Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påføre en induserbar Expression System for å studere forstyrrelser av bakteriell virulensfaktorer med intracellulære signal

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52903
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

Abstract

Teknikken som presenteres her gjør det mulig å analysere ved hvilket trinn et målprotein, eller alternativt et lite molekyl, reagerer med komponentene i en signalveien. Metoden er basert, på den ene side, på den induserbare ekspresjonen av et spesifikt protein for å initiere en signaleringshendelse i en definert og forhåndsbestemt trinn i den valgte signalkaskade. Samtidig ekspresjon, på den annen side, av genet av interesse og deretter lar undersøkeren å vurdere om aktiviteten til det uttrykte proteinet målet befinner seg oppstrøms eller nedstrøms for den initierte signaleringshendelse, avhengig av avlesning av signalveien som er oppnådd. Her ble apoptotisk kaskade valgt som en definert signalveien for å demonstrere protokollen funksjonalitet. Patogene bakterier, for eksempel Coxiella burnetii, translocate effektor proteiner som forstyrrer verts celledød induksjon i vertscellen for å sikre overlevelse av bakterier i cellen, og for å fremme deresformidling i organismen. C. burnetii effektorproteinet CaeB hemmer effektivt verts celledød etter induksjon av apoptose med UV-lys eller med staurosporin. For å begrense hvor trinn CaeB interfererer med forplantningen av den apoptotiske signal, ble utvalgte proteiner med godt karakterisert pro-apoptotiske aktivitet uttrykt forbigående i en doksycyklin-induserbar måte. Hvis CaeB opptrer oppstrøms for disse proteiner, skal apoptose fortsette uhindret. Hvis CaeB fungerer nedstrøms, vil celledød bli hemmet. Test proteinene valgte var Bax, som virker på nivået av mitokondriene, og caspase 3, som er den store skarp protease. CaeB forstyrrer celledød indusert av Bax uttrykk, men ikke av caspase 3 uttrykk. CaeB således virker sammen med apoptotiske kaskade mellom disse to proteiner.

Introduction

Virulens av mange Gram-negative bakterielle patogener avhenger spesialiserte sekresjon systemer for å kapre eukaryote vertsceller. Bakterier bruke disse sekresjons-systemer for å injisere bakteriell virulens proteiner (Effektor) inn i vertscellen for å modulere en rekke biokjemiske og cellulære aktiviteter. Studiet av effektor proteiner har ikke bare gitt bemerkelsesverdig innsikt i grunnleggende aspekter av verts / patogen interaksjoner, men også inn i grunnleggende biologi av eukaryote celler 1. Modulering av vertscellen apoptose er blitt vist å være en viktig mekanisme for virulens mange intracellulære patogener, og et antall effektor proteiner moduler apoptose er blitt identifisert 2-9. Men deres nøyaktige molekylære mekanismer aktivitet forblir unnvikende i mange tilfeller.

Apoptose, en form for programmert celledød, spiller en viktig rolle i immunresponser mot infeksjoner 10. To hovedveier som fører til apoptose hablitt identifisert: rettet mot mitokondrier (intrinsic apoptose) eller direkte transduksjon av signalet via celledød reseptorer på plasmamembranen (extrinsic apoptose). Den iboende eller mitokondrier-mediert celledød reaksjonsvei er utløst av intracellulære signaler og involverer aktivering av Bax og Bak, to pro-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-familien. Denne familien består av pro- og anti-apoptotiske regulator proteiner som kontrollerer celledød 11-14. Aktivering av apoptose fører til oligomerisering av Bax og Bak fulgt av etterfølgende permeabilization Mitokondriell ytre membran, noe som resulterer i cytokrom C slippes ut i cytoplasmaet. Cytokrom C frigivelse initierer aktivering av effektorcellene kaspasene 3 og 7 gjennom aktiveringen av caspase 9 i apoptosome 15. Dette fører til proteolyse av utvalgte substrater som blant annet resulterer i eksponering av fosfatidylserin på celleoverflaten 16 og frigjør en dedikert DNase som fragmenter chromatin 17,18.

For å bestemme hvor innenfor den apoptotiske kaskade et individ effektorproteinet griper ble en induserbar ekspresjon system som anvendes 19. Regulatoriske systemer for betinget ekspresjon av transgener har vært et uvurderlig redskap for å analysere en proteinets funksjon i cellen eller dens betydning for vev, organ og organismen utvikling, så vel som under initiering, progresjon og opprettholdelse av sykdommer 20-23. Typisk induserbare systemer, som for eksempel Tet systemet 24 anvendt her, danner en kunstig transkripsjonsenhet (se figur 1). En komponent er en kunstig konstruerte transkripsjonsfaktor kalt TTA (tetracyklin-avhengig transkripsjon aktivator), dannet ved fusjon av bakterietranskripsjons tetR repressor 25 til et pattedyr-protein domene som medierer transkripsjonen aktivering eller lyddemping 24,26. Den andre komponenten er en hybridpromoter, betegnet TRE (tetracyklin-responsive element), som består av en eukaryot minimal promoter, inneholdende minst en TATA-boks og en transkripsjons-initieringssetet, sluttet til flere gjentakelser av beslektet DNA-bindingssetet for Tetr, Teto 24,25. Den tredje komponenten er den naturlige ligand av tetR, tetracyklin eller et av dets derivater, slik som anhydrotetracycline eller doksycyklin 25. Ved ligand tilsetning til kulturmediet, Tetr mister sin affinitet for teto og dissosierer fra TRE. Som et resultat, blir transkripsjon av målgenet avskaffet. Transgen ekspresjon kan således bli kontrollert på en tids- og doseavhengig måte i både cellekulturer og i dyr 20,23,24. Med tta, oppstår transgen ekspresjon konstitutivt, bortsett fra i nærvær av et tetracyklin. Dette kan være en ulempe i studiet av cytotoksiske eller onkogene proteiner fordi tetracyklin først må fjernes fra systemet, før transgene expressioN inntreffer og målproteinet effekter på celle kan overvåkes. Dette kan være tidkrevende og ikke alltid er fullstendig, særlig i transgene dyr 27. For å løse denne begrensningen, ble en mutant med tetra en invers reaksjon på tilstedeværelsen av doksycyklin som brukes til å generere en ny transkripsjonsfaktor, rtTA (omvendt TTA) 28. Det binder seg bare til TRE og, samtidig, aktiverer transkripsjon i nærvær av doksycyklin. Residual leakiness av systemet, det vil si., Transgene ekspresjon i fravær av TRE-bundet transkripsjonsfaktor, som stammer enten (i) fra posisjon effekter på et genomisk integreringssete, (ii) fra TRE selv 29, eller (iii) fra non -spesifikke binding av TTA / rtTA 28, ble løst ved å innføre en ytterligere transkripsjonen lyddemper, betegnet TTS (tetracyklin-avhengige transkripsjons-lyddemperen) 30 til systemet. Den danner en dobbel regulator nettverk sammen med rtTA (se figur 1).I fravær av doksycyklin, binder TTS til TRE og aktivt slår seg eventuelle gjenværende transkripsjon. I nærvær av doksycyklin, dissosierer TTS fra TRE og rtTA binder samtidig indusering av ekspresjon av målgenet. Dette ytterligere lag av stringens er ofte nødvendig for å uttrykke meget aktive cytotoksiske proteiner 31-34.

Ved hjelp av denne kontrollert dobbelt-regulator system, kan den apoptotiske kaskade initieres ved en definert trinn som tillater analyse av hvorvidt den gitte effektorproteinet kan forstyrre apoptose-induksjon. Denne metoden kan ikke bare brukes til å undersøke anti-apoptotiske aktivitet av bakterie effektor proteiner, men også for den induserbare ekspresjon av pro-apoptotiske eller toksiske proteiner, eller for å dissekere interferens med andre signalveier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produksjon av stabile cellelinjer som uttrykker proteinet av interesse

  1. Forbered media ved å legge varmeinaktivert FCS og 1% Penicillin / streptomycin til kommersielt tilgjengelige Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med Glutamax-I, pyruvat, og 4,5 g / l D-glukose.
  2. Dyrke HEK293 celler i media ved 37 ° C i 5% CO 2. Under dyrke celler hver tredje dag. Fjern media og resuspender cellene i 15 ml ferske medie. Pipette 1 ml inn i en ny 75 cm 2 cellekultur kolbe og tilsett 14 ml media.
  3. Analyser celle nummer ved hjelp av en hemocytometer.
  4. Seed HEK293 celler i en 6-brønns plate ved en densitet på 2 x 10 5 celler per brønn og inkuber i 24 timer.
  5. For transfeksjon bruke protokollen gitt av produsenten av transfeksjon reagens. Transfektere celler med pEGFP-C2 eller pEGFP-C2-CaeB bruker transfeksjon reagens. Før bruk, varm opp transfeksjonen Reagent og media som kreves for å RT. Bruke et 3: 1 forhold av transfeksjon reagens til DNA.
    1. I detalj, pipette 1,5 pl av transfeksjon reagens direkte inn i 50 ul serumfritt DMEM-medium. For kompleksdannelse, pipetter 0,5 pg av DNA som koder GFP eller GFP-CaeB til transfeksjon reagens-holdige blandingen og inkuberes i 15 min ved RT.
    2. Transfektere celler ved å tilsette reaksjonsblandingen på en dråpevis måte, og inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 i 24 timer.
  6. Tilsett 1 mg / ml Geneticin for valg av GFP-positive kloner ved 37 ° C i 5% CO2.
  7. Etter 6 dager, isolere enkeltceller ved strømningscytometri sortering i en 96-brønns plate husing medium og HEK293 supernatant i et 1: 1 forhold. Generer HEK293 supernatant fra dyrkede konfluent HEK293-celler som ble sentrifugert i 15 minutter ved 4966 x g.
  8. På den påfølgende dagen, erstatte kultur medium med medium som inneholder 1,50; mg / ml geneticin. Endre media en gang i uken. Hvis cellene danner et konfluent monolag, overføre dem til en 24-brønns plate. Under dyrke cellene to ganger i uken i et forhold på 1: 5 i media inneholdende 1,5 mg / ml geneticin. Til slutt, analysere prosentandelen av GFP-positive celler ved immunoblotanalyse og flowcytometri.

2. Analyse av stabile cellelinjer ved immunoblotanalyse

  1. Fjern supernatanten og vask det adherte celler en gang med varm PBS. Cellene resuspenderes i 100 ul av 2x Laemmli-prøvebuffer, varme i 5 min ved 95 ° C og oppbevares ved -20 ° C.
  2. Legge ca. 4 x 10 4 celler pr prøven på en 12% SDS-PAGE gel. I tillegg last 6 ul av en kommersiell protein stige som en molekylvekt markør. Kjør geler i en gelelektroforese systemet under en konstant spenning på 180 V i 45-60 min med 1 x Laemmli-buffer.
  3. Blot proteiner bort på PVDF membraner (pore størrelse fra 0.45 um) ved en konstant spenning på 16 V i 60 minutter ved hjelp av en Trans-Blot SD halvtørr Transfer Cell.
  4. Blokk membraner i 10 ml 5% fettfri tørrmelk i PBS / 0,05% Tween 20 (TAT) i 1 time ved RT.
  5. Fortynn 4 ul av anti-GFP-antistoff i 4 ml MPT og Inkuber membraner O / N ved 4 ° C.
  6. Utføre tre 10 min vasketrinn med 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
  7. Inkuber membraner med 0,8 ul pepperrotperoksidase-konjugert sekundært antistoff i 4 ml MPT.
  8. Etter 1 time inkubering ved RT, vaske membranene tre ganger med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrevet i 2.6) og detektere pepperrot peroksidase-aktivitet med et kommersielt kit ifølge produsentens protokoll. Gjelder standard utstyr for film utvikling å visualisere proteinbånd.

3. Analyser Cells Bruke en Flowcytometer.

  1. Resuspender celler i PBS. Bruk HEK293 celler som negativ kontroll for å justere frem scAtter (FSC) og side scatter (SSC) slik at cellene er på skalaen. Tegn en gate på levende celler ved å utelukke celle dubletter, aggregater og celleavfall.
  2. Juster fotomultiplikatorrøret (PMT) gevinst slik at de ufargede cellene er helt til venstre i histogrammet for FL1 kanal (488 nm argon laser).
  3. Å analysere fluorescens intensitet HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB celler åpne histogram av FL1-kanalen og skaffe 10.000 hendelser på gated befolkningen.
  4. Analysere dataene ved hjelp av kommersielle FACS analyse programvare.

4. Transfeksjon av stabile cellelinje med induserbar ekspresionsvektor System

  1. Seed HEK293-celler som stabilt uttrykker GFP eller GFP-CaeB i en 12-brønns plate ved en tetthet på 1 x 10 5 celler / brønn.
  2. 19 timer etter seeding, co-transfektere cellene med regulator plasmid og svar plasmid enten koding Bax eller aktivert caspase 3.
    1. Co-transfisere stabile HEK293 cellenemed 100 ng av pWHE125 P-regulator plasmid (figur 2), og 100 ng av svar plasmidene pWHE655-hBax eller pWHE655-revCasp3 (figur 3), og 0,4 ul av polyetylenimin.
    2. Klargjør DNA og polyetylenimin transfeksjon reagens hver i 75 mL av Opti-MEM medium og inkuberes i nøyaktig 5 min ved RT. For kompleksdannelse, inkuber begge blandinger sammen i 15 min ved RT.
  3. Tilsett polyetylenimin / DNA-oppløsningen dråpevis til cellene og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2.

5. induksjon av apoptose

  1. 5 timer etter transfeksjon, induserer ekspresjon av de pro-apoptotiske proteiner ved tilsetning av 1 ug / ml doksycyklin til kulturmediet. Inkuber cellene i 18 timer ved 37 ° C i 5% CO2.

6. Analyse av vertscelle Apoptose ved immunoblotanalyse

  1. Inspisere cellene før harvesting under lysmikroskop for å se etter celledød induksjon. Apoptotiske celler er detekterbar ved tilstedeværelse av apoptotiske legemer som omgir cellen dør.
  2. Fjern supernatanten og vask det adherte celler en gang med varm PBS. Cellene resuspenderes i 100 ul av 2x Laemmli-prøvebuffer, varme i 5 min ved 95 ° C og oppbevares ved -20 ° C.
  3. Legge ca. 4 x 10 4 celler pr prøven på en 12% SDS-PAGE gel. I tillegg last 6 ul av en kommersiell protein stige som en molekylvekt markør. Kjør geler i en gelelektroforese systemet under en konstant spenning på 180 V i 45-60 min med 1 x Laemmli-buffer.
  4. Blot proteinene skje på PVDF-membraner (porestørrelse 0,45 um) ved en konstant spenning på 16 V i 60 minutter ved hjelp av en Trans-Blot SD halvtørr overføring celle.
  5. Blokk membraner i 10 ml 5% fettfri tørrmelk i PBS / 0,05% Tween 20 (TAT) i 1 time ved RT.
  6. Fortynne 4 μl av anti-spaltet poly-ADP-ribose polymerase (PARP) antistoff i 4 ml MPT og inkuberes O / N ved 4 ° C.
  7. Utføre tre 10 min vasketrinn med 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
  8. Inkuber membraner med 0,8 mL pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer fortynnet i 4 ml MPT.
  9. Etter 1 time inkubering ved RT, vaske membranene tre ganger med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrevet i 6.7) og detektere pepperrot peroksidase-aktivitet med et kommersielt sett i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Gjelder standard utstyr for film utvikling å visualisere proteinbånd.
  10. Fjern bundet antistoff med 30 minutters inkubering ved romtemperatur med 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
  11. Etter tre vaskinger med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrevet i 6.7), sondere membraner med 4 pl anti-actin-antistoff i 4 ml MPT O / N ved 4 ° C.
  12. Etter tre vasketrinn med MPT (som beskrevet i 6.7), inkuber membranene med 0,8 mL av horseradish peroksidase-konjugert sekundært antistoff fortynnet i 4 ml MPT.
  13. Etter 1 time inkubering ved RT, vaske membranene tre ganger med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrevet i 6.7 og detektere pepperrot peroksidase-aktivitet med et kommersielt kit ifølge produsentens protokoll. Påfør vanlig utstyr for utvikling av filmen for å visualisere proteinbånd.
    Merk: Alle inkubasjonstider trinn ble utført på en plate rister i den angitte tid og temperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Først ble det etablert HEK293-cellelinjer som stabilt uttrykker proteinet av interesse (CaeB) som et GFP-fusjonsprotein. Som en kontroll, ble HEK293-cellelinjer som stabilt uttrykker GFP også generert. Uttrykk for GFP og GFP-CaeB ble verifisert av immunoblotanalyse. Representanten immunoblot (Figur 4A) viser stabilt og klart påviselig uttrykk for GFP og GFP-CaeB. Imidlertid kan denne analysen ikke avgjøre om alle cellene uttrykker GFP eller GFP-CaeB. Derfor ble stabilt transfekterte HEK293-cellelinjer også analysert ved hjelp av strømningscytometri. Som vist i figur 4B, over 90% av cellene i begge cellelinjene uttrykte GFP. Således kan disse stabile cellelinjer bli brukt for ytterligere å analysere funksjonen av CaeB. I det neste trinn, ble den anti-apoptotiske aktivitet av CaeB analysert ved immunblotanalyse ved anvendelse av et antistoff mot spaltet PARP. Proteolytisk spaltning av kjerne PARP inaktiverer DNA-reparasjon aktivitet, og er en typisk markør for Termielle stadier av apoptose. Spalting av PARP er ikke påvist i HEK293-GFP eller HEK293-GFP-CaeB celler, noe som viser at ingen ekspresjon av GFP, eller noen av GFP-CaeB er toksisk for cellene. Imidlertid, når cellene ble behandlet med staurosporin, en potent induser av indre apoptose, spalting av PARP ble påvist (figur 5). Viktigere, utviser HEK293-GFP-celler CaeB redusert spalting av PARP, indikerer anti-apoptotiske aktivitet av Coxiella burnetii type IV sekresjon system effektorproteinet CaeB 7.

Å analysere hvor trinn CaeB forstyrrer apoptotiske sti ble Tet-On systemet benyttes. I detalj ble HEK293-GFP eller HEK293-GFP-CaeB-celler transfektert med et plasmid som regulator konstitutivt uttrykker en doksycyklin-kontrollert dobbelt-repressor / aktivator-oppsett (figur 2), og et plasmid som koder for pTRE respons enten full lengde human Bax eller aktivert form av menneskelig caspase 3, betegnes revCasp 3 (Figur 3). Dette system er strengt regulert, som demonstrert ved mangelen på PARP spaltning under ikke-induserende betingelser (figur 6). Tilsetning av doksycyklin til de transfekterte celler resulterte i ekspresjon av Bax eller revCasp 3. Hvis CaeB forstyrrer den apoptotiske reaksjonsvei nedstrøms for Bax, da den apoptotiske signalet generert av uttrykk og etterfølgende aktivering av Bax skal blokkeres ved CaeB uttrykk. Faktisk HEK293 celler som stabilt uttrykker GFP-CaeB dypt hemme apoptose induksjon av doksycyklin styrt Bax uttrykk, mens HEK293-GFP celler vises tydelig PARP cleavage. Dette resultatet indikerer at CaeB blokkerer apoptoseinduksjon nedstrøms Bax aktivering. Deretter ble det analysert om CaeB kan forstyrre kaspase 3 aktiveringen - en sen hendelse i apoptotiske reaksjonsvei. HEK293-GFP-celler, så vel som HEK293-GFP-CaeB celler, oppviser PARP spaltningsseter (figur 6), som indikerer at når effektoren kaspase 3 Activrerte, CaeB kan ikke hindre apoptose oppstår. Samlet utgjør disse data viser at CaeB virker mellom Bax og caspase 3 aktivering.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk oversikt over tetracyklin regelverket. The Tet-On system er sammensatt av to forskjellige plasmider, regulatoriske og respons plasmider. Det regulatoriske plasmid koder Tet-responsive transsilencer (TTS, fylt sirkel) og Tet-responsive omvendt transaktivator (rtTA, åpen sirkel). Begge proteiner blir konstitutivt uttrykt under kontroll av den sterke konstitutive elongeringsfaktor-1 alfa-promoter (P EF-1a). TTS og rtTA er kimære transkripsjonsfaktorer som består av en eukaryot transcriptional regulatoriske domenet (lyddemper eller aktivator, henholdsvis) og en bakteriell tetracyklin repressor (Tetr). TetR formidler DNA binding til syv tet (teto) sekvenser på responsen plasmidet. teto befinner seg oppstrøms for den induserbare minimal cytomegalovirus promoter (P CMV), sammen danner Tet-responsive element (TRE). Under ikke-induserende forhold, er TTS bundet til TRE hindre uttrykk. Etter tilsetning av doksycyklin (Dox, fylt diamant), samhandler med Dox fører til konformasjonsendringer og aktivering rtTA. Aktivert rtTA erstatter TTS på responsen plasmid, slik transkripsjon av respektive målgener Bax og caspase 3, og dermed fører til apoptose induksjon og celledød. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk oversikt over det regulatoriske plasmid pWHE125. Elements viktig for forplantning i bacterier, inkludert et replikasjonsorigo (ori pBR) og en antibiotisk resistens kassett mot ampicillin (Amp R), og for ekspresjon av tetA-transregulators, slik som sterk, konstitutiv umiddelbar tidlig promoter / enhancer av det humane Cytomegalovirus (P / E hCMV), en intern ribosombindingssete fra polio-virus (PV-IRES) og en polyA-site fra Simian virus 40 (SV40 polyA) vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Skjematisk oversikt over responsen plasmidet. Elementer avgjørende for formering i bakterier, inkludert et replikasjonsorigo (ori pBR) og et antibiotisk resistens kassett (Amp R), og for induserbar ekspresjon i eukaryoter, slik som den transgene expressipå kassetten med Tet-avhengige minimal promoter TREtight (P TREtight), genet av interesse human Bax (hBax) og en polyA området fra Simian virus 40 (SV40 polyA), er avbildet. Transgenet Ekspresjonskassetten er flankert av tandem direkte gjentakelser av to eksemplarer av kylling HS4 isolatorkjerne sekvens (HS4 kjerne). I tillegg er en G418 motstand kassett som består av et murine fosfoglyceratkinase en promoter (P mPGK), er en neomycinresistensgenet (G418 R) og en menneskelig thymidinkinase polyA hotellet (TK polyA) til stede. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB stabilt uttrykke grønne fluorescerende proteiner. (A) Hel-cellelysater av HEK293-GFP ogHEK293-GFP-CaeB celler ble immunoblottet for GFP vise stabil uttrykk. (B) Representant flowcytometri (FACS) analyse av HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB celler er vist å demonstrere intensiteten av GFP uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Effekt av ekspresjon av GFP-CaeB på staurosporin-indusert apoptose. HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB-celler ble behandlet med 4 um staurosporin i 6 timer for å indusere indre apoptose. Apoptose ble analysert ved spaltede PARP immunoblotanalyse. PARP cleavage ble redusert i HEK293-GFP-CaeB celler i forhold til HEK293-GFP celler. Klikk her for å se en større versjonav denne figur.

Figur 6
Figur 6. Bruk av Teton system for å innskrenke det punktet av handlingen av CaeB. (A) Apoptose ble indusert av uttrykket av Bax i HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB celler. Apoptose ble analysert ved spaltede PARP immunoblotanalyse. PARP-spaltning ble redusert i HEK293-GFP-CaeB celler i forhold til HEK293-GFP-celler. (B) Apoptose indusert ved ekspresjon av revCasp 3 i HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB celler. Apoptose ble analysert ved spaltede PARP immunoblotanalyse. PARP cleavage var sammenlignbare i HEK293-GFP-CaeB og HEK293-GFP celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange patogene bakterier havn sekresjon systemer for å utskille eller translocate bakterielle effektor proteiner inn i vertscellen. Disse effektor proteiner har evnen til å modulere prosesser og veier i vertscellen, slik at bakterien å overleve og replikere innenfor deres respektive intracellulære nisje. Forstå biokjemiske aktiviteter og de molekylære mekanismer av effektor proteiner vil bidra til en bedre forståelse av sykdomsfremkallende og kan bidra til å utvikle nye terapeutiske verktøy for å bekjempe sykdommen. Videre, som effektorcellene proteiner ofte utøve sin funksjon ved å etterligne vertscelle aktiviteter, de kan også brukes til å lære mer om biologi eukaryote celler 1. Imidlertid studere den biokjemiske aktiviteten til en enkelt effektor protein har vist seg å være komplisert av flere grunner: 1) funksjonelt redundans mellom effektor proteiner, 2) det tidsmessige regulering av inngrep mellom effektor proteiner, og 3) den effektor protein som arbeider i forbindelse med en annen effektor protein, interferere med dens funksjon. Derfor er aktiviteten av en effektor-protein som vanligvis studeres ved overekspresjon studier. Dessverre har bruken av transient overekspresjon av effektor-proteinet har også flere ulemper. Således kan bare enkelt celle analyse analyser anvendes, og aktiviteten av effektoren protein kan ikke analyseres dersom aktiviteten av effektoren proteinet avhenger av aktiviteten til en annen effektor protein. For å overvinne i det minste den første ulempe, kan stabile cellelinjer bli brukt. Ved ekspresjon av effektorproteinet er toksisk for cellen, er det ikke egnet. I dette scenariet kan stabile og induserbare cellelinjer etableres ved hjelp av et tilsvarende system som vi beskriver her for forbigående uttrykk for apoptose-induserende proteiner (se nedenfor). Men resultatene (figur 5) viser at ekspresjonen av CaeB beskytter cellene fra gjennomgår apoptose, og er derfor ikkegiftig. Det finnes noen alternativer i dissekere på hvilket trinn i apoptotiske kaskade CaeB forstyrrer apoptoseinduksjon. En mulighet er å bestemme vertscellebindingspartner av CaeB. Men dette er veldig utfordrende og identifisering av den bindende partner kan ikke bidra til å forklare poenget med handlingen av CaeB innenfor apoptotiske kaskade. En annen mulighet er å bruke forskjellige apoptose-induserende, men CaeB inhiberer apoptose-induksjon ved to forskjellige apoptose-induserende, UV-lys og staurosporin 7, som indikerer at denne tilnærming kan heller ikke føre til identifisering av det punkt av virkningen av CaeB. En annen mulighet i å begrense nedover punktet for virkningen av CaeB, som ble benyttet her, er å bruke et system hvor signalkaskade apoptose kan induseres ved definerte trinn.

Ved ekspresjon av det bakterielle effektoren protein som ble valgt som protein av interesse allerede griper inn i cellefysiologi, dets EXPREssion kan også bli satt under kontroll av en induserbar ekspresjon system, for eksempel slik som den som brukes for å uttrykke målproteinet. Deretter vil ekspresjon av både protein av interesse og målprotein bli samtidig induseres når liganden tilsettes til cellekulturen slik at undersøkeren å overvåke cellene for forskjellige effekter på cellefysiologi og signaleringssystem utgang.

Klart, uttrykker et protein av interesse, og prøver å identifisere dens angrepspunkt i en bestemt bane ved intracellulær induserbar ekspresjon av utvalgte pathway proteiner fungerer best dersom proteinet av interesse forstyrrer den fysiologiske aktiviteten til den valgte bane. I dette tilfelle er bare avlesning mangelen på et signal som normalt forbindes med veien, slik som celledød i tilfelle av apoptotiske signalering eller aktivering av transkripsjon i tilfelle av Wnt signalering. I prinsippet kan proteiner som aktiverer en bestemt bane også bli probet med dette type av analysesystemet. Den har bare til å bli satt opp på en annen måte, for eksempel ved hjelp av induserbar ekspresjon av et Si / SH / miRNA mot en sti protein og testing dersom proteinet av interesse kan redde pathway signalering. Alternativt kan lavmolekylære inhibitorer av spesifikke proteiner bli brukt til å avbryte signaloverføringen innenfor en vei, og deretter for å kontrollere bane redning av induserbar ekspresjon av et protein av interesse. Imidlertid vil en slik tilnærming være eksperimentelt mer utfordrende enn det protokoll er presentert ovenfor.

Utvelgelsen av målgenet som skal probet i interferens analysen er i prinsippet enkel. Det er best å teste så mange av proteinene i den valgte signalveien som mulig for å finjustere identifikasjon av proteinet av interesse er området for interaksjon med veien. Dette bør gjøres i en iterativ måte, fordi det er ikke alltid eksperimentelt gjennomførbart eller mulig å overvåke alle potensielle intesjons partnere i et enkelt eksperiment. Derfor er det best å først teste flere proteiner fordelt jevnt langs hele veien, og deretter å avgrense eksperimentet ved hjelp av informasjonen han fikk i første runde. I signalveiene, er mange proteiner modifisert post-translasjonelt, enten ved en kovalent modifikasjon, slik som fosforylering eller sumoylation, eller ved en behandling hendelse, for eksempel proteolytisk spalting. Følgelig er det respektive protein enten i en bakke-stat eller i en aktivert form. Hvis det er mulig, er det best å teste begge former av proteinet av to grunner. Den ene er at den aktiverte formen gir et høyere utgangssignal 31, som viser en mer stringent utfordring for proteinet av interesse. I vår proof-of-prinsippet eksempel apoptotisk signalering, blir caspase 3 aktivert ved proteolytisk spaltning og dimerisering. Denne aktiveringen hendelsen kan simuleres kunstig ved å omorganisere ubehandlet pro-caspase genet. Den lille subenheten er kunstig plassertforan den store subenhet og begge er sammen med en linker. Dette betegnes som en "reverse caspase" og representerer den aktiverte form av enzymet når den uttrykkes 35. Det ble valgt på grunn av sin høyere grad av aktivitet. Den andre grunnen for undersøkelser både grunntilstanden og aktiverte former av protein er en vei fordi den gjør det mulig å skille dersom proteinet av interesse forstyrrer aktiveringen av målproteinet, eller hvis det opptrer nedstrøms av proteinet i reaksjonsveien. I det første tilfellet vil celledød bli hemmet hvis grunntilstanden formen blir uttrykt, men ikke dersom den aktiverte formen er til stede. I det andre tilfellet vil verken protein fører til apoptose. Således teste de to former av et modifisert protein som forbedrer oppløsningen av den analytiske system.

Kloning målgenet i den induserbare ekspresjonsvektoren krever flere beslutninger. Først skal ekspresjon av målgenet forekomme bare forbigående eller er det bedre dersom vektoren er sroter integrert i genomet i vertscellelinjen? Hvis bare forbigående ekspresjon er nødvendig, en enkel vektor, slik som pUHC13-3 24, som inneholder en Tet-avhengige promotor og en polyA område, eller en toveis vektor slik som PBI-2 eller PBI-3 36, som kobler ekspresjon av genet av interesse for ekspresjonen av et reportergen for enklere overvåkning av målet genekspresjon, vil være tilstrekkelig. Hvis stabil ekspresjon er foretrukket, bør en vektor slik som pWHE655 33 (figur 3) benyttes. Den inneholder isolatorer som flankerer den transgene uttrykk enheten for å forhindre posisjon effekter på genomisk integrering området forstyrrer induserbar transgene uttrykk. Den inneholder også en koblet, men uavhengig uttrykt motstand kassett for G418 å forenkle valg av vektor integrering hendelser. Nettoresultatet av disse modifikasjonene er en økning i antall kloner med gode reguleringsegenskaper 33,37,38. cDNA sekvensene av målet gener kan klones inn i denne vektoren ved hjelp av unike restriksjonsseter for EcoRI og EcoRV 33. Kloning av vektoren som uttrykker den omvendte Caspase-3-cDNA ble beskrevet i detalj med henvisning 33. Kloning av vektoren som uttrykker humant Bax ble utført analogt. Det humane Bax cDNA ble amplifisert ved PCR fra plasmid pVenus-Bax 39 ved hjelp av oligonukleotid-primere som innfører restriksjonsseter for EcoRI og EcoRV. Etter rensing av PCR-fragmentet og med de to restriksjonsenzymer ble fragmentet ligert med likeledes fattig pWHE655, hvilket ga pWHE655TREtight-Bax. Sekund, noe som minimal promoter er mest hensiktsmessig for transgene uttrykk? Den opprinnelige minimal promoter P hCMV * -1 24 viser en celletype-spesifikk leakiness 30, delvis på grunn av tilstedeværelsen av funksjonelle interferon-α induserbar responselementer 29. Dette har ført til utvikling av andre generasjons Tet-avhengigearrangører, betegnes ΔMtetO, TREtight og SG-TRE, med endret avstand og sekvenser mellom teto elementer og med ulike minimale promotersekvenser 33,40-42. De viser sterkt redusert leakiness i fravær av doksycyklin. Blant disse andre generasjons promotorer, har ΔMtetO den laveste transgenet ekspresjonsnivået i nærvær av 33 doksycyklin. TREtight formidler et mellom og SG-TRE det høyeste nivået av transgene uttrykk 33. Ytterligere modifikasjoner er minimert bakgrunn ekspresjon av tetracyklin responsive promoter enda mer 43,44. Således kan valget av et tetracyklin-responsive promoter bli gjort i henhold til kravene, eller begrensninger av de respektive transgenet.

Uavhengig av typen av eksperimentell tilnærming, er tetthet av ekspresjon av målproteinet viktig. For eksempel, induksjon av apoptose med aktiverte former av pro-apoptotiske proteiner fører til celledød, selv når det bare minimale mengder av det respektive mål-proteinet er uttrykt 31-33. Den nødvendige stringens oppnås ved å legge en tetracyklin avhengig transsilencer til betinget regulatorisk system 30. Det sikrer at transkripsjon fra den induserbare promoteren er aktivt trykt, noe som er spesielt viktig når transiente transfeksjoner er utført, da de er vanligvis heller lekk i deres transgene uttrykk 30. Hvis signalveier som ikke induserer celledød er undersøkt, kan kravet om strengere regulering av target genuttrykk være avslappet og induserbare systemer uten transsilencer kunne brukes alternativt 43,44.

Det induserbare regulatoriske system som benyttes til å undersøke signalveien behøver ikke å være det Tet-systemet. Dens hovedfordel er at det har blitt intensivt brukt i pattedyrceller for mer enn 20 år nå, og at det er den mest utviklede og beste characterized induserbare kontrollsystem. Ikke desto mindre er det minst 25 andre betinget reguleringssystemer 45,46 som kan anvendes alternativt, eller i tillegg til det Tet-systemet. To eller tre forskjellige induserbare systemer kan være nyttige i sentret konvergerende signalveier eller for testing av redundans av enten målgenet eller proteinet av interesse.

Prosedyren som presenteres her skal arbeide med transfeksjonseffektivitet som resulterer i en robust og pålitelig utgangssignal fra den respektive signalveien som blir undersøkt. Fordi de stabile cellelinjer uttrykker proteinet av interesse i en homogen måte (figur 4B), er alle celler som er forbigående transfektert med den induserbare plasmid som uttrykker proteinet av interesse probet for innblanding av proteinet av interesse med pathway signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Tags

Infeksjon apoptose Bax caspase 3, Doxycycline Effector protein induserbar uttrykk stabil cellelinje Tet system Type IV Sekresjon System
Påføre en induserbar Expression System for å studere forstyrrelser av bakteriell virulensfaktorer med intracellulære signal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck,… More

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter