Abstract
De hier gepresenteerde techniek maakt het mogelijk om te analyseren welke stap een doeleiwit, of als alternatief een klein molecuul, een interactie aangaat met de componenten van een signaleringsroute. De werkwijze berust enerzijds op de induceerbare expressie van een specifiek eiwit aan een signalering gebeurtenis op een bepaalde en vooraf bepaalde stap in het geselecteerde signaalcascade te initiëren. Gelijktijdige expressie, anderzijds, van het gen van belang dan kan de onderzoeker om te beoordelen of de activiteit van het doeleiwit tot expressie stroomopwaarts of stroomafwaarts ligt van de signalering geïnitieerde gebeurtenis, afhankelijk van het uitlezen van de signaalroute die wordt verkregen. Hier werd de apoptotische cascade geselecteerd als een gedefinieerde signaleringsroute protocol functionaliteit te demonstreren. Pathogenen, zoals Coxiella burnetii, transloceren effector eiwitten die interfereren met menselijke celdood inductie in de gastheercel om bacteriële overleven in de cel en het bevorderen van hunverspreiding in het organisme. De C. burnetii effector eiwit CAEB effectief remt gastheercel dood na inductie van apoptose met UV-licht of met staurosporine. Om een beperking van op welke stap CAEB interfereert met de verspreiding van het apoptotische signaal, werden geselecteerd eiwitten met een goed gekarakteriseerde pro-apoptotische activiteit tijdelijk in een doxycycline-induceerbare manier uitgedrukt. Als CAEB handelingen stroomopwaarts van deze eiwitten apoptose hinder ondervinden. Als CAEB handelt downstream, zal celdood worden geremd. De testeiwitten geselecteerd waren Bax, die optreedt ter hoogte van de mitochondria en caspase 3, dat het belangrijkste uitvoerder protease. CAEB verstoort celdood geïnduceerd door Bax expressie, maar niet caspase 3 expressie. CAEB dus samenwerkt met de apoptotische cascade tussen deze twee eiwitten.
Introduction
De virulentie van vele Gram-negatieve bacteriële pathogenen is afhankelijk van gespecialiseerde secretie systemen om eukaryotische gastheercellen kapen. Bacteriën gebruiken dit secretiesystemen bacteriële virulentie eiwitten (effectoren) in de gastheercel injecteren van verschillende cellulaire en biochemische activiteiten te moduleren. De studie van effector eiwitten heeft niet alleen verstrekt opmerkelijk inzicht in de fundamentele aspecten van gastheer / pathogeen interacties, maar ook in de fundamentele biologie van eukaryote cellen 1. Modulatie van gastheercel apoptose is aangetoond dat een belangrijke virulentie mechanisme voor vele intracellulaire pathogenen en een aantal effector eiwitten moduleren van apoptose geïdentificeerd 2-9. Echter, de precieze moleculaire mechanisme ter blijven ongrijpbaar in veel gevallen.
Apoptose is een vorm van geprogrammeerde celdood, speelt een belangrijke rol bij de immuunrespons op infectie 10. Twee belangrijke routes die leiden tot apoptosegeïdentificeerd: gericht op de mitochondria (intrinsieke apoptose) of directe transductie van het signaal via celdood receptoren in het plasmamembraan (extrinsieke apoptose). De intrinsieke of mitochondriën gemedieerde celdood wordt veroorzaakt door intracellulaire signalen en omvat de activering van Bax en Bak, twee pro-apoptotische leden van de Bcl-2 familie. Deze familie is samengesteld uit pro- en anti-apoptotische regulator eiwitten die celdood 11-14 regelen. Activering van apoptose leidt tot oligomerisatie van Bax en Bak gevolgd door achtereenvolgende permeabilisatie van het mitochondriale buitenste membraan, waardoor cytochroom C introductie in het cytoplasma. Cytochroom C afgifte initieert activering van de effector caspasen 3 en 7 tot activatie van caspase 9 in de apoptosoom 15. Dit leidt tot proteolyse van geselecteerde substraten die onder andere resulteert in de blootstelling van fosfatidylserine aan het celoppervlak 16 en maakt een speciaal DNase die ch fragmentenromatin 17,18.
Om te bepalen waar in de apoptotische cascade individuele effector eiwit interfereert, een induceerbaar expressiesysteem werd toegepast 19. Regulerende systemen voor voorwaardelijke expressie van transgenen hebben een waardevol hulpmiddel bij het analyseren van de functie van een eiwit in de cel of het belang ervan voor weefsel, orgaan en organisme ontwikkeling, evenals tijdens initiatie, progressie en het onderhoud van de ziekte 20-23 geweest. Gewoonlijk induceerbare systemen, zoals het Tet-systeem 24 hier toegepast, vormen een kunstmatige transcriptie-eenheid (zie figuur 1). Eén component is een kunstmatig ontwikkelde transcriptiefactor genaamd tTA (tetracycline-afhankelijke transcriptie activator), gevormd door fusie van de bacteriële transcriptie-repressor TetR 25 aan een zoogdierpatiënt eiwitdomein die transcriptionele activatie of silencing 24,26 bemiddelt. De tweede component is een hybridepromoter, aangeduid als TRE (tetracycline-responsief element), bestaande uit een eukaryotische minimale promoter, die ten minste een TATA-box en een transcriptie-initiatieplaats, verbonden met meerdere herhalingen van de cognate-DNA bindingsplaats voor TetR, tetO 24,25. De derde component is het natuurlijke ligand van TetR, tetracycline of een van zijn derivaten, zoals anhydrotetracycline en doxycycline 25. Na ligand toevoeging aan het kweekmedium, TetR verliest zijn affiniteit voor tetO en dissocieert van het TRE. Daardoor wordt transcriptie van het doelgen opgeheven. Transgene expressie kan derhalve worden strak gecontroleerd in een tijds- en dosisafhankelijke manier in zowel celkweek als bij dieren 20,23,24. Met tTA, transgenexpressie treedt constitutief, behalve bij aanwezigheid van een tetracycline. Dit kan een nadeel in de studie van cytotoxische of oncogene eiwitten omdat tetracycline moet eerst uit het systeem worden verwijderd, voordat transgene expression optreedt en het doeleiwit effecten op de cel kan worden gecontroleerd. Dit kan tijdrovend en niet altijd volledig, vooral in transgene dieren 27. Om deze beperking te pakken, een TetR mutant met een inverse reactie op de aanwezigheid van doxycycline werd gebruikt om een nieuwe transcriptiefactor genereren rtTA (reverse tTA) 28. Het bindt alleen aan de TRE en, tegelijkertijd, transcriptie activeert in aanwezigheid van doxycycline. Residuele lekkages van het systeem, dwz., Transgene expressie in de afwezigheid van TRE-gebonden transcriptiefactor, van hetzij (i) van positie-effecten op genomische integratieplaats, (ii) vanaf het TRE 29 zelf, of (iii) uit niet -specifieke binding van tTA / rtTA 28, werd door de opneming van een extra transcriptiesilencerdomein, genaamd TTS (tetracycline-afhankelijke transcriptionele geluiddemper) 30 aan het systeem. Het vormt een dubbele regulator vergeaeld rtTA (zie figuur 1).Bij afwezigheid van doxycycline, tts bindt aan TRE en actief wordt uitgeschakeld resterende transcriptie. In de aanwezigheid van doxycycline, tts dissocieert van TRE en rtTA bindt gelijktijdig induceren van expressie van het doelwitgen. Deze extra laag stringentie moet vaak zeer actieve cytotoxische eiwitten 31-34 expressie.
Met deze strak dual-regulator systeem kan de apoptotische cascade bij een bepaalde stap waarbij wordt onderzocht of de gegeven effector eiwit kunnen interfereren met apoptose-inductie worden gestart. Deze werkwijze kan niet alleen worden gebruikt om de anti-apoptotische activiteit van bacteriële effector eiwitten te bestuderen, maar ook voor de induceerbare expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten of ontleden interferentie met andere signaalwegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het genereren van stabiele cellijnen die het beoogde eiwit
- Bereid media door het toevoegen van warmte geïnactiveerd FCS en 1% penicilline / streptomycine commercieel verkrijgbaar Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met GlutaMAX-I, pyruvaat, en 4,5 g / l D-glucose.
- Ontwikkel HEK293 cellen in medium bij 37 ° C in 5% CO 2. Sub-kweken cellen elke derde dag. Verwijder het medium en resuspendeer de cellen in 15 ml vers medium. Pipetteer 1 ml in een nieuwe 75 cm 2 celkweek kolf en voeg 14 ml media.
- Analyseer het aantal cellen met een hemocytometer.
- Seed HEK293 cellen in een 6-wells plaat met een dichtheid van 2 x 10 5 cellen per putje en incubeer 24 uur.
- Voor transfectie gebruiken protocol van de fabrikant van het transfectie reagens. Transfecteren van cellen met pEGFP-C2 of pEGFP-C2-CAEB met de transfectie-reagens. Voor gebruik warmen de transfectie Reagent en de vereiste RT media. Met een 3: 1 verhouding van transfectiereagens tot DNA.
- In detail Pipetteer 1,5 ui transfectie reagens direct in 50 gl serumvrij DMEM medium. Bij complexvorming, pipet 0,5 ug DNA dat codeert GFP of GFP-CAEB de transfectie-reagens dat mengsel en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Transfecteren cellen door toevoeging van het reactiemengsel in een druppelsgewijze wijze en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Voeg 1 mg / ml geneticine voor selectie van GFP-positieve klonen bij 37 ° C in 5% CO 2.
- Na 6 dagen isoleren enkele cellen door flow cytometrie sorteren in een 96-putjesplaat herbergen medium en HEK293 supernatant in een 1: 1 ratio. Genereer HEK293 supernatant uit gekweekte confluente HEK293 cellen die gedurende 15 minuten bij 4966 x g gecentrifugeerd.
- Op de volgende dag vervangen door kweekmedium met medium dat 1,50; mg / ml geneticine. Verander een keer per week media. Indien de cellen vormen confluente monolaag, overbrengen naar een 24-wells plaat. Sub-kweken cellen tweemaal per week in een verhouding van 1: 5 in medium dat 1,5 mg / ml geneticine. Tenslotte analyseert het percentage GFP-positieve cellen door immunoblot-analyse en flowcytometrie.
2. Analyse van stabiele cellijnen door immunoblotanalyse
- Verwijder de supernatant en was de aangehechte cellen eenmaal met warm PBS. Resuspendeer de cellen in 100 gl 2 x Laemmli-monsterbuffer, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C en bewaar bij -20 ° C.
- Laad ca. 4 x 10 4 cellen per monster op een 12% SDS-PAGE gel. Bovendien load 6 pi van een commercieel proteïneladder als molecuulgewichtsmerker. Run gels een gelelektroforese systeem onder een constante spanning van 180 V gedurende 45-60 min met 1 x Laemmli loopbuffer.
- Blot eiwitten op PVDF-membranen (poriëngrootte van 0.45 pm) bij een constante spanning van 16 V gedurende 60 min onder toepassing van een Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell.
- Block membranen in 10 ml van 5% niet vette droge melk in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) gedurende 1 uur bij KT.
- Verdun 4 ui van anti-GFP antilichaam in 4 ml van MPT en membranen geïncubeerd O / N bij 4 ° C.
- Voer drie wasstappen 10 minuten met 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
- Incubeer membranen met 0,8 ul horseradish peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen in 4 ml van MPT.
- Na 1 uur incubatie bij KT, membranen driemaal wassen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals beschreven in 2.6) en detecteren mierikswortel peroxidase activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Solliciteer standaard apparatuur voor film ontwikkeling eiwitbanden te visualiseren.
3. Analyseer de cellen met behulp van een flowcytometer.
- Resuspendeer cellen in PBS. Gebruik HEK293 cellen als negatieve controle naar voren te passen scatter (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC), zodat de cellen op schaal. Teken een hek op levende cellen door exclusief cel wambuizen, aggregaten en celresten.
- Pas de fotomultiplicatorbuis (PMT) winst, zodat de ongekleurde cellen aan de linkerkant van het histogram voor de FL1-kanaal (488 nm argon laser).
- Om de fluorescentie-intensiteit van HEK293-GFP en HEK293-GFP-CAEB cellen te analyseren openen het histogram van de FL1-kanaal en het verwerven van 10.000 gebeurtenissen op de gated bevolking.
- Analyseer de gegevens met behulp van FACS-analyse software.
4. Transfectie van de stabiele cellijn met de induceerbare expressie vectorsysteem
- Seed HEK293 cellen die stabiel tot expressie GFP of GFP-CAEB in een 12-wells plaat met een dichtheid van 1 x 10 5 cellen / putje.
- 19 uur na het zaaien, co-transfecteren van de cellen met regulator plasmide en respons plasmide ofwel coderen Bax of geactiveerd caspase 3.
- Co-transfecteren van de stabiele HEK293 cellenmet 100 ng pWHE125-P regulator plasmide (figuur 2) en 100 ng van de plasmiden response pWHE655-hBax of pWHE655-revCasp3 (Figuur 3) en 0,4 pl polyethyleenimine.
- Bereid de DNA en polyethyleenimine transfectiereagens elk in 75 pl Opti-MEM medium en incubeer gedurende precies 5 minuten bij kamertemperatuur. Bij complexvorming Incubeer beide mengsels samen 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het polyethyleenimine / DNA-oplossing druppelsgewijs aan de cellen en incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2.
5. Inductie van apoptose
- 5 uur na transfectie, induceren de expressie van pro-apoptotische eiwitten door toevoeging van 1 ug / ml doxycycline aan het cultuurmedium. Incubeer cellen gedurende 18 uur bij 37 ° C in 5% CO 2.
6. Analyse van de als gastheer gebruikte cel apoptose door immunoblotanalyse
- Inspecteer cellen voorafgaand aan harvesting onder de lichtmicroscoop te controleren op celdood inductie. Apoptotische cellen zijn detecteerbaar door de aanwezigheid van apoptotische lichamen rondom de stervende cel.
- Verwijder de supernatant en was de aangehechte cellen eenmaal met warm PBS. Resuspendeer de cellen in 100 gl 2 x Laemmli-monsterbuffer, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C en bewaar bij -20 ° C.
- Laad ca. 4 x 10 4 cellen per monster op een 12% SDS-PAGE gel. Bovendien load 6 pi van een commercieel proteïneladder als molecuulgewichtsmerker. Run gels een gelelektroforese systeem onder een constante spanning van 180 V gedurende 45-60 min met 1 x Laemmli loopbuffer.
- Blot eiwitten op PVDF-membranen (poriegrootte 0,45 um) bij een constante spanning van 16 V gedurende 60 min onder toepassing van een Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell.
- Block membranen in 10 ml van 5% niet vette droge melk in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) gedurende 1 uur bij KT.
- Verdunnen 4 μl anti-gesplitste poly ADP-ribose polymerase (PARP) antilichaam in 4 ml van MPT en geïncubeerd O / N bij 4 ° C.
- Voer drie wasstappen 10 minuten met 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
- Incubeer membranen met 0,8 ul horseradish peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in 4 ml MPT.
- Na 1 uur incubatie bij KT, membranen driemaal wassen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals beschreven in 6.7) en detecteren mierikswortel peroxidase activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Solliciteer standaard apparatuur voor film ontwikkeling eiwitbanden te visualiseren.
- Verwijder gebonden antilichamen door 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur met 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
- Na drie wasbehandelingen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals beschreven in 6.7), probe de membranen met 4 pl anti-actine antilichaam in 4 ml MPT O / N bij 4 ° C.
- Na drie wasstappen met MPT (zoals in 6,7), incubeer de membranen met 0,8 gl horseradish peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in 4 ml van MPT.
- Na 1 uur incubatie bij KT, membranen driemaal wassen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals is beschreven in 6,7 en detecteren mierikswortel peroxidase activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Toepassen standaarduitrusting film ontwikkeling eiwitbanden zichtbaar.
Opmerking: alle incubatiestappen werden uitgevoerd op een plaat schudder gedurende de aangegeven tijd en temperatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ten eerste, HEK293-cellijnen die stabiel het eiwit van belang (CAEB) als GFP-fusie-eiwit werden vastgesteld. Als controle werden HEK293-cellijnen die stabiel GFP ook gegenereerd. Expressie van GFP en GFP-CAEB werd gecontroleerd door immunoblot analyse. De representatieve immunoblot (Figuur 4A) toont stabiele en duidelijk detecteerbare expressie van GFP en GFP-CAEB. Echter, deze test niet bepalen of alle cellen tot expressie GFP of GFP-CAEB. Daarom werden de stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen geanalyseerd door flow cytometrie. Zoals getoond in figuur 4B, dan 90% van de cellen in beide cellijnen tot expressie gebracht GFP. Aldus kunnen deze stabiele cellijnen worden gebruikt om de functie van CAEB verder te onderzoeken. In de volgende stap, de anti-apoptotische activiteit van CAEB werd bepaald door immunoblot-analyse met gebruikmaking van een antilichaam tegen gesplitst PARP. Proteolytische splitsing van nucleair PARP inactiveert DNA-reparatie-activiteit en is een typische marker van de terminal fasen van apoptose. Splitsing van PARP wordt niet gedetecteerd in HEK293-GFP of HEK293-GFP-CAEB cellen, wat aantoont dat noch de expressie van GFP, of een van GFP-CAEB toxisch voor de cellen. Echter, wanneer de cellen werden behandeld met staurosporine, een krachtige inductor van intrinsieke apoptose, splitsing van PARP werd gedetecteerd (Figuur 5). Belangrijk is, HEK293-GFP-CAEB cellen vertonen verminderde splitsing van PARP, met vermelding van de anti-apoptotische activiteit van de Coxiella burnetii type IV secretie systeem effector eiwit CAEB 7.
Om te analyseren op welke stap CAEB interfereert met de apoptotische route, werd het Tet-On-systeem toegepast. In detail werden HEK293-GFP of HEK293-GFP-CAEB cellen getransfecteerd met een plasmide regulator constitutief a-doxycycline blijft automatisch repressor / activator setup (figuur 2) en een pTRE reactie plasmide coderend voor hetzij volledige lengte menselijke Bax of de geactiveerde vorm van menselijk caspase 3, genaamd revCasp 3 (Figuur 3). Dit systeem wordt strak gereguleerd, zoals blijkt uit het ontbreken van PARP klieving onder niet-inducerende omstandigheden (figuur 6). Toevoeging van doxycycline aan de getransfecteerde cellen resulteerde in de expressie van Bax en revCasp 3. Indien CAEB interfereert met de apoptotische route stroomafwaarts van Bax, dan het apoptotische signaal gegenereerd door expressie en daaropvolgende activering van Bax worden geblokkeerd door CAEB expressie. Inderdaad, HEK293 cellen die stabiel tot expressie GFP-CAEB diep remmen apoptose inductie door-doxycycline gecontroleerde Bax expressie, terwijl de HEK293-GFP-cellen weergegeven duidelijk PARP splitsing. Dit resultaat geeft aan dat CAEB blokkeert apoptose inductie achter Bax activering. Vervolgens werd onderzocht of CAEB kunnen interfereren met caspase 3 activatie - een late gebeurtenis in de apoptotische route. HEK293-GFP-cellen, en HEK293-GFP-CAEB cellen vertonen PARP klieving (figuur 6), wat aangeeft dat wanneer de effector-caspase 3 is activated, CAEB kan niet voorkomen dat apoptose voorkomen. Alles bij elkaar genomen tonen deze gegevens aan dat CAEB handelingen tussen Bax en caspase 3 activatie.
Figuur 1. Schematische weergave van het tetracycline regelgeving. Het Tet-On-systeem bestaat uit twee verschillende plasmiden, de regelgeving en de respons plasmiden. De regulerende plasmide codeert voor het Tet-responsieve transsilencer (TTS; gevuld cirkel) en het Tet-responsieve reverse transactivator (rtTA, open cirkel). Beide proteïnen worden constitutief tot expressie gebracht onder de controle van de sterke, constitutieve elongatie factor-1 alfa promoter (P EF-1a). TTS en rtTA chimere transcriptiefactoren bestaande uit een eukaryoot transcriptioneel regulerende domein (geluiddemper of activator, respectievelijk) en een bacterieel tetracycline repressor (TetR). TetR bemiddelt DNA binding aan zeven tet (tetO) sequenties van de reactie plasmide. TetO is stroomopwaarts van de induceerbare minimale cytomegalovirus promoter (P CMV), samen het Tet-responsief element (TRE). Onder niet-inducerende omstandigheden, is tts gebonden aan TRE voorkomen expressie. Na toevoeging van doxycycline (Dox, gevulde diamanten), rtTA samenwerkt met Dox leidt tot conformatieveranderingen en activering. Geactiveerde rtTA vervangt TTS op de respons plasmide, waardoor de transcriptie van de respectievelijke doel genen Bax en caspase 3, hetgeen leidt tot inductie van apoptose en celdood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematisch overzicht van de regulerende plasmide pWHE125. Elements essentieel voor propagatie in bacteria, waaronder een oorsprong van replicatie (ori pBR) en een antibioticum resistentie cassette tegen ampicilline (Amp) en voor expressie van de Tet-transregulators, zoals de sterke constitutieve directe vroege promoter / enhancer van het menselijke cytomegalovirus (P / E hCMV), een interne ribosoom bindingsplaats van polio-virus (PV-IRES) en een polyA-plaats van Simian virus 40 (SV40 polyA) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Schematische weergave van het plasmide respons. Elementen essentieel voor propagatie in bacteriën, waaronder een oorsprong van replicatie (ori pBR) en een antibioticumresistentiegen cassette (Amp R), en induceerbare expressie in eukaryoten, zoals het transgen expressiop cassette met de Tet-afhankelijke minimale promoter TREtight (P TREtight), het gen van belang menselijke Bax (hBax) en een polyA plaats van Simian virus 40 (SV40 polyA), afgebeeld. De transgene expressiecassette wordt geflankeerd door tandem directe herhalingen van twee exemplaren van de kip HS4 isolator kemsequentie (HS4 kern). Daarnaast is er een G418 weerstand cassette bestaande uit een muizen fosfoglyceraatkinase 1 promoter (P mPGK), een neomycineresistentiegen (G418 R) en een menselijke thymidinekinase polyA plaats (TK polyA) aanwezig is. Klik hier om een grotere versie van te bekijken dit cijfer.
Figuur 4. HEK293-GFP en HEK293-GFP-CAEB stabiel groen fluorescerende eiwitten uit te drukken. (A) Whole-cellysaten van HEK293-GFP enHEK293-GFP-cellen werden CAEB immunoblotting op GFP tot stabiele expressie vertonen. (B) vertegenwoordiger flowcytometrie (FACS) analyse van HEK293-GFP en HEK293-GFP-CAEB cellen wordt getoond aan de intensiteit van de GFP expressie te tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Effect van de expressie van GFP-CAEB on-staurosporine geïnduceerde apoptose. HEK293-GFP en HEK293-GFP-CAEB cellen werden behandeld met 4 uM staurosporine gedurende 6 uur intrinsieke apoptose te induceren. Apoptose werd geanalyseerd met gesplitste PARP immunoblot analyse. PARP splitsing werd in HEK293-GFP-CAEB cellen verminderd in vergelijking met HEK293-GFP-cellen. Klik hier om een grotere versie te bekijkenvan dit cijfer.
Figuur 6. Gebruik van het Teton-systeem om een beperking van het punt van de werking van CAEB. (A) Apoptose werd geïnduceerd door expressie van Bax in HEK293-GFP en HEK293-GFP-CAEB cellen. Apoptose werd geanalyseerd met gesplitste PARP immunoblot analyse. PARP klieving werd in HEK293-GFP-CAEB cellen gereduceerd in vergelijking met HEK293-GFP-cellen. (B) Apoptose werd geïnduceerd door expressie van revCasp 3 in HEK293-GFP en HEK293-GFP-CAEB cellen. Apoptose werd geanalyseerd met gesplitste PARP immunoblot analyse. PARP-splitsing was vergelijkbaar in HEK293-GFP-CAEB en HEK293-GFP-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vele pathogene bacteriën herbergen secretiesystemen afscheiden of translocatie van bacteriële effector eiwitten in de gastheercel. Deze effector eiwitten hebben het vermogen om processen en cascades in de gastheercel, waardoor de bacteriën om te overleven en repliceren hun intracellulaire niche. Inzicht in de biochemische activiteiten en de moleculaire mechanismen van de effector eiwitten zal helpen naar een beter begrip van de pathogeniteit en kunnen helpen om nieuwe therapeutische instrumenten voor de bestrijding van de ziekte te ontwikkelen. Zoals de effector eiwitten hun functie uitoefenen door het nabootsen gastheercel activiteiten vaak, kunnen ze ook worden gebruikt om meer over de biologie van eukaryote cellen 1 leren. Echter, het bestuderen van de biochemische activiteit van een effector eiwit heeft bewezen ingewikkeld om verschillende redenen: 1) functionele redundantie tussen de effector eiwitten, 2) de temporele regulatie van aangrijping van de effector eiwitten, en 3) de effector eiwit werken in verband met een andere effector eiwit, bemoeien met zijn functie. Daarom wordt de activiteit van een effector eiwit gewoonlijk bestudeerd door overexpressie studies. Helaas is het gebruik van transiënte overexpressie van het effector eiwit heeft ook verschillende nadelen. Aldus kan alleen single cell analyse assays worden gebruikt, en de activiteit van de effector proteïne kan niet worden geanalyseerd indien de activiteit van de effector eiwit is afhankelijk van de activiteit van een ander effectoreiwit. Ten minste het eerste bezwaar te ondervangen, kunnen stabiele cellijnen worden gebruikt. Bij de expressie van de effector eiwit toxisch voor de cel is niet geschikt. In dit scenario, kan stabiele en induceerbare cellijnen verkregen met behulp van een soortgelijk systeem beschrijven we hier voor transiënte expressie van apoptose-inducerende eiwitten (zie hieronder). Echter, de resultaten (Figuur 5) tonen aan dat de expressie van CAEB beschermt de cellen tegen apoptose ondergaan en derhalve nietgiftig. Er zijn een paar opties in het ontleden bij welke stap binnen de apoptotische cascade CAEB interfereert met apoptose inductie. Een mogelijkheid is de gastheercel bindingspartner van CAEB bepalen. Dit is echter zeer moeilijk en de identificatie van de bindingspartner mogelijk niet bijdragen aan het werkpunt van CAEB leggen in de apoptotische cascade. Een andere mogelijkheid is om verschillende apoptose inducerende middelen gebruiken, maar CAEB remt apoptose inductie door twee verschillende apoptose inducerende middelen, UV-licht en staurosporine 7, wat aangeeft dat deze aanpak zou ook niet leiden tot de identificatie van het aangrijpingspunt van CAEB. Een andere mogelijkheid in het verkleinen van het werkpunt van CAEB, die hier werd benut, is een systeem waarbij de apoptose signaalcascade worden geïnduceerd gedefinieerde stappen gebruikt.
Wanneer expressie van de bacteriële effector eiwit dat is geselecteerd als eiwit van belang reeds verstoort celfysiologie, zijn Expresie kan ook onder controle van een induceerbare expressiesysteem, bijvoorbeeld worden geplaatst, zoals die gebruikt voor het doeleiwit tot expressie. Vervolgens wordt expressie van beide eiwitten van belang en doeleiwit gelijktijdig geïnduceerd wanneer het ligand wordt toegevoegd aan de celkweek waarbij de onderzoeker de cellen differentiële effecten monitor in celfysiologie en signalering systeemvermogen.
Duidelijk expressie brengen van een eiwit van belang en probeert het werkpunt in een bepaald intracellulaire route te identificeren door induceerbare expressie van geselecteerde route eiwitten werkt het best als het beoogde eiwit interfereert met de fysiologische activiteit van de geselecteerde route. In dit geval uitlezing eenvoudigweg het ontbreken van een signaal normaal zijn voor de route, zoals celdood bij apoptotische signalering of activering van transcriptie bij Wnt-signalering. In principe kunnen eiwitten die een specifieke route activeert ook onderzocht met dit tYpe van assay-systeem. Het heeft slechts anders worden ingesteld, bijvoorbeeld met behulp van induceerbare expressie van een si / sh / miRNA tegen pathway eiwit en getest of het eiwit van belang pathway signalering kan redden. Als alternatief kunnen kleine molecule inhibitoren van specifieke eiwitten worden gebruikt om signaaltransductie te onderbreken bij een route en vervolgens controleren traject reddingsjaren induceerbare expressie van een eiwit van belang. Echter, dit soort benadering experimenteel grotere uitdaging dan het protocol hierboven gepresenteerd.
De keuze van het doelgen wordt gesondeerd in de interferentie test is in principe eenvoudig. Het beste is om zoveel van de eiwitten in de geselecteerde signaling pathway Testrapport selecteerbaar om identificatie van het eiwit plaats van interactie met het pad belang is. Dit moet gebeuren op een iteratieve wijze, omdat het niet altijd experimenteel haalbaar of zelfs mogelijk alle mogelijke interac bewakentie partners in een enkel experiment. Daarom is het het beste om de eerste proteïnen gespreid gelijkmatig langs het gehele traject testen en het experiment met de informatie die in de eerste ronde verfijnen. In signaalroutes worden veel eiwitten post- translationeel gemodificeerd, door een covalente modificatie, zoals fosforylering of sumoylation of een verwerkingsgebeurtenis, zoals proteolytische splitsing. Bijgevolg is de respectieve eiwit is ofwel in een grond-staat of in een geactiveerde vorm. Indien mogelijk, is het beter om beide vormen van het eiwit te testen om twee redenen. Een daarvan is dat de geactiveerde vorm levert een hoger uitgangssignaal 31, dat een strengere uitdaging voor het eiwit van belang bevat. In het proof-of-principle bijvoorbeeld apoptotische signalering, wordt de caspase 3 geactiveerd door proteolytische splitsing en dimerisatie. Deze activering gebeurtenis kunstmatig kan worden gesimuleerd door het herschikken van de onbewerkte pro-caspase gen. De kleine subeenheid kunstmatig geplaatstvoor de grote subeenheid en beide zijn verbonden door een linker. Dit wordt een "reverse caspase" vertegenwoordigt de geactiveerde vorm van het enzym uitgedrukt 35. Er werd gekozen vanwege zijn hogere activiteit. De tweede reden voor het sonderen zowel grondtoestand en geactiveerde vormen van een traject eiwit omdat het toelaat een te onderscheiden of het eiwit van belang interfereert met de activering van het doeleiwit, of handelt stroomafwaarts van het eiwit in de route. In het eerste geval zal celdood geïnhibeerd indien de grondtoestand vorm tot expressie wordt gebracht, maar niet als de geactiveerde vorm aanwezig is. In het tweede geval, zal noch eiwit leiden tot apoptose. Derhalve testen beide vormen van een gemodificeerd eiwit wordt de resolutie van het analytische systeem.
Klonen van het target-gen in de induceerbare expressievector vereist een aantal beslissingen. Ten eerste wordt de expressie van het doelgen alleen plaats transiënt of is het beter als de vector stably geïntegreerd in het genoom van de gastheercel lijn? Als alleen tijdelijke expressie vereist is, een eenvoudige vector zoals pUHC13-3 24, dat een Tet-afhankelijke promoter en een polyA plaats of een bidirectionele vector zoals pBI-2 of PBI-3 36 voor koppeling expressie van het gen bevat van belang zijn voor de expressie van een reportergen voor eenvoudiger controle van doelwitgenexpressie, is voldoende. Als stabiele expressie de voorkeur heeft, zou een vector zoals pWHE655 33 (figuur 3) worden gebruikt. Het bevat isolatoren dat de transgene expressie-eenheid te voorkomen positie effecten op de genomische integratie site vanaf bemoeien met induceerbare transgenexpressie flankeren. Het bevat ook een verband, maar onafhankelijk uitgedrukt resistentiecassette voor G418 om de keuze van vector integratiegebeurtenissen vergemakkelijken. Het netto resultaat van deze wijzigingen is een toename van het aantal klonen met uitstekende regulerende eigenschappen 33,37,38. cDNA segen van doelgenen worden gekloond in deze vector met behulp van de unieke restrictieplaatsen van EcoRI en EcoRV 33. Klonering van de vector die de reverse caspase-3 cDNA is in detail beschreven in referentie 33. Kloneren van de vector die menselijk Bax werd analoog uitgevoerd. Het menselijke bax cDNA werd geamplificeerd met PCR uit het plasmide pVenus-Bax 39 gebruik van oligonucleotide primers die restrictieplaatsen voor EcoRI en EcoRV voeren. Na zuivering van het PCR-fragment en met de twee restrictie enzymen, werd het fragment geligeerd met likewise-beperkte pWHE655, waarbij pWHE655TREtight-Bax. Ten tweede, wat minimale promotor is het meest geschikt voor transgenexpressie? De oorspronkelijke minimale promotor P hCMV * -1 24 displays enkele celtype specifieke leakiness 30, deels te wijten aan de aanwezigheid van functionele-interferon α induceerbare reactie elementen 29. Dit leidde tot de ontwikkeling van tweede generatie Tet-afhankelijkepromotors, genaamd ΔMtetO, TREtight en SG-TRE, met gewijzigde afstand en sequenties tussen de tetO elementen en met verschillende minimale promoter sequenties 33,40-42. Ze vertonen een sterk verlaagde leakiness in afwezigheid van doxycycline. Tussen deze tweede generatie promoters, ΔMtetO het laagste expressieniveau transgen in aanwezigheid van doxycycline 33. TREtight bemiddelt een intermediair en SG-TRE het hoogste niveau van transgenexpressie 33. Verdere wijzigingen achtergrondexpressie van het tetracycline responsieve promoter nog 43,44 geminimaliseerd. Derhalve kan de keuze van een tetracycline-responsieve promoter worden gemaakt volgens de vereisten en beperkingen van de respectievelijke transgen.
Onafhankelijk van de soort van experimentele benadering, dichtheid van expressie van het doelwiteiwit van belang. Bijvoorbeeld, inductie van apoptose met geactiveerde vormen van de pro-apoptotische eiwitten leidt tot celdood, zelfs wanneer slechts minimale hoeveelheden van de respectieve doeleiwit tot expressie worden gebracht 31-33. De gewenste stringentie wordt bereikt door toevoeging van een tetracycline-afhankelijke transsilencer de voorwaardelijke regelgeving 30. Het zorgt ervoor dat transcriptie vanaf de induceerbare promoter actief onderdrukt, wat vooral belangrijk wanneer transiënte transfecties uitgevoerd, omdat deze meestal vrij lek in de transgenexpressie 30. Als signaalroutes die geen celdood induceren gepeild, kan het vereiste van strikte regeling van doelwitgenexpressie worden versoepeld en induceerbare systemen zonder transsilencer 43,44 alternatief kunnen worden gebruikt.
Het induceerbare regulatiesysteem gebruikt om de signaalroute sonde hoeft niet het Tet systeem. Het grote voordeel is dat het intensief gebruikt in zoogdiercellen meer dan 20 jaar en dat het de meest ontwikkelde en best characterized induceerbaar controlesysteem. Toch zijn er ten minste 25 andere voorwaardelijke regelsystemen 45,46 die kunnen worden gebruikt als alternatief of naast het Tet systeem. Twee of drie verschillende induceerbare systemen kunnen bruikbaar zijn bij het sonderen convergente signaalroutes of voor het testen redundantie van ofwel het doelwit gen of het eiwit van belang.
De hier voorgestelde procedure moet samenwerken met transfectie-efficiënties die resulteren in een robuuste en betrouwbare uitgangssignaal van de respectievelijke signaling pathway dat is gesondeerd. Aangezien de stabiele cellijnen het eiwit van belang op homogene wijze (figuur 4B), alle cellen die transiënt zijn getransfecteerd met het induceerbare plasmide dat het gewenste eiwit gesondeerd storing van het eiwit van belang met signalering route.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
References
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
- Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
- Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
- Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
- Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
- Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
- Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
- Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
- Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
- Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
- Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
- Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
- Cory, S.
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
- Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
- Felsher, D. W.
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
- Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
- Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J.
- Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
- Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
- Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
- Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
- Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
- Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
- Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
- Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
- Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
- Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
- Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
- Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
- Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
- Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
- Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
- Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
- Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).
