr 25 के विलय से गठित TTA (टेट्रासाइक्लिन निर्भर प्रतिलेखन उत्प्रेरक) नामक एक कृत्रिम रूप से इंजीनियर प्रतिलेखन कारक है। दूसरे घटक एक संकर हैप्रमोटर, कम से कम एक टाटा-बॉक्स और एक प्रतिलेखन दीक्षा साइट से युक्त, एक यूकेरियोटिक न्यूनतम प्रमोटर से मिलकर, TRE (टेट्रासाइक्लिन उत्तरदायी तत्व) करार दिया tetr, teto 24,25 के लिए आत्मीय डीएनए बाध्यकारी साइट के कई दोहराता करने के लिए शामिल हो गए। तीसरे घटक tetr, टेट्रासाइक्लिन या ऐसे anhydrotetracycline या डॉक्सीसाइक्लिन 25 के रूप में अपनी डेरिवेटिव, में से एक की प्राकृतिक लिगेंड है। संस्कृति के माध्यम से ligand के अलावा पर, tetr teto के लिए अपने संबंध खो देता है और TRE से विखंडित। नतीजतन, लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को समाप्त कर दिया गया है। Transgene अभिव्यक्ति है, इस प्रकार, कसकर दोनों सेल संस्कृति में एक समय और खुराक पर निर्भर ढंग से और जानवरों 20,23,24 में नियंत्रित किया जा सकता है। TTA के साथ, transgene अभिव्यक्ति एक टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में छोड़कर, रचनात्मक रूप में होता है। टेट्रासाइक्लिन पहले transgene expressio से पहले, इस प्रणाली से हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि यह साइटोटोक्सिक या oncogenic प्रोटीन के अध्ययन में एक नुकसान हो सकता हैएन होता है और सेल पर लक्ष्य प्रोटीन के प्रभाव पर नजर रखी जा सकती है। इस समय लेने वाली हो सकता है और विशेष रूप से ट्रांसजेनिक जानवरों 27 में, हमेशा पूरा नहीं हुआ है सकते हैं। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति के लिए एक उलटा प्रतिक्रिया के साथ एक tetr उत्परिवर्ती एक नया प्रतिलेखन कारक उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, rtTA 28 (TTA रिवर्स)। यह केवल TRE को बांधता है और समन्वित रूप से, डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में प्रतिलेखन सक्रिय हो जाता है। प्रणाली, यानी की अवशिष्ट leakiness।, TRE बाध्य प्रतिलेखन कारक के अभाव में transgene अभिव्यक्ति, एक जीनोमिक एकीकरण स्थल पर स्थिति प्रभाव से या तो (i) प्रारंभिक (ii) TRE में ही 29 या (iii) गैर से से -specific TTA / rtTA 28 के बंधन, एक अतिरिक्त ट्रांसक्रिप्शनल रवशामक शुरू करने से संबोधित किया गया था, इस प्रणाली के लिए (टेट्रासाइक्लिन निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल रवशामक) 30 टीटीएस करार दिया। यह rtTA (चित्रा 1 देखें) के साथ मिलकर एक दोहरी नियामक नेटवर्क रूपों।डॉक्सीसाइक्लिन के अभाव में, टीटीएस TRE को बांधता है और सक्रिय रूप से किसी भी शेष प्रतिलेखन नीचे बन्द हो जाता है। डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में, टीटीएस TRE से विखंडित और rtTA एक ​​साथ लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति उत्प्रेरण बांधता है। तंगी के इस अतिरिक्त परत अत्यधिक सक्रिय साइटोटोक्सिक प्रोटीन 31-34 व्यक्त करने के लिए अक्सर आवश्यक है।

इस कसकर नियंत्रित दोहरे नियामक प्रणाली का प्रयोग, apoptotic झरना दिया प्रेरक प्रोटीन एपोप्टोसिस प्रेरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि क्या के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है एक परिभाषित कदम पर शुरू किया जा सकता है। इस पद्धति का ही जीवाणु प्रेरक प्रोटीन की विरोधी apoptotic गतिविधि का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है लेकिन यह भी समर्थक apoptotic या जहरीले प्रोटीन की inducible अभिव्यक्ति के लिए, या अन्य संकेत दे रास्ते के साथ हस्तक्षेप विदारक के लिए नहीं किया जा सकता।

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Protocol

रुचि के प्रोटीन व्यक्त स्थिर सेल लाइन्स 1. पीढ़ी

  1. गर्मी निष्क्रिय एफसीएस और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़कर मीडिया तैयार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Dulbecco's GlutaMAX-मैं, पाइरूवेट, और 4.5 ग्राम / एल डी ग्लूकोज के साथ पूरक ईगल मध्यम (DMEM) को संशोधित करने के लिए।
  2. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया में HEK293 कोशिकाओं खेती। हर तीसरे दिन कोशिकाओं उप खेती। मीडिया निकालें और 15 मिलीलीटर ताजा मीडिया में कोशिकाओं resuspend। एक नया 75 सेमी 2 सेल संस्कृति कुप्पी में पिपेट 1 मिलीग्राम और 14 मिलीग्राम मीडिया जोड़ें।
  3. एक hemocytometer का उपयोग करके सेल नंबर का विश्लेषण करें।
  4. अच्छी तरह से प्रति 2 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर 6 अच्छी तरह से थाली में बीज HEK293 कोशिकाओं और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. अभिकर्मक के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के निर्माता द्वारा प्रदान की गई प्रोटोकॉल का उपयोग करें। अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर pEGFP-सी 2 या pEGFP-सी 2-CaeB के साथ कोशिकाओं transfect। का उपयोग करें, अभिकर्मक reag को गर्म करने से पहलेईएनटी और आरटी करने के लिए आवश्यक मीडिया। डीएनए के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक का अनुपात 1: 3 का उपयोग करें।
    1. विस्तार में, पिपेट सीधे सीरम मुक्त DMEM माध्यम के 50 μl में अभिकर्मक अभिकर्मक के 1.5 μl। जटिल गठन के लिए, अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त मिश्रण करने के लिए डीएनए एन्कोडिंग GFP या GFP-CaeB के 0.5 माइक्रोग्राम पिपेट और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. एक बूंद-वार ढंग से प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़कर कोशिकाओं transfect और 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. 1 मिलीग्राम जोड़ें / 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर GFP सकारात्मक क्लोन के चयन के लिए geneticin एमएल।
  7. : 1 के अनुपात में 6 दिन बाद, एक 1 में मध्यम और HEK293 सतह पर तैरनेवाला को शरण देने के एक 96 अच्छी तरह से थाली में छँटाई प्रवाह cytometry द्वारा एकल कोशिकाओं को अलग। 4966 x जी पर 15 मिनट के लिए centrifuged थे कि सुसंस्कृत मिला हुआ HEK293 कोशिकाओं से HEK293 सतह पर तैरनेवाला उत्पन्न करता है।
  8. अगले दिन, मध्यम 1.5 रोकने के साथ संस्कृति मध्यम जगह0; मिलीग्राम / एमएल geneticin। एक सप्ताह में एक बार मीडिया बदलें। कोशिकाओं को एक मिला हुआ monolayer फार्म हैं, तो एक 24 अच्छी तरह से थाली को हस्तांतरण। 1.5 मिलीग्राम / एमएल geneticin युक्त मीडिया में 5: 1 के अनुपात में एक सप्ताह में दो बार कोशिकाओं उप खेती। अंत में, immunoblot विश्लेषण द्वारा GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण और प्रवाह cytometry।

Immunoblot विश्लेषण द्वारा स्थिर सेल लाइनों के 2. विश्लेषण

  1. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गर्म पीबीएस के साथ एक बार पालन कोशिकाओं को धोने। -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 से 95 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और दुकान के लिए 2x Laemmli नमूना बफर, गर्मी के 100 μl में कोशिकाओं Resuspend।
  2. एक 12% एसडीएस पृष्ठ जेल पर नमूना प्रति लगभग 4 एक्स 10 4 कोशिकाओं लोड करें। इसके अतिरिक्त, एक आणविक वजन मार्कर के रूप में एक वाणिज्यिक प्रोटीन सीढ़ी का भार 6 μl। 1x Laemmli चल बफर के साथ 45-60 मिनट के लिए 180 वी के एक निरंतर वोल्टेज के तहत एक जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में जैल चलाएँ।
  3. PVDF झिल्ली पर ब्लाट प्रोटीन (0 के ध्यान में लीन होना आकार।एक ट्रांस-धब्बा एसडी अर्द्ध शुष्क स्थानांतरण सेल का उपयोग कर 60 मिनट के लिए 16 वी की एक निरंतर वोल्टेज में 45 माइक्रोन)।
  4. पीबीएस में 5% नोनफेट शुष्क दूध के 10 मिलीग्राम / 0.05% के बीच 20 (एमपीटी) आरटी पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक झिल्ली।
  5. एमपीटी के 4 मिलीलीटर में विरोधी GFP एंटीबॉडी के 4 μl पतला और 4 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली हे / एन सेते हैं।
  6. पीबीएस के 10 मिलीग्राम / 0.05% के बीच 20 के साथ तीन 10 मिनट धोने के चरणों को पूरा करें।
  7. एमपीटी के 4 मिलीलीटर में हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 0.8 μl साथ झिल्ली सेते हैं।
  8. आरटी पर 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ झिल्ली तीन बार धोने / 0.05% के बीच 20 (2.6 में वर्णित के रूप में) और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट के साथ हॉर्सरैडिश peroxidase गतिविधि का पता लगाने। प्रोटीन बैंड कल्पना करने के लिए फिल्म के विकास के लिए मानक उपकरण को लागू करें।

3. एक प्रवाह cytometer का उपयोग कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

  1. पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend। आगे सुप्रीम कोर्ट को समायोजित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में HEK293 कोशिकाओं का प्रयोग करेंatter (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) की कोशिकाओं पैमाने पर कर रहे हैं। सेल दोहरी, समुच्चय और सेल मलबे को छोड़कर द्वारा जीवित कोशिकाओं पर एक गेट ड्रा।
  2. बेदाग कोशिकाओं दूर FL1 चैनल (488 एनएम आर्गन लेजर) के लिए हिस्टोग्राम के छोड़ दिया पर कर रहे हैं इतना है कि photomultiplier ट्यूब (पी एम टी) लाभ समायोजित करें।
  3. HEK293-GFP और HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए FL1 चैनल का हिस्टोग्राम खुला और gated आबादी पर 10,000 घटनाओं के अधिग्रहण।
  4. वाणिज्यिक FACS विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण।

Inducible अभिव्यक्ति वेक्टर सिस्टम के साथ स्थिर सेल लाइन 4. अभिकर्मक

  1. बीज HEK293 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक / अच्छी तरह से 1 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर एक 12 अच्छी तरह से थाली में GFP या GFP-CaeB व्यक्त।
  2. 19 घंटा के बाद बोने, नियामक प्लाज्मिड और प्रतिक्रिया प्लाज्मिड या तो एन्कोडिंग Bax या सक्रिय कस्पासे 3 के साथ कोशिकाओं सह transfect।
    1. स्थिर HEK293 कोशिकाओं सह transfectpWHE125-पी नियामक प्लाज्मिड के 100 एनजी (चित्रा 2) और प्रतिक्रिया प्लास्मिड pWHE655-hBax या pWHE655-revCasp3 (चित्रा 3) और polyethylenimine के 0.4 μl के 100 एनजी के साथ।
    2. Opti- सदस्य माध्यम के 75 μl में डीएनए और polyethylenimine अभिकर्मक अभिकर्मक प्रत्येक को तैयार है और आरटी पर ठीक 5 मिनट के लिए सेते हैं। जटिल गठन के लिए, आरटी पर 15 मिनट के लिए दोनों के मिश्रण को एक साथ सेते हैं।
  3. Polyethylenimine / डीएनए समाधान बूंद-वार कोशिकाओं को जोड़ने और 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

Apoptosis के 5. प्रेरण

  1. बाद अभिकर्मक 5 घंटा, संस्कृति के माध्यम से 1 माइक्रोग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन के अलावा द्वारा समर्थक apoptotic प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित। 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।

Immunoblot विश्लेषण द्वारा मेजबान सेल apoptosis के 6. विश्लेषण

  1. ज करने से पहले कोशिकाओं का निरीक्षणप्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत arvesting कोशिका मृत्यु शामिल करने के लिए जाँच करने के लिए। Apoptotic कोशिकाओं मर सेल आसपास के apoptotic निकायों की उपस्थिति से detectible हैं।
  2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गर्म पीबीएस के साथ एक बार पालन कोशिकाओं को धोने। -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 से 95 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और दुकान के लिए 2x Laemmli नमूना बफर, गर्मी के 100 μl में कोशिकाओं Resuspend।
  3. एक 12% एसडीएस पृष्ठ जेल पर नमूना प्रति लगभग 4 एक्स 10 4 कोशिकाओं लोड करें। इसके अतिरिक्त, एक आणविक वजन मार्कर के रूप में एक वाणिज्यिक प्रोटीन सीढ़ी का भार 6 μl। 1x Laemmli चल बफर के साथ 45-60 मिनट के लिए 180 वी के एक निरंतर वोल्टेज के तहत एक जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में जैल चलाएँ।
  4. एक ट्रांस-धब्बा एसडी अर्द्ध शुष्क स्थानांतरण सेल का उपयोग कर 60 मिनट के लिए 16 वी की एक निरंतर वोल्टेज में PVDF झिल्ली पर ब्लाट प्रोटीन (0.45 माइक्रोन के ध्यान में लीन होना आकार)।
  5. पीबीएस में 5% नोनफेट शुष्क दूध के 10 मिलीग्राम / 0.05% के बीच 20 (एमपीटी) आरटी पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक झिल्ली।
  6. 4 μ पतलाएमपीटी के 4 मिलीलीटर में विरोधी cleaved पाली ADP-राइबोज़ पोलीमर्स (PARP) प्रतिरक्षी के एल और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  7. पीबीएस के 10 मिलीग्राम / 0.05% के बीच 20 के साथ तीन 10 मिनट धोने के चरणों को पूरा करें।
  8. 4 मिलीलीटर एमपीटी में पतला 0.8 μl हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं।
  9. आरटी पर 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ झिल्ली तीन बार धोने / 0.05% के बीच 20 (6.7 में वर्णित के रूप में) और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट के साथ हॉर्सरैडिश peroxidase गतिविधि का पता लगाने। प्रोटीन बैंड कल्पना करने के लिए फिल्म के विकास के लिए मानक उपकरण को लागू करें।
  10. 7 मिलीलीटर वेस्टर्न ब्लाट स्ट्रिपिंग बफर के साथ आरटी पर 30 मिनट ऊष्मायन से बंधे एंटीबॉडी निकालें।
  11. पीबीएस के साथ तीन washes / 0.05% (6.7 में वर्णित) बीच 20 के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर एमपीटी हे / एन के 4 मिलीलीटर में विरोधी actin के एंटीबॉडी के 4 μl साथ झिल्ली की जांच।
  12. (6.7 में वर्णित) एमपीटी के साथ तीन धोने कदम के बाद, हो के 0.8 μl साथ झिल्ली सेतेrseradish peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी एमपीटी के 4 मिलीलीटर में पतला।
  13. आरटी पर 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, 0.05% / पीबीएस के साथ झिल्ली 6.7 में वर्णित के रूप में बीच 20 (तीन बार धोने और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट के साथ हॉर्सरैडिश peroxidase गतिविधि का पता लगाने। प्रोटीन बैंड कल्पना करने के लिए फिल्म के विकास के लिए मानक उपकरण को लागू करें।
    नोट: सभी ऊष्मायन चरणों का संकेत समय और तापमान के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर प्रदर्शन किया गया।

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Representative Results

सबसे पहले, एक GFP-संलयन प्रोटीन के रूप में स्थिरतापूर्वक ब्याज (CaeB) के प्रोटीन व्यक्त HEK293 सेल लाइनों स्थापित किए गए थे। एक नियंत्रण के रूप में, स्थिरतापूर्वक GFP व्यक्त HEK293 सेल लाइनों भी उत्पन्न किया गया। GFP और GFP-CaeB की अभिव्यक्ति immunoblot विश्लेषण द्वारा सत्यापित किया गया था। प्रतिनिधि immunoblot (चित्रा -4 ए) GFP और GFP-CaeB के स्थिर और स्पष्ट रूप से पहचाने अभिव्यक्ति को दर्शाता है। सभी कोशिकाओं GFP या GFP-CaeB व्यक्त चाहे हालांकि, इस परख निर्धारित नहीं कर सकता। इसलिए, stably ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 सेल लाइनों भी फ्लो द्वारा विश्लेषण किया गया। 4B चित्रा में दिखाया गया है, दोनों सेल लाइनों में कोशिकाओं के 90% से अधिक GFP व्यक्त किया। इस प्रकार, इन स्थिर सेल लाइनों आगे CaeB के समारोह का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अगले चरण में, CaeB के विरोधी apoptotic गतिविधि cleaved PARP के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot विश्लेषण assayed द्वारा किया गया था। परमाणु PARP के proteolytic दरार डीएनए की मरम्मत गतिविधि निष्क्रिय और termi का एक विशिष्ट मार्कर हैapoptosis के अंतिम चरणों। PARP की दरार GFP की अभिव्यक्ति है, और न ही GFP-CaeB के न होने की कोशिकाओं को विषाक्त है कि प्रदर्शन, HEK293 GFP या HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं में नहीं पाया जाता है। कोशिकाओं staurosporine के साथ इलाज किया गया हालांकि, जब आंतरिक apoptosis के एक शक्तिशाली inducer, PARP की दरार (चित्रा 5) का पता चला था। महत्वपूर्ण बात है, HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं Coxiella burnetii प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली प्रेरक प्रोटीन CaeB 7 का विरोधी apoptotic गतिविधि का संकेत है, PARP की दरार कम दिखा रहे हैं।

कदम CaeB apoptotic मार्ग के साथ हस्तक्षेप, जिस पर विश्लेषण करने के लिए, Tet प्रणाली पर नियुक्त किया गया था। विस्तार में, HEK293 GFP या HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं को एक नियामक प्लाज्मिड रचनात्मक रूप में एक डॉक्सीसाइक्लिन नियंत्रित दोहरी repressor / उत्प्रेरक सेटअप (चित्रा 2) और एक PTRE प्रतिक्रिया प्लाज्मिड एन्कोडिंग या तो पूरी लंबाई मानव Bax या उत्प्रेरित रूप से व्यक्त करने के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया मानव कस्पासे 3, (revCasp 3 करार दियाचित्र तीन)। गैर-उत्प्रेरण शर्तों (चित्रा 6) के तहत PARP दरार की कमी से प्रदर्शन के रूप में इस प्रणाली को कसकर नियंत्रित किया जाता है। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए डॉक्सीसाइक्लिन की वृद्धि Bax की अभिव्यक्ति या revCasp 3. CaeB तो अभिव्यक्ति और Bax के बाद के सक्रियण द्वारा उत्पन्न apoptotic संकेत CaeB अभिव्यक्ति द्वारा अवरुद्ध किया जाना चाहिए Bax के बहाव apoptotic मार्ग, के साथ हस्तक्षेप के परिणामस्वरूप। दरअसल, HEK293 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त GFP-CaeB HEK293-GFP कोशिकाओं स्पष्ट PARP दरार प्रदर्शित जबकि गहराई से, डॉक्सीसाइक्लिन नियंत्रित Bax अभिव्यक्ति द्वारा एपोप्टोसिस प्रेरण रोकती हैं। इस परिणाम का संकेत है कि Bax सक्रियण के बहाव CaeB ब्लॉक एपोप्टोसिस प्रेरण। Apoptotic मार्ग में एक देर घटना - अगला, यह CaeB कस्पासे के साथ 3 सक्रियण हस्तक्षेप कर सकते हैं कि क्या विश्लेषण किया गया था। प्रेरक कस्पासे 3 एक बार ACTIV है यह दर्शाता है कि HEK293-GFP कोशिकाओं, साथ ही HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं, प्रदर्शनी PARP दरार (चित्रा 6),पैदा, CaeB से होने वाली एपोप्टोसिस नहीं रोका जा सकता। में ले ली एक साथ, इन आंकड़ों CaeB Bax और कस्पासे 3 सक्रियण के बीच में कार्य करता है कि प्रदर्शित करता है।

चित्र 1
चित्रा टेट्रासाइक्लिन नियामक प्रणाली के 1. योजनाबद्ध सिंहावलोकन। Tet प्रणाली पर दो अलग-अलग प्लास्मिड, विनियामक और प्रतिक्रिया प्लास्मिड से बना है। और Tet उत्तरदायी रिवर्स transactivator (rtTA, खुला वृत्त); नियामक प्लाज्मिड Tet उत्तरदायी transsilencer (भरा चक्र टीटीएस) encodes। दोनों प्रोटीन रचनात्मक रूप में मजबूत, विधान बढ़ाव कारक -1 अल्फा प्रमोटर (पी एफई-1 ए) के नियंत्रण में व्यक्त कर रहे हैं। टीटीएस और rtTA काइमेरिक (क्रमशः, रवशामक या उत्प्रेरक) एक यूकेरियोटिक ट्रांसक्रिप्शनल विनियामक डोमेन से मिलकर प्रतिलेखन कारक है और एक जीवाणु टेट्रासाइक्लिन repressor (tetr) कर रहे हैं। Tetr डीएनए सात TET के लिए बाध्य mediates (teto) दृश्यों। teto एक साथ Tet उत्तरदायी तत्व (TRE) के गठन, inducible न्यूनतम cytomegalovirus के प्रमोटर (पी सीएमवी) के अपस्ट्रीम में स्थित है। शर्तों गैर उत्प्रेरण के तहत, टीटीएस अभिव्यक्ति को रोकने TRE के लिए बाध्य है। डॉक्सीसाइक्लिन के अलावा (Dox; भरा हीरा) के बाद, rtTA Dox गठनात्मक परिवर्तन और सक्रियण के लिए अग्रणी के साथ सूचना का आदान प्रदान। सक्रिय rtTA इस प्रकार एपोप्टोसिस प्रेरण और कोशिका मृत्यु के लिए अग्रणी संबंधित लक्ष्य जीन Bax और कस्पासे 3 की प्रतिलेखन, की अनुमति प्रतिक्रिया प्लाज्मिड पर टीटीएस बदल देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
नियामक प्लाज्मिड pWHE125 चित्रा 2. योजनाबद्ध सिंहावलोकन। बीएसी में प्रचार के लिए तत्वों आवश्यकTeria, प्रतिकृति का मूल (मूल PBR) और एम्पीसिलीन के खिलाफ एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट (एएमपी आर) सहित, और इस तरह के मानव साइटोमेगालोवायरस के मजबूत, विधान तत्काल जल्दी प्रमोटर / बढ़ाने के रूप में Tet-transregulators, की अभिव्यक्ति (पी के लिए / ई एचसीएम्वी), पोलियो वायरस (पीवी-IRES) और सिमीयन वायरस 40 (SV40 Pólya) प्रदर्शित कर रहे हैं से एक Pólya-स्थल से एक आंतरिक राइबोसोम बाध्यकारी साइट। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
प्रतिक्रिया प्लाज्मिड की चित्रा 3. योजनाबद्ध सिंहावलोकन। तत्वों प्रतिकृति का मूल (मूल PBR) और एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट (एएमपी आर) सहित बैक्टीरिया, में प्रचार के लिए आवश्यक है, और इस तरह के transgene expressi के रूप में यूकेरियोट्स में inducible अभिव्यक्ति के लिएTet-निर्भर न्यूनतम प्रमोटर TREtight (पी TREtight), ब्याज मानव Bax (hBax) के जीन और सिमीयन वायरस 40 (SV40 Pólya) से एक Pólya साइट के साथ कैसेट पर, चित्रित कर रहे हैं। transgene अभिव्यक्ति कैसेट चिकन HS4 इन्सुलेटर कोर अनुक्रम (HS4 कोर) की दो प्रतियों में से मिलकर प्रत्यक्ष दोहराता द्वारा flanked है। इसके अतिरिक्त, एक murine phosphoglycerate काइनेज 1 प्रमोटर (पी mPGK) से मिलकर G418 प्रतिरोध कैसेट, एक neomycin प्रतिरोध जीन (G418 आर) और एक मानव thymidine kinase Pólya साइट (टी Pólya) मौजूद है। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्रा 4
चित्रा 4. HEK293-GFP और HEK293-GFP-CaeB स्थिरतापूर्वक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं। (ए) HEK293-GFP और के पूरे सेल lysatesHEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं स्थिर अभिव्यक्ति को दिखाने के लिए GFP के लिए immunoblotted गया। HEK293-GFP और HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं (बी) प्रतिनिधि फ्लो (FACS) विश्लेषण GFP अभिव्यक्ति की तीव्रता को प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा staurosporine प्रेरित एपोप्टोसिस। HEK293-GFP और HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं पर GFP-CaeB की अभिव्यक्ति की 5. प्रभाव आंतरिक apoptosis को उत्पन्न करने के लिए 6 घंटे के लिए 4 सुक्ष्ममापी staurosporine के साथ इलाज किया गया। Apoptosis Cleaved PARP immunoblot विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया था। PARP दरार HEK293-GFP कोशिकाओं की तुलना में HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं में कम हो गया था। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े की।

चित्रा 6
Teton प्रणाली के 6 चित्रा उपयोग CaeB की कार्रवाई के मुद्दे पर नीचे संकीर्ण करने के लिए। (ए) Apoptosis HEK293-GFP और HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं में Bax की अभिव्यक्ति के द्वारा प्रेरित किया गया था। Apoptosis Cleaved PARP immunoblot विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया था। PARP दरार HEK293-GFP कोशिकाओं की तुलना में HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं में कम हो गया था। (बी) Apoptosis HEK293-GFP और HEK293-GFP-CaeB कोशिकाओं में revCasp 3 की अभिव्यक्ति के द्वारा प्रेरित किया गया था। Apoptosis Cleaved PARP immunoblot विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया था। PARP दरार HEK293-GFP-CaeB और HEK293-GFP कोशिकाओं में बराबर था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कई रोगजनक बैक्टीरिया का स्राव या मेजबान सेल में बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन सरकाना करने के स्राव सिस्टम बंदरगाह। ये प्रेरक प्रोटीन बैक्टीरिया जीवित है और उनके संबंधित इंट्रासेल्युलर आला में दोहराने के लिए अनुमति देता है, मेजबान सेल में प्रक्रियाओं और रास्ते मिलाना करने की क्षमता है। जैव रासायनिक गतिविधियों और प्रेरक प्रोटीन की आणविक तंत्र को समझना pathogenicity का एक बेहतर समझ की दिशा में मदद मिलेगी और बीमारी से निपटने के लिए नए चिकित्सकीय उपकरण को विकसित करने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, प्रेरक प्रोटीन अक्सर मेजबान सेल गतिविधियों की नकल उतार द्वारा उनके कार्य डालती है, वे भी कोशिकाओं 1 के जीव विज्ञान के बारे में अधिक जानने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रेरक प्रोटीन के बीच 1) कार्यात्मक अतिरेक, प्रेरक प्रोटीन की सगाई की 2) लौकिक विनियमन, और 3) effec: हालांकि, एक भी प्रेरक प्रोटीन की जैव रासायनिक गतिविधि का अध्ययन करने के लिए कई कारणों के लिए जटिल साबित हो गया हैअपने कार्य के साथ हस्तक्षेप, एक और प्रेरक प्रोटीन के साथ संदर्भ में काम कर रहे टो प्रोटीन। इसलिए, एक प्रेरक प्रोटीन की गतिविधि सामान्यतः overexpression अध्ययन के द्वारा अध्ययन किया है। दुर्भाग्य से, प्रेरक प्रोटीन की क्षणिक overexpression के प्रयोग की भी कई कमियां हैं। इस प्रकार, केवल एकल कक्ष विश्लेषण assays के नियोजित किया जा सकता है, और प्रेरक प्रोटीन की गतिविधि को एक और प्रेरक प्रोटीन की गतिविधि पर निर्भर करता है अगर प्रेरक प्रोटीन की गतिविधि विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। कम से कम पहले खामी को दूर करने, स्थिर सेल लाइनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मामले में प्रेरक प्रोटीन की अभिव्यक्ति सेल के लिए, यह उपयुक्त नहीं है विषैला होता है। हम एपोप्टोसिस उत्प्रेरण प्रोटीन (देखें नीचे) के क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए यहाँ का वर्णन के रूप में इस परिदृश्य में, स्थिर और inducible सेल लाइनों एक ऐसी ही प्रणाली का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है। हालांकि, हमारे परिणाम (चित्रा 5) CaeB की अभिव्यक्ति एपोप्टोसिस के दौर से गुजर से कोशिकाओं की रक्षा करता है और इसलिए नहीं है कि दिखानाविषाक्त। जिस पर CaeB एपोप्टोसिस प्रेरण के साथ हस्तक्षेप apoptotic झरना के भीतर कदम विदारक में कुछ विकल्प हैं। एक संभावना यह CaeB के मेजबान सेल बंधन साथी को निर्धारित है। बहरहाल, यह बहुत चुनौतीपूर्ण है और बाध्यकारी साथी की पहचान apoptotic झरना भीतर CaeB की कार्रवाई की बात समझाने के लिए मदद नहीं कर सकता है। एक और संभावना विभिन्न एपोप्टोसिस inducers उपयोग करने के लिए है, लेकिन CaeB यह दृष्टिकोण भी CaeB की कार्रवाई की बात की पहचान करने के लिए नेतृत्व नहीं हो सकता है यह दर्शाता है कि दो अलग अलग एपोप्टोसिस inducers, यूवी प्रकाश और staurosporine 7 से एपोप्टोसिस प्रेरण को रोकता है। यहां शोषण किया गया था जो CaeB की कार्रवाई के मुद्दे पर नीचे संकुचन में एक और संभावना है, एपोप्टोसिस संकेत झरना परिभाषित कदम पर प्रेरित किया जा सकता है, जहां एक प्रणाली का उपयोग करने के लिए है।

ब्याज की प्रोटीन पहले से ही सेल शरीर क्रिया विज्ञान, इसके Expre के साथ हस्तक्षेप के रूप में चयनित किया गया था कि बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन के मामले अभिव्यक्ति मेंssion भी इस तरह के लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक के रूप में, उदाहरण के लिए एक inducible अभिव्यक्ति प्रणाली के नियंत्रण के तहत रखा जा सकता है। Ligand के सेल शरीर क्रिया विज्ञान पर अंतर प्रभाव के लिए कोशिकाओं की निगरानी के लिए अन्वेषक की इजाजत दी है और इस प्रणाली उत्पादन संकेत सेल संस्कृति से जोड़ा जाता है तब, जब ब्याज और लक्ष्य प्रोटीन के दोनों प्रोटीन की अभिव्यक्ति समन्वित रूप से प्रेरित किया जाएगा।

ब्याज की प्रोटीन चयनित मार्ग की शारीरिक गतिविधि के साथ हस्तक्षेप जाहिर है, अगर ब्याज की एक प्रोटीन व्यक्त और चयनित मार्ग प्रोटीन की inducible अभिव्यक्ति द्वारा एक विशिष्ट इंट्रासेल्युलर मार्ग में कार्रवाई की अपनी बात की पहचान करने की कोशिश कर सबसे अच्छा काम करता है। इस मामले में, readout के सामान्य रूप से इस तरह के Wnt संकेतन के मामले में apoptotic संकेतन या प्रतिलेखन के सक्रियण के मामले में सेल मौत के रूप में, मार्ग के साथ जुड़े एक संकेत के अभाव बस है। सिद्धांत रूप में, एक विशिष्ट मार्ग को सक्रिय प्रोटीन है कि भी इस टी के साथ जांच किया जा सकतापरख प्रणाली के ype। यह केवल एक एसआई / श के inducible अभिव्यक्ति का उपयोग करते हैं, उदाहरण के लिए, अलग ढंग से स्थापित किया जाना है / miRNA के लिए एक मार्ग प्रोटीन के खिलाफ है और ब्याज की प्रोटीन मार्ग संकेतन बचाव कर सकते हैं अगर परीक्षण। वैकल्पिक रूप से, विशिष्ट प्रोटीन के छोटे अणु inhibitors के एक मार्ग के भीतर संकेत पारगमन बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और फिर ब्याज की एक प्रोटीन की inducible अभिव्यक्ति द्वारा मार्ग बचाव के लिए जाँच करने के लिए। हालांकि, दृष्टिकोण के इस प्रकार के ऊपर प्रस्तुत प्रोटोकॉल की तुलना में प्रयोगात्मक अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाएगा।

लक्ष्य जीन का चयन सीधा, सिद्धांत रूप में, हस्तक्षेप परख है में जांच की जा सके। यह ठीक धुन करने के लिए मार्ग के साथ बातचीत के हित की साइट का प्रोटीन की पहचान संभव के रूप में चयनित संकेतन मार्ग में प्रोटीन के रूप में कई परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा है। यह हमेशा के लिए सभी संभावित बातचीत पर नजर रखने के लिए प्रयोगात्मक संभव या यह भी संभव नहीं है, क्योंकि यह एक चलने का फैशन में किया जाना चाहिएएक ही प्रयोग में tion भागीदारी है। इसलिए, यह पहली बार पहले दौर में मिली जानकारी का उपयोग करके प्रयोग को निखारने के लिए तो पूरे मार्ग के साथ समान रूप से स्थान दिया गया है कई प्रोटीन का परीक्षण करने के लिए और सबसे अच्छा है। संकेत दे रास्ते में, कई प्रोटीन ऐसे प्रोटियोलिटिक दरार के रूप में, इस तरह के फास्फारिलीकरण या sumoylation, या एक प्रसंस्करण घटना के रूप में, एक सहसंयोजक संशोधन के द्वारा, या तो पद-translationally संशोधित कर रहे हैं। नतीजतन, संबंधित प्रोटीन एक जमीन राज्य में या एक सक्रिय रूप में या तो है। यदि संभव हो तो, यह दो कारणों के लिए प्रोटीन के दोनों रूपों का परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा है। एक सक्रिय फार्म ब्याज की प्रोटीन के लिए एक और अधिक कठोर चुनौती प्रस्तुत करता है जो एक उच्च उत्पादन संकेत 31, उद्धार करता है। हमारे सबूत की सिद्धांत उदाहरण, apoptotic संकेतन में, कस्पासे 3 प्रोटियोलिटिक दरार और dimerization से सक्रिय है। इस सक्रियण घटना असंसाधित समर्थक कस्पासे जीन उलटफेर द्वारा कृत्रिम रूप से प्रेरित किया जा सकता है। छोटे सबयूनिट कृत्रिम रूप से रखा गया हैबड़े सबयूनिट के सामने है और दोनों में एक linker से जुड़े हुए हैं। यह एक "रिवर्स कस्पासे" करार दिया और 35 व्यक्त जब एंजाइम की सक्रिय फार्म का प्रतिनिधित्व करता है। यह कारण गतिविधि के अपने उच्च डिग्री करने के लिए चुना गया था। एक मार्ग प्रोटीन की जमीन राज्य और सक्रिय रूपों दोनों की जांच के लिए दूसरा कारण यह ब्याज की प्रोटीन लक्ष्य प्रोटीन की सक्रियता के साथ हस्तक्षेप अगर एक भेद करने की अनुमति देता है, क्योंकि है, या यह नीचे की ओर मार्ग में प्रोटीन का कार्य करता है। पहले मामले में, जमीन राज्य फार्म व्यक्त की है अगर कोशिका मृत्यु हिचकते हो जाएगा, लेकिन उत्प्रेरित रूप से मौजूद है, अगर नहीं। दूसरे मामले में, न तो प्रोटीन एपोप्टोसिस को बढ़ावा मिलेगा। इस प्रकार, एक संशोधित प्रोटीन के दोनों रूपों का परीक्षण विश्लेषणात्मक प्रणाली के संकल्प को बेहतर बनाता है।

Inducible अभिव्यक्ति वेक्टर में लक्ष्य जीन क्लोनिंग कई फैसलों की आवश्यकता है। वेक्टर के अगर पहले, लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति केवल क्षणिक उत्पन्न होती है या यह बेहतर है करेगाtably मेजबान सेल लाइन के जीनोम में एकीकृत? केवल क्षणिक अभिव्यक्ति की आवश्यकता है, इस तरह के एक Tet-निर्भर प्रमोटर और एक Pólya साइट, या इस तरह के जीन के PBI -2 या PBI-3 36, जो जोड़ों अभिव्यक्ति के रूप में एक द्विदिश वेक्टर होता है जो pUHC13-3 24 के रूप में एक साधारण वेक्टर लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की आसान निगरानी के लिए एक रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के लिए ब्याज की, पर्याप्त होगा। स्थिर अभिव्यक्ति पसंद किया जाता है, तो इस तरह के pWHE655 33 (चित्रा 3) के रूप में एक वेक्टर इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यह inducible transgene अभिव्यक्ति के साथ हस्तक्षेप से जीनोमिक एकीकरण स्थल पर स्थिति प्रभाव को रोकने के लिए transgene अभिव्यक्ति इकाई पार्श्व कि इंसुलेटर गये हैं। यह भी एक वेक्टर एकीकरण की घटनाओं के चयन की सुविधा के लिए G418 के लिए, प्रतिरोध कैसेट से जुड़ा हुआ है, लेकिन स्वतंत्र रूप से व्यक्त होता है। इन संशोधनों का शुद्ध परिणाम उत्कृष्ट नियामक गुण 33,37,38 के साथ क्लोन की संख्या में वृद्धि हुई है। सीडीएनए एसईलक्ष्य जीन की quences EcoRI और EcoRV 33 के लिए अद्वितीय प्रतिबंध साइटों का उपयोग करके यह वेक्टर में क्लोन किया जा सकता है। रिवर्स कस्पासे 3 सीडीएनए व्यक्त वेक्टर की क्लोनिंग संदर्भ मानव Bax तुलनात्मक रूप से प्रदर्शन किया गया था व्यक्त वेक्टर के 33. क्लोनिंग में विस्तार से वर्णित किया गया था। मानव Bax सीडीएनए EcoRI और EcoRV के लिए प्रतिबंध साइटों का परिचय है कि oligonucleotide प्राइमरों का उपयोग कर प्लाज्मिड pVenus-Bax 39 से पीसीआर से परिलक्षित किया गया था। दो एंजाइमों के साथ पीसीआर टुकड़ा और प्रतिबंध की शुद्धि के बाद, टुकड़ा pWHE655TREtight-Bax उपज है, वैसे ही प्रतिबंधित pWHE655 साथ ligated किया गया था। दूसरा, कम से कम जो प्रमोटर transgene अभिव्यक्ति के लिए सबसे उपयुक्त है? मूल न्यूनतम प्रमोटर पी एचसीएम्वी * -1 कार्यात्मक इंटरफेरॉन α inducible प्रतिक्रिया तत्वों 29 की उपस्थिति के कारण भाग में 24 प्रदर्शित करता है कुछ सेल प्रकार विशिष्ट leakiness 30। यह दूसरी पीढ़ी के विकास के लिए नेतृत्व Tet पर निर्भरप्रमोटरों, teto तत्वों के बीच है और अलग अलग न्यूनतम प्रमोटर दृश्यों 33,40-42 साथ बदल रिक्ति और दृश्यों के साथ ΔMtetO, TREtight और एसजी-TRE, करार दिया। वे बहुत डॉक्सीसाइक्लिन के अभाव में leakiness कम प्रदर्शन। इन दूसरी पीढ़ी के प्रमोटरों के अलावा, ΔMtetO डॉक्सीसाइक्लिन 33 की उपस्थिति में सबसे कम transgene अभिव्यक्ति स्तर पर है। TREtight transgene अभिव्यक्ति 33 के एक मध्यवर्ती और एसजी-TRE के उच्चतम स्तर मध्यस्थता करता है। इसके अलावा संशोधनों टेट्रासाइक्लिन उत्तरदायी प्रमोटर भी अधिक 43,44 की पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति को कम से कम किया है। इस प्रकार, एक टेट्रासाइक्लिन उत्तरदायी प्रमोटर के चुनाव संबंधित transgene की आवश्यकताओं या सीमाओं के अनुसार बनाया जा सकता है।

प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के प्रकार के स्वतंत्र, लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति की तंगी महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, समर्थक apoptotic प्रोटीन के सक्रिय रूपों के साथ apoptosis की प्रेरण सेल की ओर जाता हैसंबंधित लक्ष्य प्रोटीन का केवल न्यूनतम मात्रा 31-33 व्यक्त कर रहे हैं, यहां तक कि जब मौत,। आवश्यक तंगी सशर्त नियामक प्रणाली से 30 एक टेट्रासाइक्लिन निर्भर transsilencer जोड़कर हासिल की है। यह inducible प्रमोटर से प्रतिलेखन सक्रिय रूप से क्षणिक transfections के प्रदर्शन कर रहे हैं जब वे आम तौर पर उनके transgene अभिव्यक्ति 30 में बल्कि टपकाया होते हैं, विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो दमित है कि सुनिश्चित करता है। कोशिका मृत्यु प्रेरित नहीं करते कि संकेत दे रास्ते की जांच कर रहे हैं तो एक transsilencer वैकल्पिक रूप से 43,44 इस्तेमाल किया जा सकता है, बिना लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के कड़े नियमन के लिए आवश्यकता के आराम और inducible सिस्टम हो सकता है।

संकेतन मार्ग की जांच के लिए इस्तेमाल किया inducible नियामक प्रणाली Tet प्रणाली होने की जरूरत नहीं है। इसका बड़ा फायदा यह अधिकता अब 20 से अधिक वर्षों के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में इस्तेमाल किया गया है कि है और यह है कि सबसे उच्च विकसित की है और सबसे अच्छा CHaracterized inducible नियंत्रण प्रणाली। फिर भी, वैकल्पिक रूप से, या Tet प्रणाली के अलावा में नियोजित किया जा सकता है कि कम से कम 25 अन्य सशर्त विनियामक प्रणालियों 45,46 कर रहे हैं। दो या तीन अलग inducible सिस्टम रास्ते संकेतन अभिसरण जांच में या लक्ष्य जीन या ब्याज की प्रोटीन या तो के अतिरेक के परीक्षण के लिए उपयोगी हो सकता है।

यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया की जांच कर रहा है कि संबंधित संकेतन मार्ग से एक मजबूत और विश्वसनीय उत्पादन में संकेत है कि परिणाम में अभिकर्मक क्षमता के साथ काम करना चाहिए। स्थिर सेल लाइनों एक समरूप तरीके से (चित्रा 4 बी) में ब्याज की प्रोटीन व्यक्त की वजह से, क्षणिक हित के प्रोटीन व्यक्त inducible प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं कि सभी कोशिकाओं मार्ग संकेतन के साथ ब्याज की प्रोटीन के हस्तक्षेप के लिए जांच कर रहे हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428

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References

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संक्रमण अंक 100 apoptosis Bax कस्पासे 3, Doxycycline effector के प्रोटीन inducible अभिव्यक्ति स्थिर सेल लाइन Tet प्रणाली प्रकार चतुर्थ स्राव सिस्टम
एक inducible अभिव्यक्ति प्रणाली लागू करने Intracellular संकेतन के साथ बैक्टीरियल विषैलापन कारक के हस्तक्षेप के अध्ययन करने के लिए
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Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck,… More

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).

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