Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Применяя INDUCIBLE системы экспрессии для изучения помех бактериальных факторов вирулентности с внутриклеточной сигнализации

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52903
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

Abstract

Методика представлена ​​здесь позволяет проанализировать, на каком шаге целевой белок, или, альтернативно, малую молекулу, взаимодействует с компонентами сигнального пути. Метод основан, с одной стороны, на индуцируемой экспрессии специфического белка, чтобы инициировать событие сигнализации на определенном и заранее определенного этапа в выбранной сигнального каскада. Одновременное выражение, с другой стороны, из представляющего интерес гена, то позволяет исследователю оценить, если активность экспрессированного белка-мишени расположена выше по потоку или ниже по потоку от инициированного событием сигнализации, в зависимости от считывания сигнального пути, который получают. Здесь апоптическая каскад была выбрана в качестве определенного сигнального пути, чтобы продемонстрировать функциональность протокола. Патогенные бактерии, такие как Coxiella burnetii, перемещать эффекторные белки, которые мешают клетка-хозяин смерти индукции в клетке-хозяине, чтобы обеспечить выживаемость бактерий в клетки и способствовать ихраспространение в организме. С. burnetii белок эффектор CAEB эффективно подавляет клетки-хозяина смерть после индукции апоптоза с УФ-света или с стауроспорином. Чтобы сузить при котором шаг CAEB мешает распространения сигнала апоптоза, были выражены временно в доксициклин индуцибельной образом выбранные белки с хорошо охарактеризованной проапоптотического деятельности. Если CAEB действует выше этих белков апоптоза будет беспрепятственно продолжаться. Если CAEB действует ниже, гибель клеток будет запрещено. Испытуемые были выбраны белки Bax, который действует на уровне митохондрии, и каспазы 3, который является основным палач протеазы. CAEB мешает гибели клеток, вызванной выражения Вах, но не каспазы 3 выражения. CAEB, таким образом, взаимодействует с каскадом апоптоза между этими двумя белками.

Introduction

Вирулентность многих грамотрицательных бактериальных патогенов зависит от специализированных систем секреции угнать эукариотических клеток-хозяев. Бактерии используют эти системы секреции вводить бактериальные белки вирулентности (эффекторов) в клетки-хозяина, чтобы модулировать различные клеточные и биохимические деятельности. Изучение эффекторных белков не только при условии, замечательный понимание фундаментальных аспектов принимающих / патогенных взаимодействий, но и в фундаментальной биологии эукариотических клеток 1. Модуляция апоптоза клетки-хозяина, как было показано, является важным механизмом вирулентности в течение многих внутриклеточных патогенов, а также ряд эффекторных белков, модулирующих апоптоз были идентифицированы 2-9. Тем не менее, их точные молекулярные механизмы остаются неизвестными активности во многих случаях.

Апоптоз, форма запрограммированной клеточной смерти, играет важную роль в иммунных реакций на инфекции 10. Два основных пути, ведущие к апоптозу естьбыли определены: таргетинг митохондрий (внутренняя апоптоз) или прямой трансдукции сигнала через гибель клеток рецепторов на мембране (внешняя апоптоза). Внутренняя или митохондрии-опосредованной клеточной смерти путь инициируется внутриклеточных сигналов, и включает в себя активацию Bax и Bak, двух про-апоптотических членов семьи Bcl-2. Это семейство состоит из про- и анти-апоптотических белков регулятора, которые контролируют клеточную гибель 11-14. Активация апоптоза приводит к олигомеризации Bax и Бак с последующей проницаемости митохондриальной наружной мембраны, в результате чего цитохрома C высвобождения в цитоплазму. Цитохром С релиз инициирует активацию эффекторных каспаз 3 и 7 через активацию каспазы 9 в апоптосома 15. Это приводит к протеолиза отдельных подложек, которые, среди прочего, приводит к воздействию фосфатидилсерина на поверхности клеток 16 и освобождает выделенный ДНКазы, что фрагменты чromatin 17,18.

Для того чтобы определить, где в каскаде апоптоза индивидуальный белок эффектор мешает, индуцируемый система экспрессии был использован 19. Регулирующие системы условного выражения трансгенов было бесценным инструментом в анализе функции белка в клетке или его значение для ткани, органа и развития организма, а также при инициации, прогрессировании и поддержание болезни 20-23. Как правило, индуцируемые системы управления, такие как системы Tet 24, используемое здесь, образуют искусственное транскрипционной единицы (рисунок 1). Один компонент представляет собой искусственно сконструированную транскрипционный фактор, называемый TTA (тетрациклин-зависимой транскрипции активатор), образованный слиянием бактериальной транскрипции репрессором TetR 25 до млекопитающих домена белка, который опосредует активацию транскрипции или глушителей 24,26. Второй компонент представляет собой гибридпромоутер, называется TRE (тетрациклин проблематику элемент), состоящий из эукариотической минимального промотора, содержащего, по меньшей мере, ТАТА-бокс и сайт инициации транскрипции, присоединился к нескольким повторами родственного ДНК-связывающего сайта для тетр, Teto 24,25. Третьим компонентом является естественным лигандом TetR, тетрациклина или одного из его производных, таких как anhydrotetracycline или доксициклин 25. При лиганда дополнение к культуральной среде, TetR теряет сродство к Teto и отделяется от TRE. В результате транскрипции гена-мишени отменена. Экспрессии трансгена могут, таким образом, строго контролироваться в времени и зависимым от дозы образом как в культуре клеток и животных 20,23,24. С TTA, трансгенная экспрессия происходит конститутивно, за исключением того, в присутствии тетрациклина. Это может быть недостатком в исследовании цитотоксических или онкогенных белков, поскольку тетрациклин сначала должен быть удален из системы, перед тем трансгенной expressioп происходит и эффекты белка-мишени на клетке можно контролировать. Это может быть трудоемким и не всегда бывает полным, особенно в трансгенных животных 27. Для решения это ограничение, TetR мутант с обратной ответ на присутствие доксициклина был использован для создания нового фактора транскрипции, rtTA (обратный TTA) 28. Это связывается только с TRE и, одновременно, активирует транскрипцию в присутствии доксициклина. Остаточный неплотности системы, т.е.., Трансген выражение в отсутствии TRE-связанного фактора транскрипции, происходящий либо (I) от эффектов положения в геномной сайта интеграции, (II) от самого TRE 29, или (III) от не -специфический связывающий ТТА / rtTA 28, был адресован введением дополнительного транскрипции глушитель, называют TTS (тетрациклин-зависимой транскрипции глушитель) 30 к системе. Он образует двойную сеть регулятор вместе с rtTA (рисунок 1).При отсутствии доксициклин, ТЦ связывается с TRE и активно выключается оставшуюся транскрипции. В присутствии доксициклина, TTS диссоциирует от TRE и rtTA связывает одновременно индукции экспрессии гена-мишени. Этот дополнительный слой жесткости часто необходимо, чтобы выразить высокоактивные цитотоксические белки 31-34.

Используя этот жестко контролируется система двойного регулятора, апоптическая каскад может быть начато при определенной стадии, позволяющей анализ может ли данный белок эффектор мешать индукции апоптоза. Этот метод не может быть использован только для изучения антиапоптозную активности бактериальных эффекторных белков, но и для индуцируемой экспрессии про-апоптотических или токсичных белков или для рассечения помех других сигнальных путей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Генерирование стабильных клеточных линий, экспрессирующих белок, представляющий интерес

  1. Подготовка СМИ, добавив тепла инактивированной ФТС и 1% пенициллина / стрептомицина в продаже Dulbecco's модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением Glutamax-I, пирувата и 4,5 г / л D-глюкозы.
  2. Выращивают клетки HEK293 в среде при 37 ° С в 5% СО 2. Суб-культивировать клетки каждый третий день. Удалить СМИ и ресуспендирования клеток в 15 мл свежей среды. Внесите 1 мл в новом 75 см 2 клеточной культуры колбу и добавить 14 мл средства массовой информации.
  3. Анализ количества клеток с помощью гемоцитометра.
  4. Семенной клетки HEK293 в 6-луночный планшет при плотности 2 × 10 5 клеток на лунку и инкубируют в течение 24 ч.
  5. Для трансфекции используют протокол предоставленную изготовителем реагента для трансфекции. Трансфекции клеток с pEGFP-C2 или pEGFP-C2-CAEB помощью реагента для трансфекции. Перед использованием нагреть до трансфекции КГНЛОР и СМИ, необходимые для РТ. Использование 3: соотношение реагента для трансфекции 1 с ДНК.
    1. Более подробно, пипетки 1,5 мкл реагента для трансфекции непосредственно в 50 мкл бессывороточной DMEM среде. Для образования комплекса, пипетки 0,5 мкг ДНК, кодирующей GFP или GFP-CAEB трансфекции реагента, содержащего смеси и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
    2. Трансфекции клеток путем добавления реакционной смеси в каплям образом и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 24 ч.
  6. Добавить 1 мг / мл генетицина При выборе GFP-положительных клонов при 37 ° С в 5% СО 2.
  7. Через 6 дней изолировать отдельные клетки с помощью проточной цитометрии сортировки в 96-луночный планшет, несущего среду и HEK293 супернатант в соотношении 1: 1. Генерация HEK293 супернатант из культивируемых клеток НЕК293 сливной что центрифугировали в течение 15 мин при 4966 х г.
  8. На следующий день, заменить культуральной среды на среду, содержащую 1,50 мг / мл генетицина. Изменить СМИ один раз в неделю. Если клетки образуют сливающийся монослой, передать их в 24-луночный планшет. Суб-клетки культивируют два раза в неделю в соотношении 1: 5 в среде, содержащей 1,5 мг / мл генетицина. Наконец, анализ процент GFP-положительных клеток с помощью иммуноблот-анализа и проточной цитометрии.

2. Анализ стабильных клеточных линий, иммуноблот-анализа

  1. Удалить супернатант и мыть прилипшие клетки сразу с теплой PBS. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 2x буфера Лэммли образца, тепла в течение 5 мин при 95 ° С и хранить при -20 ° С.
  2. Загрузить около 4 х 10 4 клеток на образец на 12% SDS-PAGE гель. Кроме того, нагрузка 6 мкл коммерческой белка лестницы как маркер молекулярной массы. Запуск гели в системе гель-электрофореза при постоянном напряжении 180 В в течение 45-60 мин с 1x Laemmli подвижном буфере.
  3. BLOT белков на мембраны ПВДФ (размер пор. 045 мкм) при постоянном напряжении 16 В в течение 60 мин с использованием транс-Клякса SD полусухое Cell Transfer.
  4. Блок мембраны в 10 мл 5% обезжиренного сухого молока в PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Развести 4 мкл анти-GFP антитела в 4 мл MPT и инкубировать мембраны O / N при 4 ° С.
  6. Выполнение три стадии промывки 10 мин с 10 мл PBS / 0,05% Tween 20.
  7. Инкубируйте мембраны с 0,8 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела в 4 мл MPT.
  8. После 1 ч инкубации при комнатной температуре, промыть мембран три раза PBS / 0,05% Tween 20 (как описано в 2.6) и обнаруживать активность пероксидазы хрена с коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Применить стандартное оборудование для проявки для визуализации белковых полос.

3. Анализ клеток с использованием цитометра потока.

  1. Ресуспендируют клеток в PBS. Используйте HEK293 клетки в качестве отрицательного контроля, чтобы настроить вперед подкожноAtter (FSC) и боковое рассеивание (SSC), так что клетки находятся на шкале. Нарисуйте ворота на живые клетки путем исключения клеток дублеты, агрегаты и клеточных обломков.
  2. Отрегулируйте ФЭУ (ФЭУ) усиление, так что неокрашенные клетки находятся на дальнем левом углу гистограммы для канала FL1 (аргонового лазера 488 нм).
  3. Для анализа интенсивности флуоресценции HEK293-GFP и HEK293-GFP-CAEB клеток открыть гистограмму канала FL1 и приобрести 10000 событий на закрытом населения.
  4. Анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа коммерческие FACS.

4. Трансфекция Стабильный клеточной линии с индуцируемой вектор экспрессии системы

  1. Семенной НЕК293, стабильно экспрессирующих GFP или GFP-CAEB в 12-луночный планшет при плотности 1 х 10 5 клеток / лунку.
  2. 19 ч после посева, со-трансфекции клеток с регулятором плазмиды и плазмиды ответ или кодирующей Вах или активированный каспазы 3.
    1. Со-трансфекции клеток HEK293 стабильные100 нг pWHE125-P регулятора плазмиды (рис 2) и 100 нг плазмиды реагирования pWHE655-hBax или pWHE655-revCasp3 (Рисунок 3) и 0,4 мкл полиэтиленимина.
    2. Подготовка ДНК и полиэтиленимином трансфекции реагента каждый в 75 мкл Opti-MEM среде и инкубировать точно 5 мин при комнатной температуре. Для образования комплекса, инкубируют обе смеси вместе в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Добавьте полиэтиленимин / ДНК раствор по каплям к клеткам и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2.

5. Индукция апоптоза

  1. 5 ч после трансфекции, индуцируют экспрессию про-апоптотических белков путем добавления 1 мкг / мл доксициклина в культуральную среду. Инкубируйте клетки в течение 18 ч при 37 ° С в 5% СО 2.

6. Анализ клетка-хозяин апоптоза иммуноблот-анализа

  1. Осмотрите клетки до чarvesting под световым микроскопом, чтобы проверить индукции клеточной смерти. Апоптотических клеток в детектируемый в присутствии апоптозных тел, окружающих клетки умирает.
  2. Удалить супернатант и мыть прилипшие клетки сразу с теплой PBS. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 2x буфера Лэммли образца, тепла в течение 5 мин при 95 ° С и хранить при -20 ° С.
  3. Загрузить около 4 х 10 4 клеток на образец на 12% SDS-PAGE гель. Кроме того, нагрузка 6 мкл коммерческой белка лестницы как маркер молекулярной массы. Запуск гели в системе гель-электрофореза при постоянном напряжении 180 В в течение 45-60 мин с 1x Laemmli подвижном буфере.
  4. BLOT белков на мембраны ПВДФ (размер пор 0,45 мкм) при постоянном напряжении 16 В в течение 60 мин с использованием транс-Клякса SD полусухое Cell Transfer.
  5. Блок мембраны в 10 мл 5% обезжиренного сухого молока в PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  6. Развести 4 μл анти-расщепляется поли АДФ-рибозы полимеразы (PARP) антитела в 4 мл и инкубируют MPT O / N при 4 ° С.
  7. Выполнение три стадии промывки 10 мин с 10 мл PBS / 0,05% Tween 20.
  8. Инкубируйте мембраны с 0,8 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела разводят в 4 мл MPT.
  9. После 1 ч инкубации при комнатной температуре, промыть мембран три раза PBS / 0,05% Tween 20 (как описано в 6.7) и обнаруживать активность пероксидазы хрена с коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Применить стандартное оборудование для проявки для визуализации белковых полос.
  10. Удалить связанных антител на 30-минутной инкубации при комнатной температуре 7 мл вестерн-блот инверсионной буфера.
  11. После трех промывок PBS / 0,05% Tween 20 (как описано в 6.7), зондировать мембраны с 4 мкл анти-актина антител в 4 мл MPT O / N при 4 ° С.
  12. После трех стадий промывки с MPT (как описано в 6.7), инкубировать мембраны с 0,8 мкл хоrseradish конъюгированного с пероксидазой вторичных антител разводили в 4 мл MPT.
  13. После 1 ч инкубации при комнатной температуре, промыть мембран три раза PBS / 0,05% Tween 20 (как описано в 6.7, и обнаружить активность пероксидазы хрена с коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Применение стандартного оборудования для проявки для визуализации белковых полос.
    Примечание: Все стадии инкубации проводили на шейкере в течение указанного времени и температуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Во-первых, были созданы клеточные линии НЕК293, стабильно экспрессирующие белок, представляющий интерес (CAEB) в качестве белка GFP-синтеза. В качестве контроля также были получены клеточные линии НЕК293, стабильно экспрессирующие GFP. Выражение GFP и GFP-CAEB была проверена с помощью анализа иммуноблот. Представитель иммуноблот (4А) демонстрирует стабильный и ясно обнаруживаемый выражение GFP и GFP-CAEB. Тем не менее, этот анализ не может определить все клетки выразить ли GFP или GFP-CAEB. Таким образом, стабильно трансфицированные клеточные линии HEK293 были также проанализированы с помощью проточной цитометрии. Как показано на фиг.4В, более 90% клеток в обеих клеточных линий выражена GFP. Таким образом, эти стабильные клеточные линии могут быть использованы для дальнейшего анализа функции CAEB. На следующем этапе, Антиапоптозный активность CAEB анализировали с использованием антитела против расщепленного PARP с иммуноблот-анализа. Протеолитического расщепления PARP ядерного инактивирует репарации ДНК активность и является типичным маркером TERMINAL стадиях апоптоза. Расщепление PARP не обнаруживается в HEK293-GFP или HEK293-GFP-CAEB клеток, демонстрируя, что ни выражение GFP, ни GFP-CAEB токсичен для клеток. Однако, когда клетки обрабатывали стауроспорина, мощным индуктором апоптоза внутренней, расщепление PARP была обнаружена (рисунок 5). Важно отметить, что HEK293-GFP-клетки обладают CAEB уменьшается расщепление PARP, что указывает на антиапоптозную активность Coxiella burnetii типа IV система секреции белка эффекторной CAEB 7.

Для анализа, при котором шаг CAEB мешает пути апоптоза, работал система Тет-On. В деталях, HEK293-GFP или НЕК293-GFP-CAEB клетки трансфицировали плазмидой регулятор конструктивно выражать доксициклин управлением двойного репрессора / настройка активатора (рисунок 2) и кодировку pTRE ответ плазмиды либо полную длину человеческой Bax или активированную форму человек каспазы 3, называется revCasp 3 (Рисунок 3). Эта система жестко регулируется, как показано отсутствием PARP расщепления под неиндуцирующей условия (рис 6). Добавление доксициклина в трансфицированных клетках в результате экспрессии Bax или revCasp 3. Если CAEB мешает пути апоптоза вниз по течению от Bax, то апоптическая сигнал, генерируемый путем экспрессии и последующей активации Bax должны быть заблокированы путем экспрессии CAEB. Действительно, НЕК293, стабильно экспрессирующих GFP-CAEB глубоко ингибируют индукции апоптоза доксициклина управлением Вах выражения, в то время как НЕК293-GFP клетки отображается очевидную PARP расщепления. Этот результат показывает, что CAEB блоки индукции апоптоза ниже Вах активации. Далее, было проанализировано, можно ли CAEB мешать активации каспазы 3 - поздний событие в пути апоптоза. НЕК293-GFP клетки, а также НЕК293-GFP-CAEB клетки, выставляется ППА расщепления (Рисунок 6), указывая, что когда-то эффекторной каспазы 3, Activованные, CAEB не может предотвратить апоптоз возникновения. Взятые вместе, эти данные показывают, что CAEB действует между Bax и каспазы 3 активации.

Фигура 1
Рисунок 1. Схема обзор тетрациклиновой регулятивной системы. Система Тет-On состоит из двух различных плазмид, нормативных и реагирования плазмид. Нормативно-плазмиды кодирует Тет-отзывчивый transsilencer (TTS; кружком) и Тет-отзывчивый обратный трансактиватор (rtTA, открытый круг). Оба белка экспрессирован под контролем сильного конститутивного, фактор элонгации 1-альфа промотор (Р EF-1a). ТТС и rtTA собой химерные транскрипционные факторы, состоящие из эукариотической транскрипции регуляторной области (глушителем или активатором, соответственно) и бактериальные тетрациклина репрессор (TetR). TetR посредником связывание ДНК до семи тет (Teto) последовательности в плазмиде отклика. Teto расположен выше по течению от индуцируемого промотора цитомегаловируса минимальной (Р CMV), вместе образующие Tet-реагирующий элемент (TRE). Под неактивирующую условия, ТЦ связан с TRE предотвращения выражение. После того доксициклина (Dox; заполнено алмаз), rtTA взаимодействует с Dox приводит к конформационных изменений и активации. Активированный rtTA заменяет TTS на плазмиды отклика, что позволяет транскрипцию соответствующих целевых генов Bax и каспазы 3, что приводит к индукции апоптоза и гибели клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема обзор нормативной плазмиды pWHE125. Элементы важное значение для распространения в бактерийрии, в том числе инициации репликации (Ori PBR) и антибиотик кластера резистентности против ампициллин (Amp R), и для экспрессии Tet-transregulators, таких как сильный конститутивный, немедленного раннего промотора / энхансера человеческого цитомегаловируса (P / E ЦМВ), внутренний сайт связывания рибосомы от полиомиелита-вируса (PV-IRES) и поли-сайт из обезьяньего вируса 40 (SV40 поли) отображаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Схематический обзор плазмиды отклика. Элементы важное значение для распространения бактерий, в том числе инициации репликации (Ori PBR) и устойчивости к антибиотику кассеты (Amp R), и индуцибельной экспрессии у эукариот, таких как трансгена Expressiна кассете с Tet-зависимой минимального промотора TREtight (Р TREtight), представляющего интерес гена человеческого Bax (hBax) и сайта поли из обезьяний вирус 40 (SV40 поли), изображены. Кассета экспрессии трансгенов в окружении тандемных повторов прямых двух экземплярах куриного HS4 изолятор основной последовательности (основной HS4). Кроме того, сопротивление G418 кассета, состоящая из мышиного фосфоглицераткиназы 1 промоутера (Р mPGK), неомицин ген устойчивости (G418 R) и человеческого тимидинкиназы сайт поли (ТК поли) присутствует. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этот показатель.

Рисунок 4
Рисунок 4. НЕК293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB стабильно выразить зеленые флуоресцентные белки. () Всего-клеточные лизаты HEK293-GFP иНЕК293-GFP-CAEB клетки иммуноблоттингу для GFP, чтобы показать стабильную экспрессию. (B), представитель цитометрии потока (FACS) анализ HEK293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB клеток показано, чтобы продемонстрировать интенсивность выражения GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Влияние на экспрессию GFP-CAEB на стауроспорином-индуцированного апоптоза. HEK293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB клетки обрабатывали 4 мкМ стауроспорина в течение 6 ч, чтобы вызвать внутреннюю апоптоз. Апоптоз анализируют методом расщепленного PARP анализа иммуноблоттинга. ППА расщепление уменьшается в НЕК293-GFP-CAEB клеток по сравнению с НЕК293-GFP клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версиюиз этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Использование системы Титон, чтобы сузить точку действия CAEB. () Апоптоз индуцируется экспрессия Вах в HEK293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB клеток. Апоптоз анализируют методом расщепленного PARP анализа иммуноблоттинга. PARP расщепления была снижена в НЕК293-GFP-CAEB клеток в сравнении с HEK293-GFP клеток. (Б) Апоптоз индуцировали экспрессию revCasp 3 в HEK293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB клеток. Апоптоз анализируют методом расщепленного PARP анализа иммуноблоттинга. ППА расщепления сравнима в НЕК293-GFP-CAEB и НЕК293-GFP клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Многие патогенные бактерии гавани секреции систем выделяют или перемещать бактериальных эффекторных белков в клетке-хозяине. Эти эффекторные белки обладают способностью модулировать процессы и пути в клетке-хозяине, что позволяет бактериям выжить и воспроизвести в соответствии с их внутриклеточной ниши. Понимание биохимических деятельности и молекулярные механизмы эффекторных белков поможет лучшему пониманию патогенности и может помочь в разработке новых терапевтических средств для борьбы с болезнью. Кроме того, как эффекторные белки часто оказывают свои функции, имитируя клетки-хозяина деятельности, они также могут быть использованы, чтобы узнать о биологии эукариотических клеток 1. Однако, изучая биохимическую активность одного белка эффекторной доказала быть сложными по нескольким причинам: 1) функциональной избыточности среди эффекторных белков, 2) временное регулирование вовлечения эффекторных белков, и 3) эфБелок тор работает в контексте с другой эффекторной белка, препятствуя его функции. Таким образом, активность белка эффекторной обычно рассматривается сверхэкспрессией исследований. К сожалению, использование переходных сверхэкспрессии белка эффекторной же имеет несколько недостатков. Таким образом, только одна ячейка анализа пробы могут быть использованы и активность белка эффекторной не могут быть проанализированы, если активность белка эффекторной зависит от активности другой эффекторной белка. Чтобы преодолеть по меньшей мере, первый недостаток, стабильные клеточные линии могут быть использованы. В случае экспрессии белка эффекторной токсичен для клеток, это не подходит. В этом случае, стабильные и индуцируемые клеточные линии могут быть установлены с помощью подобной системы, как мы описали здесь временной экспрессии индуцирующих апоптоз белков (смотри ниже). Тем не менее, наши результаты (Рисунок 5) показывают, что выражение CAEB защищает клетки от апоптоза и, следовательно, нетоксичны. Есть несколько вариантов в рассечения, на каком шаге в апоптоза каскада CAEB препятствует индукции апоптоза. Одна из возможностей состоит в определении клетка-хозяин партнером связывания CAEB. Тем не менее, это очень сложно, и определение связывания партнера, возможно, не помогают объяснить точку действием CAEB пределах каскада апоптоза. Другая возможность заключается в использовании различных индукторов апоптоза, но ингибирует CAEB индукции апоптоза с помощью двух различных индукторов апоптоза, УФ-света и стауроспорина 7, указывает, что этот подход также может не привести к идентификации точки действием CAEB. Другая возможность в сужении точку действием CAEB, который эксплуатируется здесь, состоит в использовании системы, в которой сигнальный каскад апоптоза может быть вызвана в определенных шагов.

В случае экспрессии в бактериальной эффекторных белка, который был выбран, как интерес белок уже мешает клеточной физиологии, ее expression также могут быть помещены под контролем индуцируемого системы экспрессии, например, таких, как той, которая используется, чтобы выразить целевой белок. Затем выражение как интересующего белка и белка-мишени будут одновременно индуцированного когда лиганд добавляют к культуре клеток позволяет исследователю контролировать клеток для дифференциальных эффектов на клеточной физиологии и сигнализации выход системы.

Очевидно, экспрессирующих белок, представляющий интерес, и пытается определить свою точку действия в определенном внутриклеточном пути от индуцируемой экспрессии белков, выбранных пути работает лучше всего, если интересующий белок препятствует физиологической активности выбранного пути. В этом случае считывание просто отсутствие сигнала, обычно связанные с пути, такие как клеточной гибели в случае апоптоза сигнализации или активации транскрипции в случае сигнализации Wnt. В принципе, белки, активирующие специфический путь также может быть зондируют этом тип системы анализа. Он имеет только, чтобы быть установлен по-разному, например, с помощью индуцируемой экспрессии в SI / SH / миРНК против белка пути и тестирования, если интересующий белок может спасти сигнального пути. Кроме того, низкомолекулярные ингибиторы специфических белков может быть использован, чтобы прервать передачу сигнала в пути, а затем для проверки затрагивающего пути спасения от индуцируемой экспрессии интересующего белка. Тем не менее, такой подход будет экспериментально более сложной, чем в протоколе, представленном выше.

Выбор гена-мишени должны быть исследованы в интерференционной анализа, в принципе, проста. Лучше всего, чтобы проверить, как многие из белков, в выбранном сигнального пути, как это возможно для тонкой настройки идентификации белка сайта долей участия взаимодействия с пути. Это должно быть сделано в итерационном моды, потому что это не всегда осуществимо экспериментально или даже можно контролировать все потенциальные Interacпартнеры Тион в одном эксперименте. Поэтому, лучше всего сначала проверить несколько белков расположенных равномерно по всей пути, а затем результаты эксперимента, используя информацию, полученную в первом туре. В сигнальных путей, многие белки модифицированы посттрансляционно, либо посредством ковалентной модификации, такие как фосфорилирование или SUMOylation, или путем обработки события, такие, как протеолитического расщепления. Следовательно, соответствующего белка либо в основном состоянии или в активированной форме. Если это возможно, то лучше, чтобы проверить обе формы белка по двум причинам. Во-первых, активированная форма обеспечивает более высокую выходной сигнал 31, который представляет собой более строгие требования для белка, представляющего интерес. В нашем доказательстве-о-принцип, например, апоптоза сигнализации, каспазы 3 активируется путем протеолитического расщепления и димеризации. Это событие активации могут быть смоделированы искусственно, перестраивая необработанный ген про-каспазы. Малой субъединицы искусственно помещеныв передней части большой субъединицы, и обе соединены с помощью линкера. Это называется "обратный" каспазы и представляет собой активированную форму фермента при экспрессии 35. Он был выбран из-за его более высокой степени активности. Вторая причина для зондирования как основного состояния и активированных форм белка путь является потому что это позволяет различать, если интересующий белок препятствует активации белка-мишени, или если он действует ниже белка в пути. В первом случае, гибель клеток будет запрещено, если земля-государственная форма выражается, но если активированная форма присутствует. Во втором случае, ни белка приведет к апоптозу. Таким образом, тестирование обе формы модифицированного белка улучшает разрешение аналитической системы.

Клонирование гена-мишени в индуцируемого вектора экспрессии, требуется несколько решений. Во-первых, должен выражение гена-мишени происходить только временно, или это лучше, если вектор stably интегрированы в геном клетки-хозяина линии? Если только переменной экспрессии требуется, простой вектор, такой как pUHC13-3 24, который содержит Tet-зависимый промотор и сайт полиА или двунаправленного вектора например PBI-2 или PBI-3 36, который соединен экспрессии гена интерес к экспрессии гена-репортера для облегчения мониторинга выражения гена-мишени, будет достаточно. Если стабильная экспрессия является предпочтительной, вектор, такой как pWHE655 33 (рис 3) должны быть использованы. Он содержит изоляторы, обрамляющих блок экспрессии трансгенов для предотвращения позиции эффекты в геномной сайта интеграции от вмешательства индуцируемой экспрессии трансгенов. Он также содержит связаны, но независимо друг от друга высказали, сопротивления кассету для G418, чтобы облегчить выбор вектора интеграционных мероприятий. Конечным результатом этих модификаций является увеличение числа клонов с отличными регулирующими свойствами 33,37,38. кДНК себепоследствиями генов-мишеней, могут быть клонированы в этот вектор с помощью уникальные сайты рестрикции для EcoRI и EcoRV 33. Клонирование вектора, экспрессирующего обратный каспазы-3 кДНК была подробно описана в ссылке 33. Клонирование вектора, экспрессирующего человеческий Вах проводили аналогично. Bax кДНК человеческого амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды pVenus-Bax 39 с использованием олигонуклеотидных праймеров, которые вводят сайты рестрикции для EcoRI и EcoRV. После очистки ПЦР-фрагмента и ограничение с двух ферментов, фрагмент лигировали с аналогичным ограниченным pWHE655, получая pWHE655TREtight-Bax. Во-вторых, что минимальный промотор является наиболее подходящим для экспрессии трансгена? Оригинальный минимальный промотор P HCMV * -1 24 дисплеи некоторые типа клеток конкретных неплотности 30, отчасти из-за наличия функциональных интерферона α-элементов индуцируемый реагирования 29. Это привело к разработке второго поколения Tet-зависимойпромоутеры, называется ΔMtetO, TREtight и SG-TRE, с измененной расстояние и последовательностей между элементами Teto и с различными минимальный промотор последовательностей 33,40-42. Они показывают значительно снижается неплотности в отсутствие доксициклина. Среди этих промоторов второго поколения, ΔMtetO имеет самый низкий уровень экспрессии трансгена в присутствии доксициклина 33. TREtight посредником промежуточный и SG-TRE высокий уровень трансгенной экспрессии 33. Дальнейшие модификации к минимуму фона выражение тетрациклину промоутер еще более 43,44. Таким образом, выбор тетрациклинового реагирующих промотора может быть сделан в соответствии с требованиями или ограничениями соответствующего трансгена.

Независимо от типа экспериментальный подход, герметичность экспрессии целевого белка имеет важное значение. Например, индукция апоптоза с активированными формами про-апоптотических белков приводит к клеткесмерть, даже когда только минимальные суммы соответствующего белка-мишени выражаются 31-33. Требуемое жесткость достигается за счет добавления к тетрациклину-зависимой transsilencer к условной системы регулирования 30. Это гарантирует, что транскрипции от индуцируемого промотора активно подавляется, что особенно важно при временной трансфекции выполняются, так как они, как правило, весьма вытекающей их трансгенной экспрессии 30. Если сигнальные пути, которые не вызывают гибель клеток исследуются, требование строгой регуляции экспрессии гена-мишени может быть расслабленной и индуцируемые системы без transsilencer могут быть использованы в качестве альтернативы 43,44.

Индуцируемый система регулирования используется для исследования сигнальный путь не должен быть система Тет. Его основным преимуществом является то, что он интенсивно используется в клетках млекопитающих в течение более чем 20 лет, и что это наиболее развитый и наиболее чaracterized индуцируемый система управления. Тем не менее, есть по крайней мере 25 других условных системы регулирования 45,46, что может быть использованы в качестве альтернативы или в дополнение к системе Tet. Два или три различные индуцируемые системы могут быть полезны при зондировании сходящуюся сигнальных путей или для тестирования избыточность либо гена-мишени или белка, представляющего интерес.

Процедура, представленная здесь должны работать с эффективностью трансфекции, которые приводят к устойчивой и надежной выходного сигнала от соответствующего сигнального пути, который зондируют. Поскольку стабильные клеточные линии экспрессируют белок, представляющий интерес в гомогенной форме (фиг.4В), все клетки, которые трансфицированы с индуцируемой плазмиды, экспрессирующей белок, представляющий интерес зондировании помех от интересующего белка с сигнального пути.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Tags

Инфекция выпуск 100 апоптоз Вах каспазы 3, Эффектор белок индуцируемой экспрессии стабильной клеточной линии система Tet Тип IV Секреция системы
Применяя INDUCIBLE системы экспрессии для изучения помех бактериальных факторов вирулентности с внутриклеточной сигнализации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck,… More

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter