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Immunology and Infection

L'application d'un système d'expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52903
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

Abstract

La technique présentée ici permet d'analyser une étape au cours de laquelle une protéine cible, ou en variante, une petite molécule, interagit avec les composants d'une voie de signalisation. La méthode est basée, d'une part, sur l'expression inductible d'une protéine spécifique pour initier un événement de signalisation à un pas prédéterminé et défini dans la cascade de signalisation sélectionné. Expression concomitante, d'autre part, du gène d'intérêt permet alors l'investigateur d'évaluer si l'activité de la protéine cible exprimée est situé en amont ou en aval de l'événement de signalisation initiée, en fonction de l'affichage de la voie de signalisation qui est obtenue. Ici, la cascade apoptotique a été choisi comme une voie de signalisation définis pour démontrer la fonctionnalité de protocole. Les bactéries pathogènes, telles que Coxiella burnetii, translocation des protéines effectrices qui interfèrent avec l'induction de la mort de la cellule hôte dans la cellule hôte afin d'assurer la survie des bactéries dans la cellule et pour promouvoir leurla diffusion dans l'organisme. Les C. protéines effectrices burnetii CAEB inhibe efficacement la mort de la cellule hôte après l'induction de l'apoptose avec la lumière UV ou à la staurosporine. Pour affiner à quelle étape CAEB interfère avec la propagation du signal apoptotique, protéines sélectionnées ayant une activité pro-apoptotique bien caractérisé ont été exprimés de manière transitoire dans une manière de doxycycline inductible. Si CAEB agit en amont de ces protéines, l'apoptose se dérouler librement. Si CAEB agit en aval, la mort cellulaire sera inhibée. Les protéines d'essai ont été sélectionnés Bax, qui agit au niveau de la mitochondrie, et de la caspase 3, ce qui est la principale protease exécuteur. CAEB interfère avec la mort cellulaire induite par l'expression de Bax, mais pas par la caspase 3 expression. CAEB, par conséquent, coopère avec la cascade apoptotique entre ces deux protéines.

Introduction

La virulence de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatif dépend de systèmes de sécrétion spécialisés de détourner des cellules hôtes eucaryotes. Les bactéries utilisent ces systèmes de sécrétion d'injecter des protéines de virulence bactérienne (effecteurs) dans la cellule hôte afin de moduler une variété d'activités cellulaires et biochimiques. L'étude des protéines effectrices a non seulement fourni un remarquable aperçu sur les aspects fondamentaux de interactions hôte / pathogène mais aussi dans la biologie fondamentale des cellules eucaryotes 1. La modulation de l'apoptose de la cellule hôte a été démontré être un mécanisme de virulence important pour de nombreux agents pathogènes intracellulaires, et un certain nombre de protéines effectrices de modulation de l'apoptose ont été identifiés 9.2. Cependant, les mécanismes moléculaires précis d'activité demeurent insaisissables dans de nombreux cas.

Apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, joue un rôle important dans les réponses immunitaires à l'infection 10. Deux principales voies conduisant à l'apoptose ontété identifiés: le ciblage des mitochondries (apoptose intrinsèque) ou la transduction directe du signal par les récepteurs de mort cellulaire à la membrane plasmique (apoptose extrinsèque). La voie de la mort cellulaire intrinsèque ou à médiation par les mitochondries est déclenché par des signaux intracellulaires et implique l'activation de Bax et Bak, deux membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2. Cette famille est composée de protéines régulatrices pro- et anti-apoptotiques qui contrôlent la mort des cellules 11-14. L'activation de l'apoptose conduit à une oligomérisation de Bax et Bak suivi ultérieur par perméabilisation de la membrane externe des mitochondries, ce qui entraîne la libération du cytochrome C dans le cytoplasme. Libération de cytochrome c initie l'activation des caspases effectrices 3 et 7 par activation de la caspase 9 dans le apoptosome 15. Cela conduit à la protéolyse de substrats sélectionnés qui, entre autres, des résultats de l'exposition de la phosphatidylsérine sur la surface de la cellule 16 et libère une DNase dédié qui fragmente chromatin 17,18.

Afin de déterminer l'emplacement dans la cascade apoptotique une protéine effectrice individuel gêne, un système d'expression inductible a été utilisé 19. Les systèmes de régulation pour l'expression conditionnelle de transgènes ont été un outil précieux dans l'analyse de la fonction d'une protéine dans la cellule ou de son importance pour les tissus, organes et le développement de l'organisme, ainsi que lors de l'initiation, la progression et l'entretien de la maladie 20-23. Typiquement, les systèmes de contrôle inductibles, tels que le système Tet 24 employée ici, forment une unité de transcription artificielle (voir Figure 1). Un composant est un facteur de transcription appelé tTA conçue artificiellement (transcription activateur tétracycline-dépendant), formé par fusion de répresseur de la transcription bactérienne 25 TetR à un domaine de protéine de mammifère qui médie l'activation transcriptionnelle ou taire 24,26. Le deuxième composant est un hybridepromoteur, appelé TRE (élément de tetracycline sensible), consistant en un promoteur minimal eucaryote, contenant au moins une boîte TATA et un site d'initiation de transcription, reliée à plusieurs répétitions de la site de liaison à l'ADN apparenté pour TetR, tetO 24,25. Le troisième composant est le ligand naturel de TetR, la tétracycline ou un de ses dérivés, tels que la doxycycline ou 25 anhydrotétracycline. Lors de l'addition de ligand dans le milieu de culture, TetR perd son affinité pour tetO et se dissocie du TRE. De ce fait, la transcription du gène cible est supprimée. L'expression du transgène peut, ainsi, être étroitement contrôlé d'une manière temps et dose-dépendante à la fois dans la culture cellulaire et chez les animaux 20,23,24. Avec tTA, l'expression du transgène se produit de manière constitutive, sauf en présence d'une tetracycline. Cela peut être un inconvénient dans l'étude des protéines cytotoxiques ou oncogènes parce tétracycline doit d'abord être retiré du système, avant transgène expression se produit et les effets de la protéine cible sur la cellule peut être surveillé. Cela peut prendre beaucoup de temps et ne sont pas toujours complète, en particulier dans 27 des animaux transgéniques. Pour remédier à cette limitation, un mutant avec TetR une réponse inverse de la présence de doxycycline a été utilisé pour générer un nouveau facteur de transcription, rtTA (tTA inverse) 28. Il se lie uniquement au TRE et, de façon concomitante, active la transcription en présence de doxycycline. Perméabilité résiduelle du système, à savoir., L'expression du transgène en l'absence de TRE lié facteur de transcription, provenant soit (i) d'effets de position à un site d'intégration génomique, (ii) à partir du TRE lui-même 29, ou (iii) de non spécifique de la liaison de tTA / rtTA 28, a été adressée par l'introduction d'un silencieux de transcription supplémentaire, appelée TTS (dépendant de la tétracycline silencieux transcription) 30 dans le système. Il forme un réseau de régulateur double avec rtTA (voir Figure 1).En l'absence de doxycycline, TTS se lie à TRE et arrête toute transcription reste activement. En présence de doxycycline, TTS dissocie de TRE et rtTA lie induire simultanément l'expression du gène cible. Cette couche supplémentaire de rigueur est souvent nécessaire pour exprimer des protéines cytotoxiques très actifs 31-34.

Grâce à ce système à double régulateur étroitement contrôlé, la cascade apoptotique peut être initié à une étape définie permettant l'analyse de savoir si la protéine effecteur donné peut interférer avec induction d'apoptose. Cette méthode ne peut pas être utilisé pour étudier l'activité anti-apoptotique des protéines effectrices bactériennes mais également pour l'expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer les interférences avec d'autres voies de signalisation.

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Protocol

1. Génération de lignées cellulaires stables exprimant la protéine d'intérêt

  1. Préparer les médias par l'ajout de FCS inactivé à la chaleur et 1% de pénicilline / streptomycine à disponibles dans le commerce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec du GlutaMAX-I, le pyruvate, et 4,5 g / L de D-glucose.
  2. Cultiver des cellules HEK293 dans un milieu à 37 ° C dans 5% de CO2. Sous-cultiver les cellules tous les trois jours. Retirez les médias et remettre les cellules dans 15 ml de médias fraîches. Pipette de 1 ml dans un nouveau 75 cm 2 de culture cellulaire ballon et ajouter 14 ml médias.
  3. Analyser le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
  4. Seed cellules HEK293 dans une plaque à 6 puits à une densité de 2 x 10 5 cellules par puits et incuber pendant 24 heures.
  5. Pour la transfection en utilisant le protocole fourni par le fabricant du réactif de transfection. Transfecter des cellules avec pEGFP-C2 ou pEGFP-C2-CAEB en utilisant le réactif de transfection. Avant d'utiliser, réchauffer le GCI de transfectionent et les médias nécessaires à la RT. Utiliser un ratio de 3: 1 de réactif de transfection à l'ADN.
    1. Dans le détail, une pipette 1,5 ul de réactif de transfection directement dans 50 ul de milieu DMEM exempt de sérum. Pour la formation du complexe, une pipette 0,5 pg d'ADN codant pour la GFP ou GFP-CAEB au mélange réactif contenant transfection et incuber pendant 15 min à température ambiante.
    2. Transfecter des cellules en ajoutant le mélange réactionnel d'une manière goutte à goutte et laisser incuber à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 24 heures.
  6. Ajouter 1 mg / ml de généticine pour la sélection de clones GFP-positives à 37 ° C dans 5% de CO2.
  7. Après 6 jours, isoler des cellules uniques par cytométrie de flux de tri dans une plaque de 96 puits hébergeant moyen et HEK293 surnageant dans un rapport de 1: 1. Générer à partir de cellules HEK293 surnageant de culture confluente HEK293 qui ont été centrifugées pendant 15 min à 4966 x g.
  8. Le jour suivant, remplacer le milieu de culture avec du milieu contenant 1,50; mg / ml de généticine. Changer les médias une fois par semaine. Si les cellules forment une monocouche confluente, les transférer sur une plaque de 24 puits. Sous-cultiver les cellules deux fois par semaine dans un rapport de 1: 5 dans un milieu contenant 1,5 mg / ml de généticine. Enfin, l'analyse du pourcentage de cellules positives pour la GFP par analyse par immunotransfert et cytométrie de flux.

2. Analyse des lignées cellulaires stables par analyse immunoblot

  1. Retirer le surnageant et laver les cellules adhérentes une fois avec du PBS chaud. Reprendre les cellules dans 100 ul de 2x Laemmli tampon d'échantillon, de la chaleur pendant 5 min à 95 ° C et à -20 ° C.
  2. Charge d'environ 4 x 10 4 cellules par échantillon sur un gel SDS-PAGE à 12%. En outre, la charge 6 ul d'une échelle de protéines commercial en tant que marqueur de poids moléculaire. Exécuter gels dans un système d'électrophorèse sur gel dans une tension constante de 180 V pendant 45 à 60 min avec du tampon Laemmli 1x fonctionnement.
  3. Blot protéines sur des membranes de PVDF (taille des pores de 0.45 pm) à une tension constante de 16 V pendant 60 min en utilisant un Trans-Blot SD cellule de transfert semi-sec.
  4. membranes de blocs dans 10 ml de lait en poudre écrémé 5% dans PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) pour 1 heure à température ambiante.
  5. Diluer 4 ul d'anticorps anti-GFP dans 4 ml de MPT et incuber les membranes O / N à 4 ° C.
  6. Effectuer trois 10 min étapes de lavage avec 10 ml de PBS / Tween 20 0,05%.
  7. Incuber les membranes avec 0,8 ul d'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort-dans 4 ml de MPT.
  8. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 2.6) et détecter l'activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement standard pour le développement du film à visualiser les bandes de protéines.

3. Analyser les cellules en utilisant un cytomètre de flux.

  1. Remettre en suspension les cellules dans du PBS. Utiliser des cellules HEK293 comme contrôle négatif pour ajuster avant scAtter (FSC) et de la diffusion latérale (SSC), de sorte que les cellules sont à l'échelle. Tracer une grille sur des cellules vivantes en excluant les doublets de cellules, les agrégats et les débris cellulaires.
  2. Ajustez le tube photomultiplicateur (PMT) gain de sorte que les cellules non colorées sont à l'extrême gauche de l'histogramme pour le canal FL1 (488 nm laser argon).
  3. Pour analyser l'intensité de fluorescence des cellules HEK293-GFP et HEK293-GFP-CAEB ouvrir l'histogramme du canal FL1 et acquérir 10.000 événements de la population fermée.
  4. Analyser les données en utilisant FACS commerciales logiciel d'analyse.

4. La transfection de la lignée cellulaire stable avec le système de vecteur d'expression inductible

  1. cellules HEK293 de semences exprimant de manière stable la GFP ou la GFP-CAEB dans une plaque à 12 puits à une densité de 1 x 10 5 cellules / puits.
  2. 19 heures après l'ensemencement, co-transfecter les cellules avec régulateur plasmide et la réponse plasmide codant soit Bax ou caspase 3.
    1. Co-transfecter les cellules HEK293 stablesavec 100 ng de pWHE125 plasmide régulateur-P (figure 2) et 100 ng de plasmides d'intervention pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (figure 3) et 0,4 ul de polyéthylène-imine.
    2. Préparer l'ADN et polyéthylènimine réactif de transfection chacun dans 75 pi de milieu Opti-MEM et incuber pendant exactement 5 minutes à température ambiante. Pour la formation du complexe, les deux mélanges incuber ensemble pendant 15 min à température ambiante.
  3. Ajouter la solution goutte à goutte aux cellules polyéthylèneimine / ADN et incuber à 37 ° C dans 5% de CO2.

5. induction de l'apoptose

  1. 5 heures après la transfection, induire l'expression des protéines pro-apoptotiques par addition de 1 ug / ml de doxycycline dans le milieu de culture. Incuber les cellules pendant 18 heures à 37 ° C dans 5% de CO2.

6. Analyse de la cellule hôte apoptose par analyse immunoblot

  1. Inspectez cellules avant harvesting sous le microscope optique pour vérifier la mort des cellules induction. Les cellules apoptotiques sont détectables par la présence de corps apoptotiques qui entourent la cellule meurt.
  2. Retirer le surnageant et laver les cellules adhérentes une fois avec du PBS chaud. Reprendre les cellules dans 100 ul de 2x Laemmli tampon d'échantillon, de la chaleur pendant 5 min à 95 ° C et à -20 ° C.
  3. Charge d'environ 4 x 10 4 cellules par échantillon sur un gel SDS-PAGE à 12%. En outre, la charge 6 ul d'une échelle de protéines commercial en tant que marqueur de poids moléculaire. Exécuter gels dans un système d'électrophorèse sur gel dans une tension constante de 180 V pendant 45 à 60 min avec du tampon Laemmli 1x fonctionnement.
  4. Blot protéines sur des membranes de PVDF (taille de pores de 0,45 um) à une tension constante de 16 V pendant 60 min en utilisant une cellule de transfert semi-sec Trans-Blot SD.
  5. membranes de blocs dans 10 ml de lait en poudre écrémé 5% dans PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) pour 1 heure à température ambiante.
  6. Diluer 4 μl d'anticorps anti-poly clivé ADP-ribose polymerase (PARP) dans 4 ml de MPT et incuber O / N à 4 ° C.
  7. Effectuer trois 10 min étapes de lavage avec 10 ml de PBS / Tween 20 0,05%.
  8. Incuber membranes avec 0,8 Anticorps secondaires ul de la peroxydase de raifort conjugué dilué dans 4 ml MPT.
  9. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7) et détecter l'activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement standard pour le développement du film à visualiser les bandes de protéines.
  10. Éliminer les anticorps liés par incubation de 30 min à température ambiante avec 7 ml Western Blot Décapage tampon.
  11. Après trois lavages avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7), la sonde les membranes avec 4 ul d'anticorps anti-actine dans 4 ml de MPT O / N à 4 ° C.
  12. Après trois étapes de lavage avec MPT (comme décrit dans 6.7), incuber les membranes avec 0,8 ul d'hodes anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de rseradish dilués dans 4 ml de MPT.
  13. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7 et détecter l'activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement de série pour le développement de films à visualiser les bandes de protéine.
    Remarque: Toutes les étapes d'incubation ont été réalisées sur un agitateur de plaque pendant le temps indiqué et la température.

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Representative Results

Premièrement, des lignées de cellules HEK293 exprimant de manière stable la protéine d'intérêt (CAEB) en tant que protéine de fusion GFP ont été établies. A titre de témoin, les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable GFP ont également été générées. L'expression de la GFP et GFP-CAEB a été vérifiée par analyse par immunotransfert. Le représentant immunoblot (figure 4A) démontre l'expression stable et clairement détectable de la GFP et GFP-CAEB. Cependant, ce test ne peut déterminer si toutes les cellules expriment la GFP ou la GFP-CAEB. Par conséquent, les lignées de cellules HEK293 transfectées de manière stable ont également été analysées par cytométrie de flux. Comme le montre la Figure 4B, plus de 90% des cellules dans les deux lignées cellulaires exprime la GFP. Ainsi, ces lignées cellulaires stables peuvent être utilisés pour analyser la fonction en outre de la DGVEE. Dans l'étape suivante, l'activité anti-apoptotique de la DGVEE a été analysée par une analyse par immunotransfert en utilisant un anticorps contre PARP clivée. Le clivage protéolytique de la PARP nucléaire inactive l'activité de réparation d'ADN et est un marqueur typique de la termistades finale de l'apoptose. Le clivage de la PARP est pas détectée dans les cellules HEK293-GFP ou des cellules HEK293-GFP-CAEB, ce qui démontre que ni l'expression de la GFP, ou de GFP-CAEB est toxique pour les cellules. Toutefois, lorsque les cellules ont été traitées à la staurosporine, un puissant inducteur de l'apoptose intrinsèque, le clivage de la PARP a été détectée (figure 5). Fait important, les cellules HEK293-GFP-CAEB présentent une clivage de la PARP réduites, ce qui indique l'activité anti-apoptotique de la Coxiella burnetii de type IV protéine effectrice du système de sécrétion CAEB 7.

Pour analyser à quelle étape CAEB interfère avec la voie de l'apoptose, le système Tet-On a été employé. Dans le détail, les cellules HEK293-GFP ou HEK293-GFP-CAEB ont été transfectées avec un plasmide régulateur exprimant de manière constitutive une double répresseur / configuration de doxycycline contrôlée activateur (figure 2) et un codage pTRE réponse plasmidique soit pleine longueur Bax humaine ou la forme activée de caspase 3 humain, appelé revCasp 3 (Figure 3). Ce système est étroitement régulée, comme en témoigne l'absence de clivage de la PARP dans des conditions non-induisant conditions (figure 6). L'addition de doxycycline dans les cellules transfectées a donné lieu à l'expression de Bax ou revCasp 3. Si CAEB interfère avec la voie apoptotique en aval de Bax, alors le signal généré par apoptose et l'activation subséquente expression de Bax doit être bloqué par expression CAEB. En effet, les cellules HEK293 exprimant de façon stable GFP-CAEB inhiber profondément induction de l'apoptose par doxycycline contrôlée Bax expression, tandis que les cellules HEK293-GFP affichés évident clivage PARP. Ce résultat indique que les blocs CAEB induction de l'apoptose en aval de l'activation de Bax. Ensuite, il a été examiné si CAEB peut interférer avec activation caspase 3 - un événement à la fin de la voie apoptotique. Les cellules HEK293-GFP, ainsi que des cellules HEK293-GFP-CAEB, exposition clivage PARP (figure 6), ce qui indique que, une fois la caspase effectrice 3 est activATED, CAEB ne peut pas empêcher l'apoptose de se produire. Prises ensemble, ces données démontrent que CAEB agit entre Bax et de la caspase 3 activation.

Figure 1
Figure 1. Aperçu schématique du système de réglementation des tétracyclines. Le système Tet-On est composé de deux plasmides différents, les plasmides de réglementation et d'intervention. Le plasmide codant pour la réglementation transsilencer Tet-réactive (TTS; cercle rempli) et le transactivateur inverse Tet-réactive (rtTA, cercle ouvert). Les deux protéines sont exprimées de manière constitutive sous le contrôle du fort allongement constitutive facteur-1 alpha promoteur (P EF-1a). TTS et rtTA sont des facteurs de transcription chimériques comprenant un domaine de régulation de transcription eucaryote (silencieux ou activateur, respectivement) et un répresseur bactérien tétracycline (TetR). TetR médiation de liaison à l'ADN de sept tet (tetO) des séquences de ce plasmide de réponse. TetO est situé en amont du promoteur inductible minimal de cytomegalovirus (CMV P), formant ensemble l'élément sensible à Tet (TRE). Dans des conditions non-induisant, TTS est lié à TRE empêchant l'expression. Après addition de doxycycline (Dox; losange plein), rtTA interagit avec Dox conduisant à des changements conformationnels et activation. Activé rtTA remplace TTS sur le plasmide de réponse, permettant la transcription des gènes cibles respectifs Bax et de la caspase 3, conduisant ainsi à induction de l'apoptose et la mort cellulaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Présentation schématique du plasmide pWHE125 réglementaire. Éléments essentiels pour la propagation dans bactères, y compris une origine de replication (ori pBR) et une cassette de résistance aux antibiotiques contre l'ampicilline (AmpR), et pour l'expression des Tet-transregulators, tels que la forte, constitutive précoce immédiat du promoteur / amplificateur du cytomegalovirus humain (P / E hCMV), un site interne de liaison des ribosomes de la polio-virus (PV-IRES) et un site polyA du virus simien 40 (SV40 polyA) sont affichées. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Vue d'ensemble schématique du plasmide de réponse. Les éléments essentiels pour la propagation dans des bactéries, y compris une origine de replication (ori pBR) et une cassette de résistance à un antibiotique (Amp R), et pour l'expression inductible dans des eucaryotes, tels que le transgène Expressisur la cassette avec le promoteur Tet-dépendant TREtight minimal (P TREtight), le gène d'intérêt Bax humaine (hBax) et un site de polyA du virus simien 40 (SV40 polyA), sont représentées. La cassette d'expression du transgène est flanqué par des répétitions directes en tandem de deux copies de la séquence centrale HS4 de l'isolateur de poulet (noyau HS4). En outre, une cassette de résistance à G418 constitué d'un promoteur murin phosphoglycérate kinase 1 (P MPGK), un gène de résistance à la néomycine (G418 R) et un site polyA de la thymidine kinase humaine (TK polyA) est présent. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. HEK293-GFP et HEK293-GFP-CAEB exprimer de manière stable les protéines fluorescentes vertes. (A) lysats de cellules entières de HEK293-GFP etCellules HEK293-GFP-CAEB ont été immunotransférés pour la GFP de montrer une expression stable. (B) cytométrie de flux Représentant (FACS) de HEK293-GFP et les cellules HEK293-GFP-CAEB est représenté à démontrer l'intensité de l'expression de la GFP. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Les effets de l'expression de GFP-CAEB sur l'apoptose induite par la staurosporine. HEK293-GFP et les cellules HEK293-GFP-CAEB ont été traités avec 4 uM de staurosporine pendant 6 heures pour induire l'apoptose intrinsèque. L'apoptose a été analysée par analyse PARP clivée par immunotransfert. Clivage PARP a été réduite dans les cellules HEK293-GFP-CAEB en comparaison aux cellules HEK293-GFP. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandede ce chiffre.

Figure 6
Figure 6. Utilisation du système de Teton d'affiner le point d'action de la DGVEE. (A) L'apoptose a été induite par l'expression de Bax dans HEK293-GFP et les cellules HEK293-GFP-CAEB. L'apoptose a été analysée par analyse PARP clivée par immunotransfert. Clivage PARP a été réduite dans les cellules HEK293-GFP-CAEB en comparaison à des cellules HEK293-GFP. (B) L'apoptose a été induite par l'expression de revCasp 3 HEK293-GFP et les cellules HEK293-GFP-CAEB. L'apoptose a été analysée par analyse PARP clivée par immunotransfert. Clivage PARP était comparable dans les cellules HEK293-GFP-CAEB et HEK293-GFP. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

De nombreuses bactéries pathogènes hébergent des systèmes de sécrétion ou de sécréter des protéines effectrices translocation bactérienne dans la cellule hôte. Ces protéines effectrices ont la capacité de moduler les processus et les voies dans la cellule hôte, ce qui permet aux bactéries de survivre et de se répliquer à l'intérieur de leur niche intracellulaire respectif. Comprendre les activités biochimiques et les mécanismes moléculaires des protéines effectrices aidera à une meilleure compréhension de la pathogénicité et peut aider à développer de nouveaux outils thérapeutiques pour lutter contre la maladie. En outre, comme les protéines effectrices exercent souvent leur fonction en imitant les activités de la cellule hôte, ils peuvent également être utilisés pour en savoir plus sur la biologie des cellules eucaryotes 1. Cependant, l'étude de l'activité biochimique d'une seule protéine effectrice est révélée compliquée pour plusieurs raisons: 1) la redondance fonctionnelle des protéines effectrices, 2) la régulation temporelle de l'engagement des protéines effectrices, et 3) la effectivitéstor protéine dans le contexte de travail avec une autre protéine effectrice, en interférant avec sa fonction. Par conséquent, l'activité d'une protéine effectrice est couramment étudié par des études de surexpression. Malheureusement, l'utilisation de la surexpression transitoire de la protéine effectrice a également plusieurs inconvénients. Ainsi, seuls les tests d'analyse de cellules uniques peuvent être utilisés, et l'activité de la protéine effectrice ne peuvent pas être analysés si l'activité de la protéine effectrice dépend de l'activité d'une autre protéine effectrice. Pour pallier au moins le premier inconvénient, les lignées cellulaires stables peuvent être utilisés. Dans le cas où l'expression de la protéine effectrice est toxique pour la cellule, ce ne convient pas. Dans ce scénario, les lignées cellulaires stables et inductibles peuvent être établies en utilisant un système similaire à celui que nous décrivons ici pour l'expression transitoire des protéines induisant l'apoptose (voir ci-dessous). Cependant, nos résultats (Figure 5) montrent que l'expression de la DGVEE protège les cellules contre l'apoptose et donc pastoxique. Il ya quelques options à disséquer à quelle étape dans la cascade apoptotique CAEB interfère avec induction de l'apoptose. Une possibilité consiste à déterminer le partenaire de liaison de la cellule hôte de la DGVEE. Cependant, ce qui est très difficile et l'identification du partenaire de liaison ne pourrait pas aider à expliquer le point d'action de la DGVEE dans la cascade apoptotique. Une autre possibilité est d'utiliser différents inducteurs d'apoptose, mais CAEB inhibe induction de l'apoptose par deux inducteurs d'apoptose différents, UV-lumière et staurosporine 7, indiquant que cette approche pourrait également ne pas aboutir à l'identification du point d'action de la DGVEE. Une autre possibilité de circonscrire le point d'action de la DGVEE, qui a été exploitée ici, est d'utiliser un système où la signalisation de l'apoptose cascade peut être induite à des étapes définies.

Dans le cas où l'expression de la protéine effectrice bactérienne qui a été sélectionné en tant que protéine d'intérêt déjà interfère avec la physiologie des cellules, ses expression peut également être placé sous le contrôle d'un système d'expression inductible, par exemple, tel que celui utilisé pour exprimer la protéine cible. Ensuite, l'expression à la fois de la protéine d'intérêt et la protéine cible se concomitante induite lorsque le ligand est ajouté à la culture cellulaire permet au chercheur de surveiller les cellules des effets différentiels sur la physiologie cellulaire et de signalisation de sortie du système.

De toute évidence, l'expression d'une protéine d'intérêt et d'essayer d'identifier son point d'action dans une voie intracellulaire spécifique par l'expression inductible de protéines de la voie sélectionnés fonctionne mieux si la protéine d'intérêt interfère avec l'activité physiologique de la voie choisie. Dans ce cas, la lecture est tout simplement l'absence d'un signal normalement associée à la voie, tels que la mort cellulaire dans le cas de la signalisation apoptotique ou de l'activation de la transcription dans le cas de la signalisation Wnt. En principe, les protéines qui activent une voie spécifique peuvent également être sondés avec ce type de système de dosage. Il ne doit être mis en place différemment, par exemple, en utilisant l'expression inductible d'un si / sh / miRNA contre une protéine de la voie et de tester si la protéine d'intérêt peut sauver la signalisation de la voie. En variante, de petites molécules inhibitrices de protéines spécifiques peuvent être utilisés pour interrompre la transduction du signal dans une voie, puis à vérifier pour trouver la voie de sauvetage par l'expression inductible d'une protéine d'intérêt. Cependant, ce type d'approche expérimentale sera plus difficile que le protocole présenté ci-dessus.

Le choix du gène cible devant être sondé est dans l'essai d'interférence, en principe, simple. Il est préférable de tester autant de protéines dans la voie de signalisation choisi que possible d'affiner l'identification de la protéine du site de l'intérêt de l'interaction avec la voie. Cela devrait être fait de façon itérative, car il est pas toujours possible ou expérimentalement même possible de surveiller tous Interac potentielpartenaires tion en une seule expérience. Par conséquent, il est préférable de d'abord tester plusieurs protéines espacées uniformément sur toute la voie et ensuite d'affiner l'expérience en utilisant les informations obtenues dans le premier tour. Dans les voies de signalisation, de nombreuses protéines sont modifiées après la traduction, soit par une modification covalente, par exemple la phosphorylation ou la sumoylation, ou par un événement de transformation, comme un clivage protéolytique. Par conséquent, la protéine respectif est dans un état-sol ou dans une forme activée. Si possible, il est préférable de tester les deux formes de la protéine pour deux raisons. La première est que la forme activée délivre un signal de sortie plus élevée 31, qui présente un défi plus strictes pour la protéine d'intérêt. Dans notre preuve de principe exemple, la signalisation apoptotique, la caspase 3 est activée par clivage protéolytique et la dimérisation. Cet événement d'activation peut être simulé artificiellement en réorganisant le gène pro-caspase non transformés. La petite sous-unité est placé artificiellementen face de la grande sous-unité et les deux sont reliés par un lieur. Ceci est appelé un «caspase inverse» et représente la forme activée de l'enzyme exprimée 35. Il a été choisi en raison de son degré élevé d'activité. La seconde raison pour sonder la fois l'état fondamental et formes activées d'une protéine de la voie est qu'elle permet de distinguer si la protéine d'intérêt interfère avec l'activation de la protéine cible, ou si elle agit en aval de la protéine dans la voie. Dans le premier cas, la mort des cellules sera inhibée si la forme de l'état fondamental est exprimé, mais pas si la forme activée est présente. Dans le second cas, ni protéines conduira à l'apoptose. Ainsi, en testant les deux formes d'une protéine modifiée améliore la résolution du système analytique.

Le clonage du gène cible dans le vecteur d'expression inductible nécessite plusieurs décisions. Tout d'abord, est l'expression du gène cible se produit seulement de manière transitoire ou est-il préférable que le vecteur est stamment intégré dans le génome de la lignée cellulaire hôte? Si seulement l'expression transitoire est nécessaire, un vecteur simple comme pUHC13-3 24, qui contient un promoteur Tet-dépendante et un site polyA, ou un vecteur bidirectionnel tels que le PBI-2 ou 3 PBI-36, qui couple l'expression du gène de l'intérêt pour l'expression d'un gène rapporteur pour faciliter la surveillance de l'expression du gène cible, sera suffisante. Si une expression stable est préférée, un vecteur tel que pWHE655 33 (figure 3) doit être utilisé. Il contient des isolateurs qui flanquent l'unité d'expression du transgène pour éviter les effets de position au niveau du site d'intégration génomique d'interférer avec l'expression du transgène inductible. Il contient également une liés, mais exprimé de manière indépendante, cassette de résistance à G418 à faciliter la sélection des événements d'intégration du vecteur. Le résultat net de ces modifications est une augmentation du nombre de clones présentant d'excellentes propriétés de régulation 33,37,38. ADNc soiséquences de gènes cibles peuvent être clones dans ce vecteur en utilisant des sites de restriction uniques EcoRI et EcoRV pour 33. Le clonage du vecteur exprimant la caspase-3 inverse d'ADNc a été décrite en détail en référence 33. Le clonage du vecteur exprimant Bax humaine a été réalisée de manière analogue. L'ADNc de bax humain a été amplifié par PCR à partir du plasmide pVenus-Bax 39 utilisant des amorces oligonucléotidiques qui introduisent des sites de restriction pour EcoRI et EcoRV. Après purification du fragment de PCR et restriction avec les deux enzymes, le fragment a été ligaturé avec pWHE655 également restreintes, ce qui donne pWHE655TREtight-Bax. Deuxièmement, ce qui promoteur minimal est le plus approprié pour l'expression du transgène? Le promoteur minimal originale P hCMV * -1 24 affiche une certaine perméabilité spécifique de type de cellule 30, en partie à cause de la présence des éléments de réponse inductible interféron α-fonctionnels 29. Cela a conduit à l'élaboration de seconde génération Tet-dépendantepromoteurs, appelés ΔMtetO, TREtight et SG-TRE, avec un espacement altérée et des séquences entre les éléments tetO et avec différentes séquences promotrices minimales 33,40-42. Ils affichent perméabilité fortement réduite en l'absence de doxycycline. Parmi ces promoteurs deuxième génération, ΔMtetO a le plus faible niveau de l'expression du transgène en présence de doxycycline 33. TREtight médiatise un intermédiaire et SG-TRE le plus haut niveau d'expression du transgène 33. D'autres modifications ont minimisé l'expression de fond du promoteur sensible tétracycline encore plus 43,44. Ainsi, le choix d'un promoteur sensible à la tetracycline peut être effectué en fonction des besoins ou des limitations du transgène respectif.

Indépendamment du type d'approche expérimentale, l'étanchéité de l'expression de la protéine cible est important. Par exemple, l'induction de l'apoptose avec des formes activées de protéines pro-apoptotiques conduit à cellulela mort, même lorsque des quantités minimes de la protéine cible respective sont exprimées 31-33. La stringence requise est obtenue en ajoutant un à la tetracycline transsilencer dépendant du système de régulation 30 conditionnel. Elle assure que la transcription à partir du promoteur inductible est réprimé activement, ce qui est particulièrement important lorsque des transfections transitoires sont réalisées, car ils sont généralement assez qui fuit dans leur expression du transgène 30. Si les voies de signalisation qui ne induisent la mort cellulaire sont sondés, l'exigence d'une réglementation stricte de l'expression du gène cible peut être détendu et systèmes inductibles sans transsilencer pourrait être utilisé alternativement 43,44.

Le système régulateur inductible utilisé pour sonder la voie de signalisation n'a pas à être le système Tet. Son principal avantage est qu'il a été intensivement utilisé dans les cellules de mammifères depuis plus de 20 ans maintenant et qu'il est le plus développé et le meilleur characterized système de contrôle inductible. Néanmoins, il existe au moins 25 autres systèmes de régulation 45,46 conditionnelles qui pourraient être utilisés en variante, ou en plus du système Tet. Deux ou trois systèmes inductibles différents pourraient être utiles à sonder les voies de signalisation convergente ou pour tester la redondance soit du gène cible ou la protéine d'intérêt.

La procédure présentée ici devrait travailler avec les efficacités de transfection qui résultent en un signal de sortie robuste et fiable à partir de la voie de signalisation respective qui est sondé. Du fait que les lignées cellulaires stables expriment la protéine d'intérêt d'une manière homogène (figure 4B), toutes les cellules qui sont transfectées de manière transitoire avec le plasmide inductible exprimant la protéine d'intérêt sont sondés pour l'interférence de la protéine d'intérêt avec la signalisation de la voie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428

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L'application d'un système d'expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire
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Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).

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