Abstract
ここに提示された技術は、いずれかの標的タンパク質、あるいは小分子ステップれる分析することができ、シグナル伝達経路の構成要素と相互作用します。この方法は、選択されたシグナル伝達カスケードで定義され、所定のステップでシグナル伝達事象を開始するために、一方では、特定のタンパク質の誘導性発現に基づいています。一方、目的の遺伝子の同時発現は、その後発現される標的タンパク質の活性が上流または開始シグナル伝達事象の下流で、得られたシグナル伝達経路の読み出しに依存する場合、治験責任医師が評価することができます。ここでは、アポトーシスカスケードは、プロトコル機能性を実証するために定義されたシグナル伝達経路として選択しました。例えば、 コクシエラバーネッティなどの病原性細菌は、細胞内の細菌の生存を確保するために、それらのを促進するために宿主細胞において、宿主細胞死の誘導を妨害するエフェクタータンパク質を転生物における普及。 C.バーネッティエフェクタータンパク質CaeBを効果UV光を伴うまたはスタウロスポリンでのアポトーシスの誘導後に宿主細胞の死を阻害します。 CaeBはアポトーシスシグナルの伝達を妨害するステップで絞り込むには、十分に特徴付けられたプロアポトーシス活性を有する選択されたタンパク質は、ドキシサイクリン誘導性の方法で一時的に発現させました。 CaeBはこれらのタンパク質の上流に作用する場合、アポトーシスが妨害されずに続行されます。 CaeB下流に作用する場合、細胞死が阻害されます。選択した試験タンパク質は、主要な執行プロテアーゼであるミトコンドリアのレベルで作用バックス、およびカスパーゼ3でした。 CaeBはBax発現により誘導される細胞死を妨害ではなく、カスパーゼ3発現による。 CaeBは、したがって、これら2つのタンパク質間のアポトーシスカスケードと相互作用します。
Introduction
多くのグラム陰性細菌病原体の毒性は、真核生物宿主細胞をハイジャックするための特殊な分泌系に依存します。細菌は細胞および生化学のさまざまな活動を調節するために宿主細胞への細菌の病原性タンパク質（エフェクター）を注入するために、これらの分泌系を使用しています。エフェクタータンパク質の研究では、ホスト/病原体相互作用の基本的な側面にも真核細胞1の基本的な生物学に顕著な洞察を提供しているだけではなく。宿主細胞のアポトーシスの調節は、多くの細胞内病原体のための重要な病原性機構であることが示されており、アポトーシスを調節するエフェクタータンパク質の数は2-9同定されています。しかし、活性のそれらの正確な分子機構は、多くの場合、とらえどころのないままです。
アポトーシス、プログラム細胞死の形態は、感染10に対する免疫応答に重要な役割を果たしています。アポトーシスに導く二つの主要な経路は、持っています特定されて：原形質膜（外因性アポトーシス）で細胞死受容体を介したミトコンドリア（内因性アポトーシス）または信号の直接伝達を標的とします。真性またはミトコンドリア媒介性の細胞死経路は、細胞内シグナルによってトリガーされ、BaxおよびBakの、のBcl-2ファミリーの2プロアポトーシスメンバーの活性化が関与しているされています。このファミリーは、細胞死を制御11-14プロおよび抗アポトーシス調節タンパク質で構成されています。アポトーシスの活性化はBaxおよびBakののオリゴマー化につながる細胞質へのシトクロムCの放出をもたらす、ミトコンドリア外膜のその後の透過処理が続きます。シトクロムcの放出は、アポトソーム15におけるカスパーゼ9の活性化を介してエフェクターカスパーゼ3および7の活性化を開始します。これは、とりわけ、細胞表面16上のホスファチジルセリンの暴露をもたらす、選択された基質のタンパク質分解をもたらし、CHをフラグメント専用のDNアーゼを解放します17,18 romatin。
アポトーシスカスケード内の個々のエフェクタータンパク質が干渉を決定するために、誘導可能な発現系は19を使用しました。導入遺伝子の条件式のための規制システムは、細胞内のタンパク質の機能や組織、器官および生物開発のための重要性だけでなく、開始、進行および疾患20-23のメンテナンス時の解析に貴重なツールとなっています。典型的には、このようなここで使用のTetシステム24と誘導制御システムは、（ 図1参照）人工的な転写単位を形成します。一方の成分は、転写活性化または24,26のサイレンシングを媒介する哺乳動物タンパク質ドメインに細菌転写抑制のTetR 25の融合によって形成されたtTA（テトラサイクリン依存性転写活性化因子）と呼ばれる人工的に操作した転写因子を、あります。第二成分は、ハイブリッドでありますプロモーター、真核生物の最小プロモーターからなる、TRE（テトラサイクリン応答性エレメント）と呼ばれる、少なくともTATAボックスおよび転写開始部位を含む、のTetR、 のtetO 24,25用の同族のDNA結合部位の複数の反復に接合。第三成分がのTetR、テトラサイクリンまたはそのようなアンヒドロやドキシサイクリン25その誘導体、の1の天然リガンドです。培地へのリガンドを添加すると、のTetRはのtetOに対するその親和性を失い、TREから解離します。その結果、標的遺伝子の転写が廃止されています。導入遺伝子の発現は、このように、しっかりと両方の細胞培養および動物20,23,24における時間および用量依存的に制御することができます。 tTAをして、導入遺伝子の発現は、テトラサイクリンの存在を除いて、構成的に発生します。テトラサイクリンは、最初の導入遺伝子の前に、システムから除去されなければならないので、これは細胞毒性または発癌性タンパク質の研究で不利であることができるexpressionが起こると、細胞上の標的タンパク質の効果をモニターすることができます。これは時間がかかり、特にトランスジェニック動物において、常に27完了していないことができます。この制限に対処するために、ドキシサイクリンの存在に逆応答とのTetR変異体は、新しい転写因子を生成するために使用された、rtTAの28（tTAをリバース）。それはTREに結合し、同時に、ドキシサイクリンの存在下で転写を活性化するのみ。残留システムの漏れやすさ、 すなわち 、TRE結合転写因子の非存在下での導入遺伝子の発現は、ゲノム組み込み部位での位置効果から（I）のいずれかを発信し、（ii）のTRE自身29、または（iii）からの非から固有のtTA / rtTAの28の結合、追加の転写サイレンサーを導入することによって対処された、システムに（テトラサイクリン依存性転写サイレンサー）30のtTSと呼ばれます。これは、rtTAの（ 図1参照）と一緒に二重の調節ネットワークを形成します。ドキシサイクリンの非存在下では、TTSはTREに結合し、積極的に残りの転写をシャットダウンします。ドキシサイクリンの存在下では、TTSはTREから解離したrtTAを同時に標的遺伝子の発現を誘導結合します。ストリンジェンシーのこの追加の層は、高活性の細胞毒性タンパク質31〜34を発現することがしばしば必要です。
この厳密に制御デュアルレギュレータ方式を使用して、アポトーシスカスケードは、与えられたエフェクタータンパク質は、アポトーシス誘導を妨害することができるかどうかの分析を可能にする定義された段階で開始することができます。この方法は、細菌のエフェクタータンパク質の抗アポトーシス活性を研究するために使用されるだけでなく、プロアポトーシスまたは毒性タンパク質の誘導性発現のために、または他のシグナル伝達経路との干渉を解剖するためのすることはできません。
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Protocol
目的のタンパク質を発現する安定な細胞株の1世代
- 熱不活性化FCSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することによって、メディアの準備は、市販のダルベッコのグルタマックスI、ピルビン酸、および4.5グラム/ LのD-グルコースを補充したイーグル培地（DMEM）を改変します。
- 5％CO 2中、37℃で培地中でHEK293細胞を育成。二日おきに細胞をサブ養います。メディアを取り出し、そして15mlの新鮮な培地で細胞を懸濁します。新しい75cm 2の細胞培養フラスコにピペット1ミリリットルと14ミリリットルのメディアを追加します。
- 血球計数器を用いて細胞数を分析します。
- ウェルあたり2×10 5細胞の密度で6ウェルプレート中のHEK293細胞をシードし、24時間インキュベートします。
- トランスフェクションのためにトランスフェクション試薬の製造業者によって提供されるプロトコルを使用しています。トランスフェクション試薬を使用したpEGFP-C2かのpEGFP-C2-CaeBで細胞をトランスフェクトします。使用前に、トランスフェクションREAGを温めますENTとRTに必要なメディア。 DNAにトランスフェクション試薬の1の比率：3を使用してください。
- 具体的には、ピペットトランスフェクション試薬1.5μlの直接無血清DMEM培地50μlの中へ。複合体形成のために、トランスフェクション試薬を含有する混合物にDNAをコードするGFPまたはGFP-CaeB0.5μgのピペットを、室温で15分間インキュベートします。
- 滴下様式で、反応混合物を添加することにより細胞をトランスフェクトし、24時間、5％CO 2中、37℃でインキュベートします。
- 1 mgの追加/ 5％CO 2中37℃でGFP陽性クローンの選択のためのゲネチシンミリリットル。
- 1比：6日後、1媒体及びHEK293上清を保有する96ウェルプレートでのソート、フローサイトメトリーにより単一細胞を単離します。 4966×gで15分間遠心分離し、培養し、コンフルエントHEK293細胞からのHEK293上清を生成します。
- 次の日に、1.5を含む培地で培地を交換し0; mg / mlのジェネティシン。週に一度メディアを変更します。細胞がコンフルエントな単層を形成する場合は、24ウェルプレートに移します。 1.5 mg / mlのジェネティシンを含む培地中で5：1の割合で週二回の細胞をサブ養います。最後に、免疫ブロット分析によってGFP陽性細胞の割合を分析し、フローサイトメトリー。
イムノブロット分析により安定な細胞株の2分析
- 上清を除去し、温かいPBSで一度付着した細胞を洗浄します。 2×Laemmliサンプルバッファー、95℃で5分間加熱し、-20℃で保存100μlの細胞を再懸濁します。
- 負荷12％SDS-PAGEゲル上でサンプル当たり約4×10 4細胞。また、分子量マーカーとして市販のタンパク質ラダーの負荷6μL。 1×レムリランニング緩衝液で45〜60分間、180 Vの定電圧下でのゲル電気泳動システムでゲルを実行します。
- PVDF膜上にブロットタンパク質（0の細孔サイズ。トランスブロットSDセミドライトランスファーセルを用いて60分間、16 Vの定電圧で45ミクロン）。
- 室温で1時間、PBS / 0.05％のTween 20（MPT）中の5％脱脂粉乳の10ミリリットルのブロック膜。
- MPTの4mlに抗GFP抗体の4μLを希釈し、4℃で膜をO / Nインキュベート。
- 10mlのPBS / 0.05％Tween 20で3 10分間の洗浄工程を実行します。
- MPTの4ミリリットル中に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を0.8μlの膜をインキュベートします。
- RTで1時間インキュベートした後、PBS / 0.05％Tween20で膜を3回洗浄する（2.6参照）と製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出します。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。
3.フローサイトメーターを用いて細胞を分析します。
- PBSで細胞を再懸濁します。フォワード皮下調整する陰性対照としてHEK293細胞を使用してatter（FSC）および側方散乱（SSC）は、細胞スケールであることになります。細胞ダブレット、凝集体および細胞破片を除くことにより、生細胞にゲートを描きます。
- 未染色細胞がはるかにFL1チャネル（488 nmのアルゴンレーザー）のヒストグラムの左側にあるように、光電子増倍管（PMT）のゲインを調整します。
- HEK293-GFP及びHEK293-GFP-CaeB細胞の蛍光強度を分析するためにFL1チャネルのヒストグラムを開き、ゲーテッド集団に10,000事象を獲得します。
- 商業FACS分析ソフトウェアを用いてデータを分析します。
誘導性の発現ベクター系で安定細胞株の4トランスフェクション
- シードHEK293細胞を安定/ウェルの1×10 5細胞の密度で12ウェルプレート中でGFPまたはGFP-CaeBを発現します。
- 19時間後播種、レギュレータプラスミドと応答プラスミドエンコードのBaxまたは活性化カスパーゼ3のいずれかで細胞を同時トランスフェクト。
- 安定したHEK293細胞を共トランスフェクトpWHE125-Pレギュレータプラスミド（ 図2）と応答プラスミドpWHE655-hBaxまたはpWHE655-revCasp3（ 図3）とポリエチレンイミンの0.4μlと100 ngの100 ngのと。
- のOpti-MEM培地の75μlのDNAおよびポリエチレンイミントランスフェクション試薬をそれぞれ調製し、室温で正確に5分間インキュベートします。複合体形成のために、室温で15分間、両方の混合物を一緒にインキュベートします。
- ポリエチレンイミン/ DNA溶液を滴下細胞を追加し、5％CO 2中、37℃でインキュベートします。
アポトーシスの誘導5。
- トランスフェクション後5時間では、培養培地への1 / mlのドキシサイクリンを添加することによって、プロアポトーシスタンパク質の発現を誘導します。 5％CO 2中、37℃で18時間、細胞をインキュベートします。
イムノブロット分析によって宿主細胞のアポトーシスの6分析
- 時間の前に細胞を検査細胞死誘導を確認するために、光学顕微鏡下でarvesting。アポトーシス細胞は死にかけのセルを囲むアポトーシス体の存在によって検出可能です。
- 上清を除去し、温かいPBSで一度付着した細胞を洗浄します。 2×Laemmliサンプルバッファー、95℃で5分間加熱し、-20℃で保存100μlの細胞を再懸濁します。
- 負荷12％SDS-PAGEゲル上でサンプル当たり約4×10 4細胞。また、分子量マーカーとして市販のタンパク質ラダーの負荷6μL。 1×レムリランニング緩衝液で45〜60分間、180 Vの定電圧下でのゲル電気泳動システムでゲルを実行します。
- トランスブロットSDセミドライトランスファーセルを用いて60分間、16 Vの定電圧でPVDF膜上にブロットタンパク質（孔径0.45μmの）。
- 室温で1時間、PBS / 0.05％のTween 20（MPT）中の5％脱脂粉乳の10ミリリットルのブロック膜。
- 4μを希釈MPTの4ミリリットル中の抗切断ポリADPリボースポリメラーゼ（PARP）抗体のLと4℃でO / Nインキュベート。
- 10mlのPBS / 0.05％Tween 20で3 10分間の洗浄工程を実行します。
- 4ミリリットルMPTで希釈した0.8μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を有する膜をインキュベートします。
- RTで1時間インキュベートした後、PBS / 0.05％Tween20で膜を3回洗浄する（6.7参照）と製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出します。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。
- 7ミリリットルウエスタンブロットストリッピング緩衝液で室温で30分間のインキュベーションによって結合した抗体を除去します。
- PBS / 0.05％のTween 20（6.7を参照）で3回洗浄した後、4℃でMPT O / N 4ml中の抗アクチン抗体4μlので膜をプローブ。
- MPT（6.7で説明したように）で3回の洗浄工程の後、ホの0.8μlの膜をインキュベートrseradishペルオキシダーゼ結合二次抗体は、MPTの4ミリリットルに希釈しました。
- 室温で1時間インキュベートした後、0.05％/ PBSで膜を6.7に記載されているようにトゥイーン20を（3回洗浄し、製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。
注：全てのインキュベーションステップは示された時間および温度で、プレートシェーカー上で実施しました。
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Representative Results
まず、GFP融合タンパク質として安定に関心（CaeB）のタンパク質を発現するHEK293細胞株を樹立しました。対照として、安定的にGFPを発現するHEK293細胞株も作製しました。 GFPおよびGFP-CaeBの発現は、免疫ブロット分析によって確認しました。代表的なイムノブロット（ 図4A）は、GFPおよびGFP-CaeBの安定と明確に検出可能な発現を示しています。しかし、このアッセイは、全ての細胞がGFPまたはGFP-CaeBを発現しているかどうか判断できません。したがって、安定的にトランスフェクトHEK293細胞株は、フローサイトメトリーによって分析しました。 図4Bに示すように、両方の細胞株における細胞の90％がGFPを発現しました。したがって、これらの安定な細胞系は、さらにCaeBの機能を分析するために使用することができます。次のステップでは、CaeBの抗アポトーシス活性は、切断されたPARPに対する抗体を用いたイムノブロット分析により分析しました。核PARPのタンパク質分解切断は、DNA修復活性を不活性化し、TERMIの典型的なマーカーでありますアポトーシスの最終段階。 PARPの切断は、GFPの発現も、GFP-CaeBのどちらも細胞に対して毒性であることを実証し、HEK293-GFPまたはHEK293-GFP-CaeB細胞において検出されません。しかし、細胞は内因性のアポトーシスの強力な誘導物質、スタウロスポリンで処理した場合、PARPの切断が（ 図5）を検出しました。重要なことに、HEK293-GFP-CaeB細胞はCaeB 7 コクシエラバーネッティ IV型分泌系のエフェクタータンパク質の抗アポトーシス活性を示し、PARPの切断の減少を示します。
ステップCaeBはアポトーシス経路を妨害するで分析するために、テトオン方式を採用しました。具体的には、HEK293-GFPまたはHEK293-GFP-CaeB細胞恒常ドキシサイクリン制御デュアルリプレッサー/アクチベーターセットアップ（ 図2）とのpTRE応答プラスミドコードする完全長のヒトのBaxのいずれかまたは活性化形態を発現レギュレータープラスミドでトランスフェクトしました。ヒトカスパーゼ3、（revCasp 3と呼ばれます図3）。このシステムは、非誘導条件（ 図6）の下でPARP切断の欠如によって示されるように、厳密に調節されています。トランスフェクト細胞へのドキシサイクリンの添加はCaeBはBaxの下流のアポトーシス経路に干渉する場合には、発現とBaxのその後の活性化によって生成されたアポトーシスシグナルがCaeB発現によってブロックされるべきであるのBaxまたはrevCasp 3の発現をもたらしました。 HEK293-GFP細胞は明らかなPARP切断を表示しながら、実際には、安定的にGFP-CaeBを発現するHEK293細胞が深く、ドキシサイクリン制御Bax発現によるアポトーシスの誘導を阻害します。この結果は示しているのBax活性化の下流CaeBブロックアポトーシス誘導。アポトーシス経路における後期イベント - 次に、それはCaeBはカスパーゼ3活性化を妨害することができるかどうかを分析しました。エフェクターカスパーゼ3一度ACTIVされていることを示すHEK293-GFP細胞と同様に、HEK293-GFP-CaeB細胞、展示PARP切断（ 図6）、ated、CaeBが発生し、アポトーシスを防ぐことはできません。まとめると、これらのデータはCaeBはBaxおよびカスパーゼ3活性化の間に作用することを実証します。
テトラサイクリン調節系の図1の概要図。テトオンシステムは、二つの異なるプラスミド、規制や応答プラスミドから構成されています。とのTet応答性リバーストランス活性化因子（rtTA、白丸）、調節プラスミドはテト応答transsilencer（黒丸のtTS）をコードします。両タンパク質は、強力な構成的、構成的伸長因子1アルファプロモーター（P EF-1A）の制御下で発現されます。 TTSとのrtTA（それぞれ消音器または活性剤、）真核生物の転写調節ドメインおよび細菌テトラサイクリンリプレッサー（TetRの）からなるキメラ転写因子です。のTetR DNAが7 TETへの結合を媒介しますのtetO）配列が。 のtetOを一緒のTet応答性エレメント（TRE）を形成する、誘導最小限のサイトメガロウイルスプロモーター（P CMV）の上流に位置します。非誘導条件下で、のtTSは、発現を妨げるTREに結合しています。ドキシサイクリン（DOX;満たされたダイヤモンド）を加えた後、rtTAのは立体構造変化と活性化につながるのDoxと相互作用します。活性化のrtTAは、このように、アポトーシス誘導および細胞死をもたらす、それぞれの標的遺伝子の転写Baxおよびカスパーゼ3を許可する、応答プラスミド上のtTSを置き換えます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
BACにおける増殖のための必須調節プラスミドpWHE125。要素の図2.回路図の概要テリア、複製起点（ORI PBR）とアンピシリンに対する抗生物質耐性カセット（アンプR）を含む、そのようなヒトサイトメガロウイルスの強力な構成即時初期プロモーター/エンハンサーなどのTet-トランスレギュレーターの発現（P用/ E のhCMV）、シミアンウイルス40（SV40ポリA）からのポリオウイルス（PV-IRES）およびポリAサイトからの内部リボソーム結合部位が表示されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3.応答プラスミドの概略図。複製起点（ORI PBR）と抗生物質耐性カセット（アンプR）などの細菌での増殖のための、そして真核生物での誘導発現のための要素が不可欠で、そのような導入遺伝子expressiとしてテト依存最小プロモーターTREtight（P TREtight）とカセットに、金利人間のBax（hBax）およびシミアンウイルス40（SV40ポリA）からのポリA部位の遺伝子は、描かれています。導入遺伝子発現カセットは、ニワトリHS4絶縁コア配列（HS4コア）の2つのコピーのタンデム直接反復に隣接しています。さらに、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター（P mPGK）からなるG418耐性カセットは、ネオマイシン耐性遺伝子（G418 R）およびヒトチミジンキナーゼポリA部位（TKポリA）が存在する。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。
図4 HEK293-GFP及びHEK293-GFP-CaeBが安定緑色蛍光タンパク質を発現する。HEK293-GFPの（A）全細胞溶解物およびHEK293-GFP-CaeB細胞は、安定な発現を示すために、GFPのために免疫ブロットしました。 HEK293-GFPおよびHEK293-GFP-CaeB細胞の（B）の代表的フローサイトメトリー（FACS）分析は、GFP発現の強さを実証するために示されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図スタウロスポリン誘発性アポトーシスに対するGFP-CaeBの発現5.影響 HEK293-GFP及びHEK293-GFP-CaeB細胞は内因性のアポトーシスを誘導するために6時間、4μMのスタウロスポリンで処理しました。アポトーシスは、切断されたPARPイムノブロット分析によって分析しました。 PARP切断は、HEK293-GFP細胞と比較して、HEK293-GFP-CaeB細胞で減少した。 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
テトンシステムの図6.使用法CaeBの作用点を絞り込むために使用します。（A）アポトーシスは、HEK293-GFPおよびHEK293-GFP-CaeB細胞におけるBaxの発現によって誘導されました。アポトーシスは、切断されたPARPイムノブロット分析によって分析しました。 PARP切断は、HEK293-GFP細胞と比較して、HEK293-GFP-CaeB細胞において減少しました。 （B）アポトーシスは、HEK293-GFP及びHEK293-GFP-CaeB細胞におけるrevCasp 3の発現により誘導されました。アポトーシスは、切断されたPARPイムノブロット分析によって分析しました。 PARP切断は、HEK293-GFP-CaeB及びHEK293-GFP細胞で同程度であった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
多くの病原性細菌は、宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の分泌または転位する分泌系を保有します。これらのエフェクタータンパク質は、細菌が生存し、それらのそれぞれの細胞内ニッチ内で複製することができ、宿主細胞内でプロセスおよび経路を調節する能力を有します。生化学的活性およびエフェクタータンパク質の分子機構を理解することは、病原性のより良い理解に向けて支援すると病気と闘うための新たな治療ツールを開発するのを助けることができます。また、エフェクタータンパク質は、しばしば、宿主細胞の活性を模倣することによってその機能を発揮するように、それらはまた、真核細胞1の生物学についての詳細を使用することができます。 1）機能的なエフェクタータンパク質間の冗長性、2）エフェクタータンパク質の関与の時間的調節、および3）effecただし、単一のエフェクタータンパク質の生化学的活性を研究することは、いくつかの理由のために複雑であることが証明されていますTORタンパク質は、その機能を妨害する、他のエフェクタータンパク質との関連での作業します。したがって、エフェクタータンパク質の活性は、一般的に過剰発現研究により検討されています。残念ながら、エフェクタータンパク質の一過性過剰発現の使用はまた、いくつかの欠点を有します。したがって、単一細胞分析アッセイを使用することができ、エフェクタータンパク質の活性は、他のエフェクタータンパク質の活性に依存する場合、エフェクタータンパク質の活性を分析することができません。少なくとも第1の欠点を克服するために、安定な細胞株を使用することができます。ケースでは、エフェクタータンパク質の発現は、これが適切ではない、細胞に対して毒性です。我々は、アポトーシス誘導タンパク質（下記参照）の一過性発現のために、ここで説明するように、このシナリオでは、安定した誘導細胞株は、同様のシステムを使用して確立することができます。しかし、我々の結果（ 図5）は CaeBの発現がアポトーシスを受けてから細胞を保護し、そのためではないことを示しています有毒。 CaeBはアポトーシス誘導を妨害アポトーシスカスケード内のステップで解剖のいくつかのオプションがあります。一つの可能性はCaeBの宿主細胞の結合パートナーを決定することです。しかし、これは非常に困難であり、結合パートナーの同定は、アポトーシスカスケード内CaeBの作用点を説明するのに役立つていない場合があります。別の可能性は、異なるアポトーシス誘導物質を使用することであるが、CaeBは、このアプローチはまた、CaeBの作用点の同定につながらない可能性があることを示す、二つの異なるアポトーシス誘導物質、紫外線およびスタウロスポリン7によるアポトーシス誘導を阻害します。ここで利用されたCaeBの作用点を絞り込むにおける別の可能性は、アポトーシスシグナル伝達カスケードは、定義されたステップに誘導することができるシステムを使用することです。
目的のタンパク質が、既に細胞生理学、そのexpreを妨害するように選択された細菌のエフェクタータンパク質のケース式ではssionはまた、標的タンパク質を発現するために使用されるものとして、 例えば 、誘導性発現系の制御下に置くことができます。リガンドは、細胞生理学上の異なる効果のために細胞をモニターするために調査員を可能にし、システム出力シグナル伝達、細胞培養物に添加されたときに、対象と標的タンパク質の両タンパク質の発現が同時に誘導されます。
目的のタンパク質は、選択された経路の生理学的活性を妨害する場合、明らかに、目的のタンパク質を発現し、選択された経路タンパク質の誘導性発現によって、特定の細胞内経路にその作用点を特定しようとする最も効果。この場合、読み出しは、通常、Wntシグナル伝達の場合にはアポトーシスシグナル伝達や転写の活性化した場合の細胞死として、経路に関連する信号の欠如は単純です。原理的には、特定の経路を活性化するタンパク質はまた、このTを用いてプローブすることができますアッセイ系のYPE。それだけで、目的のタンパク質は、経路のシグナル伝達を救うことができれば経路タンパク質と試験に対するSI / SH / miRNAの誘導性発現を使用して、例えば、異なるセットアップする必要があります。あるいは、特定のタンパク質の小分子阻害剤は、経路内のシグナル伝達を遮断するために使用することができ、その後、目的のタンパク質の誘導性発現によって経路救助をチェックします。しかし、このタイプのアプローチは、上記のプロトコルよりも実験的により困難になります。
干渉アッセイでプローブする標的遺伝子の選択は、原則として、簡単です。これは微調整する経路との相互作用の関心のサイトのタンパク質の同定を可能な限り選択シグナル伝達経路中のタンパク質の多くをテストすることをお勧めします。それはすべての潜在的interacを監視するために、常に、実験可能あるいは不可能であるため、これは、反復的な方法で行われるべきです1回の実験でるパートナー。そのため、まず、第1ラウンドで得られた情報を用いた実験を絞り込むこと全体の経路に沿って均等に間隔をあけいくつかのタンパク質をテストし、することをお勧めします。シグナル伝達経路は、多くのタンパク質は、タンパク質分解性切断のように、例えば、リン酸化またはSUMO化、または処理イベントなどによって、共有結合修飾のいずれかによって、翻訳後に修飾されます。その結果、それぞれのタンパク質は、基底状態でまたは活性化形態のいずれかです。可能な場合には、二つの理由のためのタンパク質の両方の形態をテストすることをお勧めします。一つは、活性化型は、目的のタンパク質のためのより厳しい課題を提示、より高い出力信号31を 、提供することです。私達の証明の原理の例では、アポトーシスシグナル伝達は、カスパーゼ3がタンパク質分解切断および二量体化によって活性化されます。この活性化事象は、未処理のプロカスパーゼ遺伝子を再配置することによって人工的にシミュレートすることができます。小サブユニットは、人工的に配置されています大サブユニットの前面との両方で、リンカーによって結合されています。これは「逆カスパーゼ」と呼ばれ、35の発現された場合、酵素の活性化形態を表します。それが原因活動のそのより高い程度に選ばれました。それは、目的のタンパク質は、標的タンパク質の活性化を妨害する場合、またはそれが経路中のタンパク質の下流に作用する場合は、1つの区別を可能にするため、経路タンパク質の両方の基底状態および活性化形態をプロービングするための第二の理由です。最初のケースでは、基底状態の形態が発現される場合、細胞死が抑制されるが、活性型で存在していない場合。第二のケースでは、いずれのタンパク質は、アポトーシスにつながります。したがって、修飾されたタンパク質の両方の形態のテストは、解析システムの分解能を向上させます。
誘導性発現ベクターに目的遺伝子をクローニングすることは、いくつかの決定を必要とします。ベクトルがSである場合、まず、標的遺伝子の発現は、一過性に発生するか、優れていなければなりませんtably宿主細胞株のゲノムに組み込ま？一過性の発現のみが必要とされる場合、そのようなテト依存性プロモーターとポリA部位、またはそのようなPBI-2または3 PBI-36遺伝子の発現カップルとして双方向ベクターを含みpUHC13-3 24、などの単純なベクトル標的遺伝子の発現を容易に監視するためのレポーター遺伝子の発現を対象とし、十分であろう。安定した発現が好ましい場合には、そのようなpWHE655 33（ 図3）のようなベクターが使用されるべきです。これは、誘導性導入遺伝子発現に干渉するのゲノム組込み部位の位置効果を防止するために、導入遺伝子発現ユニットに隣接する絶縁体が含まれています。また、ベクター組込み事象の選択を容易にするためにG418、耐性カセットを連結したが、独立して発現が含まれています。これらの変更の最終結果は、優れた調節特性33,37,38を有するクローンの数の増加です。 cDNAのSE標的遺伝子のquencesをEcoRIおよびEcoRV 33のためのユニークな制限部位を使用して、このベクターにクローニングすることができます。逆カスパーゼ3のcDNAを発現するベクターのクローニングヒトのBaxを発現するベクターのクローニング33が同様に実行された参考文献に詳細に記載されました。人間のBaxのcDNAをEcoRIおよびEcoRVのための制限部位を導入するオリゴヌクレオチドプライマーを用いてプラスミドpVenus-Baxの39からPCRによって増幅しました。二つの酵素を用いたPCRフラグメントおよび制限を精製した後、断片はpWHE655TREtight-バックスを得、同様に制限pWHE655と連結しました。第二に、その最小プロモーターは、導入遺伝子発現のための最も適切なのですか？元の最小プロモーターP のhCMV * -1 24ディスプレイ機能インターフェロンα誘導性応答エレメント29の存在に一部起因いくつかの細胞型特異的漏出30、。これは、第二世代のTet依存の開発につながっプロモーターは、 のtetO要素間と異なる最小限のプロモーター配列33,40-42と変更された間隔および配列と、ΔMtetO、TREtightとSG-TREと呼ばれます。彼らは、ドキシサイクリンの非存在下で大幅に減少漏出を表示します。これらの第二世代のプロモーターのうち、ΔMtetO33はドキシサイクリンの存在下で最小の導入遺伝子発現レベルを有します。 TREtightは、導入遺伝子の発現33の中間およびSG-TRE最高レベルを仲介します。さらなる修飾は、テトラサイクリン応答性プロモーターであっても、より43,44のバックグラウンド発現を最小限に抑えています。従って、テトラサイクリン応答性プロモーターの選択は、それぞれの導入遺伝子の要件または制限に応じて作ることができます。
実験的アプローチの種類とは無関係に、標的タンパク質の発現の気密性が重要です。例えば、プロアポトーシスタンパク質の活性化形態とアポトーシスの誘導は、細胞につながりますそれぞれの標的タンパク質の最小限の量は31〜33を表現していても、死、。必要なストリンジェンシー条件の調節システム30にテトラサイクリン依存transsilencerを添加することによって達成されます。これは、誘導性プロモーターからの転写が積極的に一過性トランスフェクションが行われたとき、彼らは典型的には、その導入遺伝子発現30でなく、漏洩しているため、特に重要である、抑制されることを保証します。細胞死を誘発しないシグナル伝達経路を探査している場合は、代わりにtranssilencer 43,44に使用することができることなく、標的遺伝子発現の調節のための厳しい要件を緩和し、誘導システムであってもよいです。
シグナル伝達経路を探索するために使用される誘導性の調節システムは、テトシステムである必要はありません。その主な利点は、それが集中今や20年以上の哺乳動物細胞において使用されていることであり、それであることが最も高度に開発され、最高のCHaracterized誘導制御システム。それにもかかわらず、その代わりに、またはTetリシステムに加えて使用することができる少なくとも25の他の条件付き制御系45,46があります。二、三の異なる誘導系は収束のシグナル伝達経路をプロービングまたは標的遺伝子または目的のタンパク質のいずれかのテストの冗長性のために有用である可能性があります。
ここで紹介する手順は、プローブされるそれぞれのシグナル伝達経路からの堅牢で信頼性の高い出力信号をもたらすトランスフェクション効率で動作するはずです。安定な細胞株は均質様式（ 図4B）で目的のタンパク質を発現させるため、一時的に目的のタンパク質を発現する誘導性プラスミドでトランスフェクトされたすべてのセルが経路シグナル伝達と目的のタンパク質との干渉のためにプローブします。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
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