Abstract
Das hier vorgestellte Verfahren erlaubt es, zu analysieren, zu dem Schritt für ein Zielprotein, oder alternativ ein kleines Molekül, interagiert mit den Komponenten eines Signalwegs. Das Verfahren basiert auf der einen Seite, auf der die induzierbare Expression eines spezifischen Proteins mit einem Signalisierungsereignis zu einem definierten und vorgegebenen Schritt in der gewählten Signalkaskade initiieren. Gleichzeitige Überexpression, andererseits aus dem Gen von Interesse ermöglicht dann der Prüfer zu beurteilen, ob die Aktivität des exprimierten Zielprotein stromaufwärts oder stromabwärts von dem eingeleiteten Signalereignisses, abhängig von der Ablesung der Signalweg, der gewonnen wird. Hier wurde die Apoptosekaskade als definierte Signalweg zum Protokollfunktionalität zu demonstrieren ausgewählt. Pathogene Bakterien, wie Coxiella burnetii, translozieren Effektorproteinen, die mit dem Host-Zelltod-Induktion in der Wirtszelle eingreifen, um Überleben der Bakterien in der Zelle zu gewährleisten und zur Förderung ihrerVerbreitung im Organismus. C. burnetii Effektorprotein CAEB wirksam inhibiert Wirtszelle Tod nach Induktion der Apoptose mit UV-Licht oder mit Staurosporin. Zu verengen, bei der Schritt CAEB stört die Ausbreitung des apoptotischen Signals wurden ausgewählte Proteine mit gut charakterisierte pro-apoptotische Aktivität vorübergehend in einer Doxycyclin-induzierbaren Weise exprimiert. Wenn CAEB wirkt stromauf dieser Proteine wird Apoptose ungehindert ablaufen. Wenn CAEB wirkt stromabwärts wird Zelltod gehemmt werden. Die Testproteine wurden ausgewählt Bax, die auf der Ebene der Mitochondrien und Caspase 3, die die Hauptscharf Protease wirkt. CAEB stört Zelltod durch Bax-Expression induziert, aber nicht von Caspase-3-Expression. CAEB somit in Wechselwirkung mit der apoptotischen Kaskade zwischen diesen beiden Proteinen.
Introduction
Die Virulenz von vielen Gram-negative bakterielle Erreger hängt von spezialisierten Sekretionssysteme zu eukaryotischen Wirtszellen zu entführen. Bakterien nutzen diese Sekretionssysteme bakterieller Virulenzproteine (Effektoren) in die Wirtszelle injiziert werden, um eine Vielzahl von zellulären und biochemischen Aktivitäten modulieren. Das Studium der Effektorproteine nicht nur bemerkenswerten Einblick versehen, in grundlegende Aspekte der Wirt / Pathogen-Interaktionen als auch in die grundlegende Biologie von eukaryotischen Zellen 1. Modulation der Wirtszelle Apoptose wurde gezeigt, dass ein wichtiger Mechanismus für die Virulenz viele intrazelluläre Pathogene zu sein, und eine Anzahl von Effektor-Proteine modulieren Apoptose identifiziert wurden 2-9. , Ihren genauen molekularen Mechanismen der Tätigkeit bleiben jedoch schwer in vielen Fällen.
Apoptose, eine Form des programmierten Zelltods, spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf eine Infektion 10. Zwei Hauptwege, die zu Apoptose habenidentifiziert: zur Förderung der Mitochondrien (intrinsische Apoptose) oder direkte Weiterleitung des Signals über den Zelltod-Rezeptoren an der Plasmamembran (extrinsische Apoptose). Die intrinsische oder Mitochondrien vermittelte Zelltod wird durch intrazelluläre Signale ausgelöst und beinhaltet die Aktivierung von Bax und Bak, zwei proapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Diese Familie wird von pro- und anti-apoptotischen Regulatorproteine, die den Zelltod 11-14 steuern zusammen. Die Aktivierung der Apoptose führt zu Oligomerisierung von Bax und Bak, gefolgt von nachfolgenden Permeabilisierung der mitochondrialen Außenmembran, was zu einer Freisetzung von Cytochrom c in das Zytoplasma. Freisetzung von Cytochrom c initiiert Aktivierung der Effektor-Caspasen 3 und 7 durch die Aktivierung von Caspase-9 in der apoptosome 15. Dies führt zu einer Proteolyse von ausgewählten Substraten, die unter anderem führt die Exposition von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche 16 und befreit einen dedizierten DNase, die CH-Fragmentenromatin 17,18.
Um zu bestimmen, wo innerhalb der Apoptosekaskade eine individuelle Effektorprotein stört, wurde ein induzierbares Expressionssystem 19 eingesetzt wird. Regulierungssysteme für die bedingte Expression von Transgenen wurden ein wertvolles Werkzeug in der Funktion eines Proteins innerhalb der Zelle oder ihrer Bedeutung für Gewebe, Organ und Entwicklung des Organismus, als auch während der Initiation, Progression und Wartung der Krankheit 20-23 analysiert. Typischerweise induzierbare Kontrollsysteme, wie das Tet-System 24 hier verwendet wird, bilden einen künstlichen Transkriptionseinheit (siehe Abbildung 1). Eine Komponente ist eine künstlich konstruierte Transkriptionsfaktor genannt tTA (Tetracyclin-abhängige Transkriptionsaktivator), durch Fusion des bakteriellen Transkriptionsrepressor TetR 25 an einen Säugetier-Protein-Domäne, die die transkriptionale Aktivierung vermittelt oder Schalldämpfer 24,26 gebildet. Die zweite Komponente ist ein HybridPromotor bezeichnet TRE (tetracycline-responsive element), bestehend aus einem eukaryontischen minimalen Promotor, mindestens eine TATA-Box und eine Transkriptionsinitiationsstelle enthält, verbunden mit mehrfachen Wiederholungen der passenden DNA-Bindungsstelle für TetR, tetO 24,25. Die dritte Komponente ist der natürliche Ligand von TetR, Tetracyclin oder eines seiner Derivate, wie Anhydrotetracyclin und Doxycyclin 25. Bei Ligandenzugabe zum Kulturmedium verliert TetR seine Affinität für tetO und distanziert von der TRE. Als Ergebnis wird die Transkription des Zielgens aufgelöst. Transgen-Expression kann somit fest in einer zeit- und dosisabhängigen Art und Weise sowohl in der Zellkultur und in Tier 20,23,24 gesteuert werden. Mit tTA tritt Transgen-Expression konstitutiv, außer in Gegenwart von Tetracyclin. Dies kann ein Nachteil in der Studie von cytotoxischen oder onkogene Proteine sein, weil Tetracyclin zunächst vom System entfernt werden, bevor Transgen expression erfolgt und Wirkungen des Zielproteins auf der Zelle überwacht werden. Dies kann zeitaufwendig sein und ist nicht immer vollständig, insbesondere in transgenen Tieren 27. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein TetR-Mutante mit einer umgekehrten Reaktion auf die Anwesenheit von Doxycyclin verwendet, um einen neuen Transkriptionsfaktor zu erzeugen, rtTA (reverse tTA) 28. Es bindet nur an dem TRE und damit einhergehend die Transkription in Gegenwart von Doxycyclin. Restundichtheit des Systems, dh., Transgen-Expression in Abwesenheit von TRE-gebundenen Transkriptionsfaktor Ursprung entweder (i) von Positionseffekten in einer genomischen Integrationsstelle, (ii) von der TRE selbst 29 oder (iii) aus nicht -spezifische Bindung von tTA / rtTA 28 wurde durch Einführung eines zusätzlichen transkriptionalen Schalldämpfer gerichtet, sogenannte TTS (Tetracyclin-abhängige Transkriptions Schalldämpfer) 30 an das System. Es bildet sich ein Zweiregler Netzwerk zusammen mit rtTA (siehe Abbildung 1).In Abwesenheit von Doxycyclin, bindet TTS TRE und schaltet alle verbleibenden Transkription aktiv. In Gegenwart von Doxycyclin, distanziert tTS von TRE und rtTA bindet gleichzeitig Induktion der Expression des Zielgens. Diese zusätzliche Schicht aus Stringenz ist oft notwendig, hochaktive zytotoxische Proteine 31-34 exprimieren.
Mit diesen streng kontrollierten Doppelregler-System kann die Apoptosekaskade bei einer definierten Schritt kann Analysen, ob die gegebene Effektorprotein mit Apoptose stören initiiert werden. Dieses Verfahren kann nicht nur verwendet werden, um die anti-apoptotische Aktivität von bakteriellen Effektorproteine studieren, sondern auch für die induzierbare Expression von pro-apoptotischen oder toxische Proteine oder zum Präparieren Interferenzen mit anderen Signalwegen.
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Protocol
1. Erzeugung von stabilen Zelllinien, die das Protein von Interesse
- Vorzubereiten Medien durch Zugabe hitzeinaktiviertem FCS und 1% Penicillin / Streptomycin, handelsübliche Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit GlutaMAX-I, Pyruvat und 4,5 g / l D-Glucose.
- Kulti HEK293 Zellen in Medien bei 37 ° C in 5% CO 2. Sub-Zellen zu kultivieren alle drei Tage. Entfernen Sie die Medien und Resuspendieren der Zellen in 15 ml frisches Medium. Pipette 1 ml in eine neue 75 cm 2 Zellkulturflasche und fügen Sie 14 ml Medien.
- Analysieren Sie die Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer.
- Seed HEK293-Zellen in einer 6-Well-Platte in einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung und Inkubation für 24 Stunden.
- Für die Transfektion verwendet das Protokoll vom Hersteller des Transfektionsreagenz zur Verfügung gestellt. Transfektion von Zellen mit pEGFP-C2 oder pEGFP-C2-CAEB Verwendung des Transfektionsreagenz. Vor der Verwendung erwärmen die Transfektion REAGent und die auf RT erforderlichen Medien. Verwenden Sie einen 3: 1-Verhältnis von Transfektionsreagenz an DNA.
- Im einzelnen Pipette 1,5 ul Transfektionsreagenz direkt in 50 ul serumfreiem DMEM Medium. Für die Komplexbildung, Pipette 0,5 ug DNA mit Codierung für GFP oder GFP-CAEB zum Transfektionsreagenz enthaltende Mischung und Inkubation für 15 min bei RT.
- Transfektion von Zellen, die durch Zugabe der Reaktionsmischung in einem tropfenweisen Weise und bei 37 ° C in 5% CO 2 für 24 Std.
- 1 mg / ml für die Selektion von GFP-positive Klone bei 37 ° C in 5% CO 2 Geneticin.
- Nach 6 Tagen isolieren Einzelzellen durch Durchflusszytometrie Sortierung in einer 96-Well-Platte beherbergen Mediums und HEK293 Stand in einem 1: 1-Verhältnis. Erzeugen HEK293 Überstand aus konfluenten kultivierten HEK293 Zellen, die für 15 min bei 4.966 x g zentrifugiert.
- Am folgenden Tag, ersetzen Kulturmedium mit Medium, das 1,50; mg / ml Geneticin. Ändern Medien einmal pro Woche. Wenn die Zellen eine konfluente Monoschicht, übertragen Sie sie auf einer 24-Well-Platte. Unterkulti Zellen zweimal die Woche in einem Verhältnis von 1: 5 in Medien, die 1,5 mg / ml Geneticin. Schließlich analysiert man den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen durch Immunoblot-Analyse und Durchflusszytometrie.
2. Analyse der stabilen Zelllinien durch Immunoblot-Analyse
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal geklebt mit warmem PBS. Die Zellen in 100 ul 2x Laemmli-Probenpuffer, Hitze für 5 min bei 95 ° C und bei -20 ° C.
- Laden etwa 4 x 10 4 Zellen pro Probe auf einem 12% SDS-PAGE-Gel. Zusätzlich Last 6 & mgr; l eines handelsüblichen Protein Leiter als Molekulargewichtsmarker. Gele laufen in einem Gel-Elektrophorese-System unter einer konstanten Spannung von 180 V für 45 bis 60 min mit 1x Laemmli-Laufpuffer.
- Auslöschen Proteine auf PVDF-Membranen (Porengröße von 0.45 & mgr; m) bei einer konstanten Spannung von 16 V für 60 min unter Verwendung einer Trans-Blot SD Semi-Dry Übertragungszelle.
- Block Membranen in 10 ml 5% fettfreier Trockenmilch in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) für 1 h bei RT.
- Verdünnter 4 ul anti-GFP-Antikörper in 4 ml MPT und inkubieren Membranen O / N bei 4 ° C.
- Führen drei 10 min Waschschritten mit 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
- Membranen mit 0,8 & mgr; l Meerrettichperoxidase-konjugierte sekundäre Antikörper inkubieren in 4 ml MPT.
- Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 2.6 beschrieben) und Meerrettich-Peroxidase-Aktivität zu detektieren mit einem kommerziellen Kit nach Vorschrift des Herstellers. Bewerben Standardausrüstung für Filmentwicklung bis Proteinbanden sichtbar zu machen.
3. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.
- Die Zellen in PBS. Verwenden HEK293-Zellen als Negativkontrolle zu sc vorwärts einstellenAtter (FSC) und Seitenstreuung (SSC), so dass die Zellen auf der Skala. Zeichnen Sie ein Tor an lebenden Zellen durch den Ausschluss von Zell Dubletten, Zuschlagstoffe und Zelltrümmer.
- Stellen Sie den Photomultiplier (PMT) Verstärkung, so dass die ungefärbten Zellen sind auf der anderen des Histogramms für die FL1-Kanal (488 nm Argonlaser) links.
- Um die Fluoreszenzintensität von HEK293-GFP und HEK293-GFP-Zellen zu analysieren CAEB öffnen Sie das Histogramm des FL1-Kanal und zu erwerben 10.000 Events auf der gated Bevölkerung.
- Analysieren Sie die Daten mit Hilfe von kommerziellen FACS-Analyse-Software.
4. Transfektion der stabilen Zelllinie mit dem induzierbaren Expressionsvektorsystem
- Samen HEK293-Zellen, die GFP oder GFP-CAEB in einer Platte mit 12 Vertiefungen bei einer Dichte von 1 x 10 5 Zellen / Vertiefung.
- 19 Stunden nach der Aussaat, Co-Transfektion der Zellen mit Plasmid-Regler und Antwort Plasmid entweder kodiert Bax oder aktivierte Caspase-3.
- Co-Transfektion der stabilen HEK293-Zellenmit 100 ng pWHE125-P-Regler Plasmid (Figur 2) und 100 ng der Antwort Plasmide pWHE655-hBax oder pWHE655-revCasp3 (Abbildung 3) und 0,4 & mgr; l Polyethylenimin.
- Bereiten Sie die DNA und Polyethylenimin Transfektionsreagenz jedes in 75 & mgr; l Opti-MEM-Medium und Inkubation für genau 5 min bei RT. Für die Komplexbildung, Inkubation sowohl Mischungen zusammen für 15 min bei RT.
- Füge das Polyethylenimin / DNA-Lösung tropfenweise zu den Zellen und inkubiere bei 37 ° C in 5% CO 2.
5. Induktion der Apoptose
- 5 h nach der Transfektion induziert die Expression der pro-apoptotische Proteine durch Zugabe von 1 & mgr; g / ml Doxycyclin zum Kulturmedium. Inkubieren Zellen 18 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2.
6. Analyse der Wirtszell-Apoptose, die durch Immunblot-Analyse
- Untersuchen Zellen vor der hie Ernte unter dem Lichtmikroskop für Zelltodinduktion überprüfen. Apoptotische Zellen nachweisbaren durch die Anwesenheit von apoptotischen Körpern um die sterbende Zelle.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal geklebt mit warmem PBS. Die Zellen in 100 ul 2x Laemmli-Probenpuffer, Hitze für 5 min bei 95 ° C und bei -20 ° C.
- Laden etwa 4 x 10 4 Zellen pro Probe auf einem 12% SDS-PAGE-Gel. Zusätzlich Last 6 & mgr; l eines handelsüblichen Protein Leiter als Molekulargewichtsmarker. Gele laufen in einem Gel-Elektrophorese-System unter einer konstanten Spannung von 180 V für 45 bis 60 min mit 1x Laemmli-Laufpuffer.
- Blot Proteine auf PVDF-Membranen (Porengröße 0,45 um) bei einer konstanten Spannung von 16 V für 60 min unter Verwendung einer Trans-Blot SD Semi-Dry Übertragungszelle.
- Block Membranen in 10 ml 5% fettfreier Trockenmilch in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) für 1 h bei RT.
- Verdünnter 4 μl anti-gespaltenen Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) Antikörper, der in 4 ml MPT und inkubieren O / N bei 4 ° C.
- Führen drei 10 min Waschschritten mit 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
- Inkubieren Membranen mit 0,8 ul Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper in 4 ml MPT verdünnt.
- Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben), und erfassen Meerrettichperoxidase Aktivität mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll. Bewerben Standardausrüstung für Filmentwicklung bis Proteinbanden sichtbar zu machen.
- Entfernen gebundenen Antikörper durch 30 min Inkubation bei RT mit 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
- Nach drei Waschungen mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben), zu sondieren, die Membranen mit 4 & mgr; l anti-Aktin-Antikörper in 4 ml MPT O / N bei 4 ° C.
- Nach drei Waschschritten mit MPT (wie in 6.7 beschrieben), Inkubation der Membranen mit 0,8 ul horseradish Peroxidase-konjugierte sekundäre Antikörper in 4 ml MPT verdünnt.
- Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben, und detektieren Meerrettichperoxidase Aktivität mit einem kommerziellen Kit nach Vorschrift des Herstellers. Wenden Standard-Ausrüstung für die Filmentwicklung, um die Proteinbanden sichtbar zu machen.
Anmerkung: Alle Inkubationsschritte wurden auf einem Plattenschüttler für die angegebene Zeit und Temperatur durchgeführt.
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Representative Results
Zunächst wurden HEK293-Zelllinien, stabil das Protein von Interesse (CAEB) Exprimieren als GFP-Fusionsprotein hergestellt. Als Kontrolle wurden HEK293-Zelllinien, die stabil GFP generiert. Expression von GFP und GFP-CAEB wurde durch Immunoblot-Analyse verifiziert. Der Vertreter Immunoblot (4A) zeigt stabile und klar nachweisbare Expression von GFP und GFP-CAEB. Jedoch kann dieser Assay nicht bestimmen, ob alle Zellen exprimieren GFP oder GFP-CAEB. Daher wurden die stabil transfizierten HEK293-Zelllinien auch durch Durchflusszytometrie analysiert. Wie in 4B gezeigt ist, mehr als 90% der Zellen in beiden Zelllinien exprimiert GFP. Somit können diese stabile Zelllinien verwendet werden, um eine weitere Analyse der Funktion CAEB werden. Im nächsten Schritt wurde die anti-apoptotische Aktivität von CAEB durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen gespalten PARP untersucht. Proteolytische Spaltung von Kern PARP inaktiviert DNA-Reparatur-Aktivität und ist eine typische Marker des terminal Stadien der Apoptose. Spaltung von PARP ist in HEK293-GFP oder HEK293-GFP-CAEB Zellen nachgewiesen, was zeigt, daß weder die Expression von GFP, noch von GFP-CAEB ist toxisch für die Zellen. Wenn jedoch die Zellen mit Staurosporin behandelt ein potenter Induktor von intrinsischen Apoptose Spaltung von PARP wurde nachgewiesen (5). Wichtig ist, dass HEK293-GFP-CAEB Zellen eine verringerte Spaltung von PARP, was die anti-apoptotische Aktivität des Coxiella burnetii Typ IV-Sekretionssystem Effektorprotein CAEB 7.
Um zu analysieren, zu dem Schritt CAEB stört den apoptotischen Weg wurde das Tet-On-System eingesetzt. Im Einzelnen wurden HEK293-GFP oder HEK293-GFP-CAEB Zellen mit einem Regler Plasmid konstitutiv eine Doxycyclin gesteuerten Dual-Repressor / Aktivator-Setup (Abbildung 2) und eine pTRE Antwort Plasmid, das entweder in voller Länge Menschen Bax oder die aktivierte Form des transfizierten menschlichen Caspase 3, bezeichnet revCasp 3 (Abbildung 3). Dieses System ist streng reguliert, wie durch das Fehlen von PARP-Spaltung unter nicht-induzierenden Bedingungen (Figur 6) gezeigt. Zugabe von Doxycyclin zu den transfizierten Zellen resultierte in der Expression von Bax oder revCasp 3. Wenn CAEB stört den apoptotischen Weg stromabwärts von Bax, dann wird die durch die Expression und nachfolgende Aktivierung von Bax erzeugt apoptotischen Signals sollte durch CAEB Expression blockiert werden. In der Tat, HEK293 Zellen, die stabil, die GFP-CAEB zutiefst Apoptose hemmen durch Doxycyclin gesteuerten Bax Ausdruck, während HEK293-GFP-Zellen angezeigt offensichtlich PARP-Spaltung. Dieses Ergebnis zeigt, dass CAEB Blöcke Apoptose stromabwärts von Bax-Aktivierung. Als nächstes wurde untersucht, ob CAEB mit Caspase-3-Aktivierung stören - ein spätes Ereignis in der apoptotischen Weg. HEK293-GFP-Zellen, sowie HEK293-GFP-CAEB Zellen weisen PARP-Spaltung (Figur 6), was anzeigt, dass, sobald die Effektorcaspase 3 ist aktivATED, CAEB kann nicht verhindern, dass das Auftreten von Apoptose. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass CAEB wirkt zwischen Bax und Caspase-3-Aktivierung.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Tetracyclin-Regulierungssystem. Die Tet-On-System besteht aus zwei verschiedenen Plasmiden, die regulatorischen und Antwort Plasmide bestehen. Die regulatorischen Plasmid kodiert das Tet-responsive transsilencer (TTS; gefüllter Kreis) und der Tet-responsive Rückwärts Transaktivator (rtTA, offener Kreis). Beide Proteine werden konstitutiv unter der Kontrolle des starken, konstitutiven Elongationsfaktor-1-alpha-Promotor (P EF-1a) ausgedrückt. TTS und rtTA chimäre Transkriptionsfaktoren, die aus einer eukaryotischen Transkriptionsregulationsdomäne (Schalldämpfer oder Aktivator, respectively) und ein bakterieller Tetracyclin-Repressor (TetR). TetR vermittelt DNA-Bindung an sieben tet (tetO) -Sequenzen über die Antwort-Plasmid. TetO stromauf des induzierbaren minimalen Cytomegalovirus-Promotor (P CMV) befindet, welche zusammen das Tet-responsiven Element (TRE). Unter nicht-induzierenden Bedingungen, ist TTS TRE gebunden Ausdruck zu verhindern. Nach Zugabe von Doxycyclin (Dox; gefüllt Diamant), interagiert rtTA mit Dox zu Konformationsänderungen und Aktivierung führt. Aktiviert rtTA ersetzt tTS auf die Reaktion Plasmid, so dass die Transkription des entsprechenden Zielgene Bax und Caspase 3, was zu Apoptose und Zelltod führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der regulatorischen Plasmid pWHE125. Elements wesentlich zur Vermehrung in bacrien, einschließlich eines Replikationsursprungs (ori pBR) und ein Antibiotikum-Resistenz-Kassette gegen Ampicillin (Amp R) und zur Expression des tet-transregulators, wie die starke, konstitutive immediate early Promotor / Enhancer des humanen Cytomegalovirus (P / E hCMV), eine interne Ribosomen-Bindungsstelle von Poliovirus (PV-IRES) und ein polyA-site von Simian Virus 40 (SV40 polyA) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 Schematische Darstellung des Antwort Plasmid. Elemente, die für Vermehrung in Bakterien, einschließlich eines Replikationsursprungs (ori pBR) und ein Antibiotikum-Resistenz-Kassette (Amp R) und für die induzierbare Expression in Eukaryonten, wie beispielsweise die Trans expressiauf der Kassette mit dem Tet-abhängige Minimal-Promotor TREtight (P TREtight), dem Gen von Interesse menschlichen Bax (hBax) und ein polyA-Stelle von Simian Virus 40 (SV40-polyA), dargestellt. Die Transgen-Expressionskassette wird durch Tandem direkte Wiederholungen von zwei Kopien des Huhns HS4 Isolatorkernsequenz (HS4 Kern) flankiert. Zusätzlich ist eine G418-Resistenz-Kassette, bestehend aus einem Maus-Phosphoglyceratkinase-1-Promotor (P mPGK), ein Neomycin-Resistenzgen (G418 R) und eine menschliche Thymidin-Kinase-polyA-Stelle (TK polyA) vorhanden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.
Abbildung 4. HEK293-GFP und HEK293-GFP-CAEB stabil grün fluoreszierende Proteine zu exprimieren. (A) Whole-Zelllysaten von HEK293-GFP undHEK293-GFP-CAEB Zellen wurden GFP immungeblottet auf stabile Expression zeigen. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie (FACS) Analyse der HEK293-GFP und HEK293-GFP-CAEB Zellen wird gezeigt, dass die Intensität der GFP-Expression zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 5. Auswirkungen der Expression des GFP-CAEB auf Staurosporin-induzierter Apoptose. HEK293-GFP und HEK293-GFP-CAEB Zellen wurden mit 4 & mgr; M Staurosporin für 6 Stunden behandelt, um intrinsische Apoptose induzieren. Apoptose wurde durch gespalten PARP Immunoblot-Analyse analysiert. PARP-Spaltung wurde in HEK293-GFP-CAEB Zellen im Vergleich zu HEK293-GFP-Zellen reduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehenvon dieser Figur.
Abbildung 6. Verbrauch von der Teton-System, um gezieltere den Angriffspunkt der CAEB. (A) Die Apoptose wurde durch die Expression von Bax in HEK293-GFP und HEK293-GFP-CAEB Zellen induziert. Apoptose wurde durch gespalten PARP Immunoblot-Analyse analysiert. PARP-Spaltung wurde in HEK293-GFP-CAEB Zellen im Vergleich zu HEK293-GFP-Zellen reduziert. (B) Die Apoptose wurde durch Expression revCasp 3 in HEK293-GFP und HEK293-GFP-CAEB Zellen induziert. Apoptose wurde durch gespalten PARP Immunoblot-Analyse analysiert. PARP-Spaltung wurde in HEK293-GFP-CAEB und HEK293-GFP-Zellen vergleichbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Viele pathogene Bakterien beherbergen Sekretionssysteme zur Sekretion oder translozieren bakteriellen Effektorproteine in die Wirtszelle. Diese Effektor-Proteine haben die Fähigkeit, Prozesse und Pfade in der Wirtszelle zu modulieren, so dass die Bakterien zu überleben und zu replizieren, innerhalb ihrer jeweiligen intrazelluläre Nische. Das Verständnis der biochemischen Aktivitäten und die molekularen Mechanismen der Effektor-Proteine werden zu einem besseren Verständnis der Pathogenität zu helfen und kann dazu beitragen, neue therapeutische Instrumente zur Bekämpfung der Krankheit zu entwickeln. Da ferner die Effektorproteine häufig üben ihre Funktion durch die Nachahmung Wirtszellaktivitäten, können sie auch verwendet werden, um mehr über die Biologie von eukaryotischen Zellen 1 erfahren werden. Jedoch die Untersuchung der biochemischen Aktivität eines einzelnen Effektorprotein hat sich aus mehreren Gründen schwierig sein: 1) funktionelle Redundanz unter Effektorproteinen, 2) die zeitliche Regulierung des Eingriffs der Effektor-Proteine, und 3) die effector-Protein, die in Zusammenhang mit einem anderen Effektor-Protein, stören die Funktion. Daher wird die Aktivität eines Effektorprotein üblicherweise von Expressionsstudien untersucht. Unglücklicherweise hat die Verwendung von transienten Überexpression des Effektorprotein auch mehrere Nachteile. Somit können nur Einzelzellanalyse Assays eingesetzt werden und die Aktivität der Protein-Effektor nicht analysiert werden kann, wenn die Aktivität des Effektors Proteins hängt von der Aktivität von anderen Effektor-Protein. Um zumindest den ersten Nachteil zu überwinden, kann eine stabile Zelllinien verwendet werden. Falls die Expression des Effektor-Protein ist für die Zelle toxisch ist dies nicht geeignet. In diesem Szenario kann eine stabile und induzierbare Zelllinien unter Verwendung eines ähnlichen Systems festgelegt werden, wie wir hier beschreiben für die transiente Expression des Apoptose-induzierenden Proteine (siehe unten). Jedoch zeigen unsere Ergebnisse (Figur 5) zeigen, dass die Expression von CAEB schützt die Zellen vor einer Apoptose unterliegen und daher nichttoxisch. Es gibt ein paar Optionen in Sezieren in welchem Schritt innerhalb der Apoptosekaskade CAEB stört Apoptoseinduktion. Eine Möglichkeit ist es, die Wirtszelle Bindungspartner CAEB bestimmen. Dies ist jedoch sehr schwierig und die Identifizierung der Bindungspartner kann nicht dazu beitragen, die Wirkungspunkt CAEB innerhalb der Apoptosekaskade erklären. Eine andere Möglichkeit besteht darin, verschiedene Apoptose Induktoren zu verwenden, aber CAEB hemmt die Apoptose-Induktion durch zwei verschiedene Apoptose induzieren, UV-Licht und Staurosporin 7, was darauf hinweist, dass dieser Ansatz möglicherweise auch nicht auf die Identifikation der Wirkungspunkt CAEB führen. Eine andere Möglichkeit besteht in Eingrenzung der Angriffspunkt der CAEB, die hier ausgenutzt wurde, ist es, ein System, wo die Apoptose-Signalkaskade kann in definierten Schritten induziert werden zu verwenden.
Bei Expression des bakteriellen Effektor-Protein, das ausgewählt wurde als Protein von Interesse bereits stört die Zellphysiologie, seine expreSpaltung kann auch unter der Kontrolle eines induzierbaren Expressionssystems, beispielsweise wie die verwendet werden, um das Zielprotein zu exprimieren platziert werden. Dann wird die Expression von sowohl Protein von Interesse und Zielprotein gleichzeitig induziert werden, wenn der Ligand an die Zellkultur so dass der Prüfer, um die Zellen für unterschiedliche Auswirkungen auf die Zellphysiologie zu überwachen und Signalsystems ausgegeben.
Es ist klar, das ein Protein von Interesse exprimieren, und versucht, seine Wirkstelle in einer bestimmten intrazellulären Signalweg durch induzierbare Expression ausgewählter Weg Proteine zu identifizieren besten funktioniert, wenn das Protein von Interesse beeinträchtigt die physiologische Aktivität des gewählten Weges. In diesem Fall ist Auslese einfach das Fehlen eines Signals, die normalerweise mit dem Signalweg verbunden sind, wie Zelltod bei der apoptotischen Signalisierung oder Aktivierung der Transkription im Fall von Wnt-Signalisierung. Prinzipiell können Proteine, die eine spezifische Signalweg aktiviert auch mit diesem T sondiertyp des Assay-Systems. Es hat nur bis anders gesetzt werden zum Beispiel unter Verwendung induzierbare Expression eines si / sh / miRNA gegen einen Weg Protein und testet, ob das Protein von Interesse kann Signalwegs zu retten. Alternativ können niedermolekulare Inhibitoren spezifischer Proteine verwendet werden, um die Signaltransduktion in einem Weg zu unterbrechen und dann für Rettungsweges überprüfen Durch induzierbare Expression eines Proteins von Interesse. Jedoch wird diese Art von Ansatz experimentell schwieriger als der oben vorgestellten Protokoll sein.
Die Auswahl des Zielgens in der Interferenz-Assay untersucht werden, im Prinzip einfach. Am besten ist es, um zu testen, da viele der Proteine, die in den gewählten Signalweg wie möglich, eine Feinabstimmung der Identifizierung des Proteins von Interesse Stelle der Wechselwirkung mit dem Signalweg. Dies sollte in einer iterativen Art und Weise erfolgen, da es nicht immer experimentell führbar oder möglich, die gesamte potentielle Wechselwirkungen zu überwachention Partner in einem einzigen Experiment. Daher ist es am besten, zuerst zu testen mehrere Proteine gleichmäßig entlang des gesamten Weges angeordnet sind und dann, um das Experiment unter Verwendung der Informationen in der ersten Runde gewonnen zu verfeinern. Signalwegen sind viele Proteine posttranslational modifiziert, entweder durch eine kovalente Modifikation, wie Phosphorylierung oder sumoylation oder durch eine Verarbeitungs Ereignis, wie eine proteolytische Spaltung. Folglich ist das entsprechende Protein entweder in einem Grundzustand oder in einer aktivierten Form. Wenn möglich, ist es am besten, um beide Formen des Proteins aus zwei Gründen zu testen. Einer ist, dass die aktivierte Form liefert eine höhere Ausgangssignal 31, das eine strengere Herausforderung für das Protein von Interesse zeigt. In unserem proof-of-principle Beispiel apoptotischer Signal wird der Caspase 3, die durch proteolytische Spaltung und Dimerisierung aktiviert. Diese Aktivierung Ereignis kann künstlich durch Neuanordnung der nicht verarbeiteten pro-Caspase-Gen simuliert werden. Die kleine Untereinheit künstlich gelegtvor der großen Untereinheit, und beide sind durch einen Linker verbunden sind. Dies ist ein "Umkehr Caspase" bezeichnet und stellt die aktivierte Form des Enzyms, wenn es exprimiert wird 35. Es wurde aufgrund seiner höheren Aktivitätsgrad ausgewählt. Der zweite Grund für das Sondieren sowohl im Grundzustand und aktivierten Formen eines Weges Protein ist, weil es erlaubt, zu unterscheiden, ob das Protein von Interesse stört die Aktivierung des Zielproteins, oder wenn es stromabwärts von dem Protein in der Bahn wirkt. Im ersten Fall wird Zelltod gehemmt sein, wenn der Grundzustandsform ausgedrückt wird, aber nicht, wenn die aktivierte Form vorliegt. Im zweiten Fall wird weder Protein Apoptose führen. Somit testet beide Formen eines modifizierten Proteins verbessert die Auflösung des analytischen Systems.
Klonen des Zielgens in dem induzierbaren Expressionsvektor erfordert mehrere Entscheidungen. Zuerst wird die Expression des Zielgens nur vorübergehend auftreten, oder ist es besser, wenn der Vektor sbringend in das Genom der Wirtszelllinie integriert? Wenn nur vorübergehende Expression erforderlich ist, eine einfache Vektor wie pUHC13-3 24, die einen Tet-abhängigen Promotor und ein polyA-Stelle oder eine bidirektionale Vektor wie pBi-2 oder pBi-3 36, die Paare der Expression des Gens enthält von Interesse für die Expression eines Reportergens für eine einfachere Kontrolle der Expression des Zielgens, ausreichend sein. Wenn stabile Expression bevorzugt wird, sollte ein Vektor wie pWHE655 33 (Figur 3) verwendet werden. Es enthält Isolatoren, die das Transgen-Expressionseinheit in die Position Auswirkungen auf genomischer Integrationsstelle stören induzierbare Expression des Transgens zu verhindern flankieren. Es enthält auch eine verbunden, aber unabhängig exprimiert Resistenzkassette zur G418, um die Auswahl von Vektorintegrationsereignisse erleichtern. Das Nettoergebnis dieser Modifikationen ist eine Erhöhung der Anzahl von Klonen, die mit ausgezeichneten regulatorische Eigenschaften 33,37,38. cDNA seFolgen von Zielgenen durch Verwendung der einzigartigen Restriktionsstellen für EcoRI und EcoRV 33 in diesen Vektor kloniert werden. Klonierung des Vektors exprimiert die Rückwärts Caspase-3-cDNA wurde im Detail unter Bezugnahme 33. Klonierung des Vektors, die humanes Bax wurde analog durchgeführt, beschrieben. Der menschliche Bax cDNA wurde durch PCR aus dem Plasmid pVenus-Bax 39 amplifiziert unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die Restriktionsstellen für EcoRI und EcoRV einzuführen. Nach Reinigung des PCR-Fragments und Restriktion mit den beiden Enzymen wurde das Fragment mit ebenfalls beschränkten pWHE655 ligiert, wodurch man pWHE655TREtight-Bax. Sekunde, die Minimalpromotor für transgene Expression am besten geeignet ist? Die ursprüngliche Minimalpromotor P hCMV * -1 24 zeigt einige Zelltyp-spezifische leakiness 30, teilweise aufgrund des Vorhandenseins von funktionellen Interferon α induzierbaren Antwortelemente 29. Dies führte zur Entwicklung der zweiten Generation Tet abhängigenPromotoren, genannt ΔMtetO, TREtight und SG-TRE mit veränderten Abstand und Sequenzen zwischen den tetO-Elemente und mit unterschiedlichen minimalen Promotorsequenzen 33,40-42. Sie zeigen deutlich in Abwesenheit von Doxycyclin verringert Undichtigkeiten. Unter den Promotoren zweiten Generation, hat die niedrigste ΔMtetO Transgen-Expressionsniveau in Gegenwart von Doxycyclin 33. TREtight vermittelt einen Zwischen und SG-TRE das höchste Niveau der Expression des Transgens 33. Weitere Modifikationen sind Hintergrund Ausdruck der Tetracyclin ansprechenden Promotor noch 43,44 minimiert. Somit kann die Wahl eines Tetracyclin ansprechenden Promotor gemß den Anforderungen oder Beschränkungen der jeweiligen Transgen hergestellt werden.
Unabhängig von der Art der Versuchsansatz, wird die Dichtigkeit der Expression des Zielproteins wichtig. B. Induktion der Apoptose mit aktivierten Formen von pro-apoptotischen Proteinen führt zu ZellTod, selbst wenn nur geringe Mengen des jeweiligen Zielprotein exprimiert 31-33. Die erforderliche Stringenz ist von der Zugabe eines Tetracyclin-abhängige transsilencer dem bedingten Regelungssystem 30 erreicht. Es wird sichergestellt, dass die Transkription vom induzierbaren Promotor aktiv unterdrückt, was besonders wichtig ist, wenn transiente Transfektionen werden durchgeführt, da sie in der Regel in ihrer Transgenexpression statt 30 undicht. Wenn Signalwege, die den Zelltod induzieren, untersucht werden, kann die Forderung nach strenger Regulierung der Expression des Zielgens entspannt und induzierbare Systeme ohne einen transsilencer alternativ 43,44 verwendet werden.
Die induzierbare Regulationssystem verwendet, um den Signalweg der Sonde muß nicht das Tet-System sein. Der große Vorteil ist, dass es wurde intensiv in Säugetierzellen von mehr als 20 Jahren ab und, dass es die am weitesten entwickelten und am besten characterized induzierbaren Kontrollsystem. Dennoch gibt es mindestens 25 weitere bedingte Regulierungssysteme 45,46, die alternativ oder zusätzlich zu dem Tet-System verwendet werden könnten. Zwei oder drei unterschiedliche induzierbare Systeme könnte nützlich bei der Sondierung konvergierenden Signalwegen oder zum Testen Redundanz entweder des Ziel-Gens oder des Proteins von Interesse.
Das hier vorgestellte Verfahren sollte mit Transfektionseffizienzen, die in einem robusten und zuverlässigen Ausgangssignal des jeweiligen Signalweg, sondiert wird führen zu arbeiten. Da die stabilen Zelllinien exprimieren das Protein von Interesse in einer homogenen Art und Weise (Figur 4B), werden alle Zellen, die transient mit dem induzierbaren Plasmid das Protein von Interesse transfiziert sind für Interferenzen des Proteins von Interesse mit Signalisierungspfad sondiert.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
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