Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Anvende en Inducerbar Expression System til Studieinformationen Interferens med bakteriel virulensfaktorer med intracellulær signalering

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52903
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

Abstract

Teknikken præsenteres her tillader en at analysere på hvilket trin et målprotein, eller alternativt et lille molekyle, interagerer med komponenterne i en signalvej. Fremgangsmåden er baseret på den ene side, på den inducerbare ekspression af et specifikt protein til at indlede en signalhændelse ved en defineret og forudbestemt trin i den valgte signaleringskaskaden. Samtidig ekspression, på den anden side, af genet af interesse tillader derefter undersøgeren at vurdere, om aktiviteten af ​​det udtrykte målprotein er placeret opstrøms eller nedstrøms for den indledte signalering begivenhed, afhængigt af udlæsning af signalvejen, som opnås. Her blev den apoptotiske kaskade udvalgt som defineret signalvej at påvise protokol funktionalitet. Patogene bakterier, såsom Coxiella burnetii, translokere effektor proteiner som interfererer med værten celledødsinduktion i værtscellen for at sikre bakteriel overlevelse i cellen og til at fremme deresudbredelse i organismen. C. burnetii effektor-protein CaeB effektivt inhiberer vært celledød efter induktion af apoptose med UV-lys eller med staurosporin. At indsnævre hvor trin CaeB forstyrrer udbredelsen af ​​den apoptotiske signal, blev udvalgte proteiner med velkarakteriserede pro-apoptotiske aktivitet udtrykkes transient i en doxycyclin-inducerbar måde. Hvis CaeB virker opstrøms for disse proteiner, vil apoptose fortsætte uhindret. Hvis CaeB virker nedstrøms, vil celledød inhiberes. Testproteinerne udvalgte var Bax, der virker på niveauet for mitokondrierne, og caspase 3, som er den største bøddel protease. CaeB forstyrrer celledød induceret af Bax-ekspression, men ikke af caspase 3-ekspression. CaeB således interagerer med den apoptotiske kaskade mellem disse to proteiner.

Introduction

Virulensen af ​​mange Gram-negative bakterielle patogener afhænger specialiserede sekretionssystemer at kapre eukaryote værtsceller. Bakterier bruger disse sekretionssystemer at injicere bakterielle virulens proteiner (effektorer) ind i værtscellen til at modulere en række cellulære og biokemiske aktiviteter. Studiet af effektor proteiner har ikke kun givet bemærkelsesværdige indsigt i grundlæggende aspekter af vært / patogen interaktioner, men også ind i den grundlæggende biologi eukaryote celler 1. Modulering af værtscelle apoptose har vist sig at være en vigtig virulens mekanisme for mange intracellulære patogener, og en række effektorproteiner modulerende apoptose er blevet identificeret 2-9. Men deres nøjagtige molekylære mekanismer for aktivitet forbliver undvigende i mange tilfælde.

Apoptose, en form for programmeret celledød, spiller en vigtig rolle i immunresponser på infektion 10. To vigtige veje, der fører til apoptose harblevet identificeret: målretning mitokondrierne (intrinsisk apoptose) eller direkte transduktion af signalet via celledød-receptorer på plasmamembranen (extrinsic apoptose). Den iboende eller mitokondrier-medieret celledød pathway udløses af intracellulære signaler og involverer aktiveringen af ​​Bax og Bak, to pro-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien. Denne familie består af pro- og anti-apoptotiske regulator proteiner, der styrer celledød 11-14. Aktivering af apoptose fører til oligomerisering af Bax og Bak efterfulgt af efterfølgende permeabilisering af den mitokondriske ydre membran, hvilket resulterer i cytochrom c-frigivelse i cytoplasmaet. Cytochrom C frigivelse initierer aktivering af effektor-caspaserne 3 og 7 gennem aktivering af caspase 9 i apoptosome 15. Dette fører til proteolyse af udvalgte substrater, der blandt andet resulterer i eksponeringen af phosphatidylserin på celleoverfladen 16 og frigør en dedikeret DNase at fragmenter chromatin 17,18.

For at afgøre, hvor i den apoptotiske kaskade en individuel effektor-protein interfererer blev et inducerbart ekspressionssystem 19. Reguleringssystemer til betinget udtryk af transgener har været et uvurderligt værktøj i at analysere et proteins funktion i cellen eller dens betydning for væv, orgel og organisme udvikling, samt under initiering, progression og vedligeholdelse af sygdom 20-23. Typisk inducerbare kontrolsystemer, såsom Tet-systemet 24 anvendes her, danner en kunstig transkriptionsenhed (se figur 1). En komponent er et kunstigt manipuleret transkriptionsfaktor kaldet tTA (tetracyclin-afhængig transskription aktivator), dannet ved fusion af det bakterielle transkription repressor TetR 25 til et pattedyrprotein domæne, som medierer transkriptionel aktivering eller silencing 24,26. Den anden komponent er en hybridpromotor, betegnet TRE (tetracyklin-responsivt element), der består af en eukaryot minimal promotor, der indeholder mindst en TATA-box og et transskriptionsinitieringssted, forbundet til flere gentagelser af beslægtede DNA-bindingssted for TetR, tetO 24,25. Den tredje komponent er den naturlige ligand af TetR, tetracyclin eller et af dets derivater, såsom anhydrotetracycline eller doxycyklin 25. Efter ligand tilsætning til dyrkningsmediet, TetR mister dets affinitet for tetO og dissocierer fra TRE. Som følge heraf er transkription af målgenet afskaffet. Transgen ekspression kan således blive tæt kontrolleret på en tids- og dosisafhængig måde i både cellekultur og i dyr 20,23,24. Med tTA, transgen ekspression forekommer konstitutivt, undtagen i nærvær af en tetracyclin. Dette kan være en ulempe i studiet af cytotoksiske eller onkogene proteiner, fordi tetracyclin først skal fjernes fra systemet, før transgen expression forekommer, og målproteinet virkninger på cellen kan overvåges. Dette kan være tidskrævende og er ikke altid fuldstændig, især i transgene dyr 27. For at løse denne begrænsning blev en TetR mutant med en invers reaktion på tilstedeværelsen af doxycyclin anvendes til at generere en ny transkriptionsfaktor, rtTA (revers tTA) 28. Det binder kun til TRE og, samtidigt, aktiverer transkription i nærvær af doxycyclin. Resterende utæthed i systemet, dvs.., Transgenekspression i fravær af TRE-bundet transkriptionsfaktor, oprindelse enten (i) fra positionseffekter på et genomisk integration site, (ii) fra TRE selv 29, eller (iii) fra ikke -specifikke binding af tTA / rtTA 28, blev behandlet ved at indføre en yderligere transkriptionel lyddæmper, betegnet TTS (tetracyclin-afhængig transskriptionel lyddæmper) 30 til systemet. Det danner et dobbelt regulator nettet sammen med rtTA (se figur 1).I mangel af doxycyclin, TTS bindes til TRE og aktivt lukker ned resterende transskription. I nærvær af doxycyclin, TTS dissocierer fra TRE og rtTA binder samtidigt inducere ekspression af målgenet. Dette ekstra lag af stringens er ofte nødvendigt at udtrykke meget aktive cytotoksiske proteiner 31-34.

Brug af denne tæt kontrolleret dobbelt regulator system kan initieres den apoptotiske kaskade ved en defineret trin tillader analyse af, om den givne effektor-protein kan interferere med apoptose induktion. Denne metode kan ikke kun anvendes til at studere den anti-apoptotiske aktivitet af bakterielle effektor proteiner, men også for den inducerbare ekspression af pro-apoptotiske eller toksiske proteiner eller til dissekere interferens med andre signalveje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering af stabile cellelinjer, der udtrykker proteinet af interesse

  1. Forbered medier ved tilsætning varmeinaktiveret FCS og 1% penicillin / streptomycin til kommercielt tilgængelige Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med GlutaMAX-I, pyruvat og 4,5 g / l D-glucose.
  2. Dyrk HEK293-celler i medier ved 37 ° C i 5% CO2. Sub-dyrke celler hver tredje dag. Fjern mediet og resuspender cellerne i 15 ml frisk medie. Pipette 1 ml i en ny 75 cm2 cellekultur kolbe og tilsættes 14 ml medier.
  3. Analyser celle nummer ved hjælp af et hæmocytometer.
  4. Seed HEK293-celler i en 6-brønds plade med en tæthed på 2 x 10 5 celler per brønd og inkuberes i 24 timer.
  5. Til transfektion anvende protokollen tilvejebragt af producenten af ​​transfektionsreagens. Transficere celler med pEGFP-C2 eller pEGFP-C2-CaeB vha transfektionsreagens. Inden brug varme op transfektion reagent og medierne, der kræves til RT. Brug en 3: 1-forhold mellem transfektionsreagens til DNA.
    1. I detaljer, pipette 1,5 pi transfektionsreagens direkte ind 50 pi serumfrit DMEM-medium. For kompleksdannelse, pipette 0,5 ug af DNA, der koder GFP eller GFP-CaeB til transfektionsreagens-blanding og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
    2. Transficere celler ved at tilsætte reaktionsblandingen i en dråbevis måde og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 24 timer.
  6. Tilsæt 1 mg / ml geneticin til udvælgelse af GFP-positive kloner ved 37 ° C i 5% CO2.
  7. Efter 6 dage isolere enkelte celler ved flowcytometri sortering i en 96-brønds plade, der huser medium og HEK293 supernatanten i et 1: 1 forhold. Generere HEK293 supernatant fra dyrkede konfluerende HEK293-celler, der blev centrifugeret i 15 minutter ved 4.966 x g.
  8. Den følgende dag, erstatte dyrkningsmedium med medium indeholdende 1,50; mg / ml geneticin. Skift medier en gang om ugen. Hvis cellerne danner et konfluent monolag, overføre dem til en 24-brønds plade. Sub-dyrke cellerne to gange om ugen i et forhold på 1: 5 i medier indeholdende 1,5 mg / ml geneticin. Endelig analysere procentdelen af ​​GFP-positive celler ved immunoblotanalyse og flowcytometri.

2. Analyse af stabile cellelinier efter immunoblotanalyse

  1. Fjern supernatanten og vask de adhærerede celler en gang med varmt PBS. Cellerne resuspenderes i 100 pi 2x Laemmli prøvepuffer og opvarmes i 5 minutter ved 95 ° C og opbevares ved -20 ° C.
  2. Lægge ca. 4 x 10 4 celler pr prøve på en 12% SDS-PAGE-gel. Derudover belastning 6 pi af en kommerciel protein stige som en molekylvægtmarkør. Køre geler i et gelelektroforese-system under en konstant spænding på 180 V for 45-60 min med 1x Laemmli løbebuffer.
  3. -Blot proteiner på PVDF membraner (porestørrelse på 0.45 um) ved en konstant spænding på 16 V i 60 minutter under anvendelse af en Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell.
  4. Blok membraner i 10 ml 5% fedtfri tørmælk i PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) i 1 time ved stuetemperatur.
  5. Fortynd 4 pi anti-GFP-antistof i 4 ml MPT og inkuberes membraner O / N ved 4 ° C.
  6. Udføre tre 10 min vasketrin med 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
  7. Inkuber membraner med 0,8 pi peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer i 4 ml MPT.
  8. Efter 1 times inkubation ved stuetemperatur vaskes membranerne tre gange med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrevet i 2.6) og afsløre peberrodsperoxidase aktivitet med et kommercielt kit ifølge producentens protokol. Ansøg standardudstyr til film udvikling at visualisere protein bands.

3. Analyser Celler Brug et flowcytometer.

  1. Resuspender celler i PBS. Brug HEK293 celler som negativ kontrol til justering frem scAtter (FSC) og sidespredning (SSC), således at cellerne er på skalaen. Tegn en gate på levende celler ved at udelukke celle dubletter, aggregater og cellerester.
  2. Juster fotomultiplikatorrøret (PMT) gevinst, således at de ufarvede celler er længst til venstre i histogrammet for FL1 kanal (488 nm argon laser).
  3. For at analysere fluorescensintensiteten af ​​HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB celler åbne histogrammet af FL1 kanal og erhverve 10.000 begivenheder på gated befolkning.
  4. Analysere data ved hjælp af kommercielle FACS-analyse software.

4. Transfektion af stabil cellelinie med den inducerbare Expression Vector System

  1. Seed HEK293-celler der stabilt udtrykker GFP eller GFP-CaeB i en plade med 12 brønde ved en densitet på 1 x 10 5 celler / brønd.
  2. 19 timer efter podning, co-transficere cellerne med regulator plasmid og respons plasmid enten koder Bax eller aktiveret caspase 3.
    1. Co-transficere de stabile HEK293-cellermed 100 ng pWHE125-P regulator plasmidet (figur 2) og 100 ng af respons plasmiderne pWHE655-hBax eller pWHE655-revCasp3 (figur 3) og 0,4 pi polyethylenimin.
    2. Forbered DNA'et og polyethylenimin transfektionsreagens hver i 75 pi Opti-MEM-medium og inkuberes i nøjagtig 5 minutter ved stuetemperatur. For kompleksdannelse, inkuberes begge blandinger sammen i 15 min ved stuetemperatur.
  3. Tilsæt polyethylenimin / DNA-opløsning dråbevis til cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2.

5. Induktion af apoptose

  1. 5 timer efter transfektion, inducerer ekspression af de pro-apoptotiske proteiner ved tilsætning af 1 ug / ml doxycyclin til dyrkningsmediet. Cellerne inkuberes i 18 timer ved 37 ° C i 5% CO2.

6. Analyse af Host Cell Apoptose af immunoblotanalyse

  1. Undersøg celler før harvesting under lys mikroskop for at kontrollere for celledød induktion. Apoptotiske celler er påviseligt ved tilstedeværelsen af ​​apoptotiske legemer omgiver den døende celle.
  2. Fjern supernatanten og vask de adhærerede celler en gang med varmt PBS. Cellerne resuspenderes i 100 pi 2x Laemmli prøvepuffer og opvarmes i 5 minutter ved 95 ° C og opbevares ved -20 ° C.
  3. Lægge ca. 4 x 10 4 celler pr prøve på en 12% SDS-PAGE-gel. Derudover belastning 6 pi af en kommerciel protein stige som en molekylvægtmarkør. Køre geler i et gelelektroforese-system under en konstant spænding på 180 V for 45-60 min med 1x Laemmli løbebuffer.
  4. -Blot proteiner på PVDF membraner (porestørrelse på 0,45 um) ved en konstant spænding på 16 V i 60 minutter under anvendelse af en Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell.
  5. Blok membraner i 10 ml 5% fedtfri tørmælk i PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) i 1 time ved stuetemperatur.
  6. Fortynd 4 μl af anti-spaltet poly ADP-ribose polymerase (PARP) antistof i 4 ml MPT og inkuberes O / N ved 4 ° C.
  7. Udføre tre 10 min vasketrin med 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
  8. Inkuber membraner med 0,8 pi peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer fortyndet i 4 ml MPT.
  9. Efter 1 times inkubation ved stuetemperatur vaskes membranerne tre gange med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrevet i 6.7) og afsløre peberrodsperoxidase aktivitet med et kommercielt kit ifølge producentens protokol. Ansøg standardudstyr til film udvikling at visualisere protein bands.
  10. Fjern bundne antistoffer med 30 minutters inkubation ved stuetemperatur med 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
  11. Efter tre vaske med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrevet i 6.7), probe membranerne med 4 pi anti-actin-antistof i 4 ml MPT O / N ved 4 ° C.
  12. Efter tre vasketrin med MPT (som beskrevet i 6.7), inkubere membranerne med 0,8 pi horseradish peroxidase-konjugerede sekundære antistoffer fortyndet i 4 ml MPT.
  13. Efter 1 times inkubation ved stuetemperatur vaskes membranerne tre gange med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrevet i 6.7 og opdage peberrodsperoxidase aktivitet med et kommercielt kit ifølge producentens protokol. Ansøg standardudstyr til filmfremkaldelse at visualisere proteinbånd.
    Bemærk: Alle inkubationstrin blev udført på en pladeryster i den angivne tid og temperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Først blev HEK293 cellelinjer der stabilt udtrykker proteinet af interesse (CaeB) som GFP-fusionsprotein etableret. Som en kontrol blev HEK293-cellelinjer, der stabilt udtrykker GFP også genereret. Ekspression af GFP og GFP-CaeB blev verificeret ved immunoblot-analyse. Den repræsentative immunoblot (figur 4A), viser stabil og klart påviselig ekspression af GFP og GFP-CaeB. Dog kan denne analyse ikke afgøre, om alle celler udtrykker GFP eller GFP-CaeB. Derfor blev stabilt transficerede HEK293 cellelinier også analyseret ved flowcytometri. Som vist i figur 4B, over 90% af cellerne i begge cellelinier udtrykte GFP. Således kan disse stabile cellelinier anvendes til yderligere at analysere funktionen af ​​CaeB. I det næste trin blev anti-apoptotiske aktivitet af CaeB analyseret ved immunblot-analyse under anvendelse af et antistof mod spaltet PARP. Proteolytisk spaltning af nuklear PARP inaktiverer DNA-reparation aktivitet og er en typisk markør af terminale stadier af apoptose. Spaltning af PARP er ikke påvist i HEK293-GFP eller HEK293-GFP-CaeB celler, hvilket viser, at hverken ekspressionen af ​​GFP, eller af GFP-CaeB er toksisk for cellerne. Men når cellerne blev behandlet med staurosporin, en potent inducer af iboende apoptose, kløvning af PARP blev påvist (figur 5). Vigtigere, udviser HEK293-GFP-CaeB celler reduceret spaltning af PARP, indikerer det anti-apoptotiske aktivitet af Coxiella burnetii type IV secerneringssystem effektor-protein CaeB 7.

For at analysere på hvilket trin CaeB griber ind i den apoptosecyklus blev Tet-On-system anvendt. I detaljer blev HEK293-GFP eller HEK293-GFP-CaeB celler transficeret med en regulator plasmid konstitutivt udtrykker et doxycyclin-kontrolleret dobbelt repressor / aktivator opsætningen (figur 2) og en pTRE respons plasmid, der koder enten fuld længde human Bax eller den aktiverede form af human caspase 3, betegnet revCasp 3 (Figur 3). Dette system er stramt reguleret, hvilket fremgår af manglen på PARP-spaltning under ikke-inducerende betingelser (figur 6). Tilsætning af doxycyclin til de transficerede celler resulterede i ekspressionen af ​​Bax eller revCasp 3. Hvis CaeB forstyrrer den apoptotiske vej nedstrøms for Bax, så den apoptotiske signal, der frembringes ved ekspression og efterfølgende aktivering af Bax bør blokeres af CaeB ekspression. Faktisk HEK293-celler der stabilt udtrykker GFP-CaeB dybt inhiberer apoptose induktion med doxycyclin-kontrollerede Bax-ekspression, mens HEK293-GFP-celler i åbenlys PARP-spaltning. Dette resultat indikerer, CaeB blokerer apoptose induktion nedstrøms for Bax-aktivering. Dernæst blev det analyseret, om CaeB kan forstyrre caspase 3-aktivering - en sen hændelse i den apoptotiske vej. HEK293-GFP-celler, såvel som HEK293-GFP-CaeB celler, udviser PARP spaltningsprodukter (figur 6), hvilket indikerer, at når effektor caspase 3 activated, CaeB kan ikke forhindre apoptose opstår. Tilsammen viser disse data, at CaeB virker mellem Bax og caspase 3 aktivering.

Figur 1
Figur 1. Skematisk overblik over tetracyclin reguleringssystem. Den Tet-On-system består af to forskellige plasmider, de lovgivningsmæssige og svar plasmider. Den regulerende plasmid koder Tet-responsiv transsilencer (TTS; udfyldt cirkel) og Tet-responsive reverse transaktivator (rtTA, åben cirkel). Begge proteiner konstitutivt udtrykkes under kontrol af den stærke, konstitutive forlængelsesfaktor-1-alfa-promotoren (P EF-1a). TTS og rtTA er kimære transkriptionsfaktorer, der består af en eukaryot transkriptionel regulatorisk domæne (lyddæmper eller aktivator, henholdsvis) og en bakteriel tetracyclin repressor (TetR). TetR medierer DNA-binding til syv tet (tetO) sekvenser på responset plasmidet. TetO ligger opstrøms for den inducerbare minimal cytomegalovirus promotor (P CMV), der tilsammen danner Tet-responsive element (TRE). Under ikke-inducerende betingelser, er TTS bundet til TRE forebygge udtryk. Efter tilsætning af doxycyclin (Dox; fyldt diamant), rtTA interagerer med Dox fører til konformationelle ændringer og aktivering. Aktiveret rtTA erstatter TTS på svar plasmid tillader transskription af den respektive målgener Bax og caspase 3, hvilket fører til apoptose induktion og celledød. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Skematisk oversigt over de lovgivningsmæssige plasmid pWHE125. Elementer afgørende for formering i bacterier, herunder et replikationsorigin (ori pBR) og et antibiotisk resistent kassette mod ampicillin (Amp R) og til ekspression af tet-transregulators, såsom den stærke, konstitutive umiddelbart tidlige promotor / enhancer for det humane Cytomegalovirus (P / E hCMV), et internt ribosombindingssted fra polio-virus (PV-IRES) og et polyA-site fra Simian virus 40 (SV40 polyA) vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Skematisk oversigt over responsen plasmidet. Elementer afgørende for opformering i bakterier, herunder et replikationsorigin (ori pBR) og en antibiotikaresistens kassette (Amp R) og til inducerbar ekspression i eukaryoter, såsom transgenet expressipå kassette med Tet-afhængige minimal promotor TREtight (P TREtight), genet af interesse human Bax (hBax) og et polyA site fra Simian virus 40 (SV40 polyA), er afbildet. Transgenet ekspressionskassetten er flankeret af tandem direkte gentagelser af to kopier af kylling HS4 isolator kernesekvens (HS4 kerne). Derudover en G418 modstand kassette bestående af en muse phosphoglyceratkinasepromotor 1 promotor (P mPGK), en neomycinresistensgen (G418 R) og en human thymidinkinase polyA websted (TK polyA) er til stede. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB stabilt udtrykker grønt fluorescerende proteiner. (A) Whole-cellelysater af HEK293-GFP ogHEK293-GFP-CaeB celler blev immunoblottedes for GFP at vise stabil ekspression. (B) Repræsentant flowcytometri (FACS) analyse af HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB celler er vist at demonstrere intensiteten af GFP-ekspression. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Virkninger af ekspressionen af GFP-CaeB på staurosporin-induceret apoptose. HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB celler blev behandlet med 4 pM staurosporin i 6 timer for at inducere iboende apoptose. Apoptose blev analyseret ved spaltet PARP immunblotanalyse. PARP spaltning blev reduceret i HEK293-GFP-CaeB celler i forhold til HEK293-GFP-celler. Klik her for at se en større versionaf dette tal.

Figur 6
Figur 6. Anvendelse af Teton system til at indsnævre det punkt virkningsmekanisme CaeB. (A) Apoptose blev induceret ved ekspression af Bax i HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB celler. Apoptose blev analyseret ved spaltet PARP immunblotanalyse. PARP-spaltning blev reduceret i HEK293-GFP-CaeB celler i sammenligning med HEK293-GFP-celler. (B) Apoptose blev induceret ved ekspression af revCasp 3 i HEK293-GFP og HEK293-GFP-CaeB celler. Apoptose blev analyseret ved spaltet PARP immunblotanalyse. PARP spaltning var sammenlignelig i HEK293-GFP-CaeB og HEK293-GFP-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange patogene bakterier harbor sekretionssystemer til at udskille eller translokere bakterielle effektor proteiner i værtscellen. Disse effektor proteiner har evnen til at modulere processer og veje i værtscellen, hvilket tillader bakterier at overleve og formere sig i deres respektive intracellulære niche. Forståelse af de biokemiske aktiviteter og de molekylære mekanismer i de effektor proteiner vil hjælpe til en bedre forståelse af patogenicitet og kan bidrage til at udvikle nye terapeutiske redskaber til at bekæmpe sygdommen. Som effektor proteiner ofte udøve deres funktion ved at efterligne værtscellelinier aktiviteter, kan de også bruges til at lære mere om biologi eukaryote celler 1. Imidlertid studere den biokemiske aktivitet af et enkelt effektor-protein har vist sig at være kompliceret af flere grunde: 1) funktionel redundans blandt effektor proteiner, 2) den tidsmæssige regulering af indgreb af effektor-proteiner, og 3) den effektor protein der arbejder i sammenhæng med et andet effektor protein, forstyrre dens funktion. Derfor er aktiviteten af ​​en effektor-protein almindeligvis studeret ved overekspression undersøgelser. Desværre, brugen af ​​forbigående overekspression af effektor-proteinet har også flere ulemper. Således kan kun enkelt celle analyse assays anvendes, og aktiviteten af ​​effektor-proteinet ikke kan analyseres, hvis aktiviteten af ​​effektor-protein afhænger af aktiviteten af ​​en anden effektor-protein. For at overvinde i det mindste den første ulempe, kan stabile cellelinjer anvendes. Hvis ekspressionen af ​​effektor-proteinet er toksisk for cellen, er det ikke egnet. I dette scenarie kan stabile og inducerbare cellelinjer etableres ved anvendelse af et lignende system som vi beskriver her til transient ekspression af apoptose-inducerende proteiner (se nedenfor). Men vores resultater (figur 5) viser, at ekspressionen af CaeB beskytter cellerne mod undergår apoptose og er derfor ikkegiftige. Der er et par muligheder i dissekere hvor trin i den apoptotiske kaskade CaeB forstyrrer apoptose induktion. En mulighed er at bestemme værtscellen bindingspartner af CaeB. Men dette er meget udfordrende og identifikation af bindingspartneren måske ikke bidrage til at forklare det punkt virkningsmekanisme CaeB inden den apoptotiske kaskade. En anden mulighed er at anvende forskellige apoptose-inducere, men CaeB inhiberer apoptose induktion ved to forskellige apoptose-inducerende, UV-lys og STAUROSPORIN 7, hvilket indikerer, at denne fremgangsmåde også ikke kan føre til identifikation af det punkt virkningsmekanisme CaeB. En anden mulighed i at indsnævre det punkt virkningsmekanisme CaeB, som blev udnyttet her, er at anvende et system, hvor apoptose signaleringskaskade kan induceres ved definerede trin.

Hvis ekspression af det bakterielle effektor-protein, der blev valgt som protein af interesse allerede forstyrrer cellefysiologi, dens EXPREssion kan også placeres under kontrol af en inducerbar ekspressionssystem, f.eks, såsom den, der anvendes til at udtrykke målproteinet. Derefter vil ekspression af både protein af interesse og målprotein anvendes samtidig induceres når liganden tilsættes til cellekulturen tillader investigator at overvåge cellerne i forskellige virkninger på cellefysiologi og signalsystem output.

Det er klart, der udtrykker et protein af interesse og forsøger at identificere sit udgangspunkt handling i et specifikt intracellulære vej ved inducerbar ekspression af udvalgte pathway proteiner fungerer bedst, hvis proteinet af interesse interfererer med den fysiologiske aktivitet af det valgte vej. I dette tilfælde udlæsning simpelthen manglen på et signal normalt er forbundet med den vej, såsom celledød i tilfælde af apoptotiske signalering eller aktivering af transskription i tilfælde af Wnt-signalering. I princippet kan proteiner, der aktiverer en særlig pathway også probes med denne type af analysesystem. Det skal kun oprettes forskelligt, for eksempel ved anvendelse inducerbar ekspression af en si / sh / miRNA mod en pathway protein og afprøvning hvis proteinet af interesse kan redde pathway signalering. Alternativt kan småmolekyleinhibitorer af specifikke proteiner anvendes til at afbryde signaltransduktion inden for en pathway og derefter at kontrollere for pathway redning ved inducerbar ekspression af et protein af interesse. Denne type tilgang vil dog være eksperimentelt mere udfordrende end den protokol præsenteret ovenfor.

Udvælgelsen af ​​det målgen, der skal probes i analyseinterferens er i princippet ligetil. Det er bedst at teste så mange af proteinerne i den valgte signalvej som muligt at finjustere identifikationen af ​​proteinet af interesse hjemmeside for interaktion med reaktionsvej. Dette bør ske i en iterativ måde, fordi det ikke altid er eksperimentelt muligt eller endda muligt at overvåge alle potentielle Interaction partnere i et enkelt forsøg. Derfor er det bedst først at teste flere proteiner fordelt jævnt ud langs hele vejen, og derefter at forfine forsøget ved hjælp af oplysningerne opnået i første runde. I signalveje, er mange proteiner modificeret posttranslationelt, enten ved en kovalent modifikation, såsom phosphorylering eller sumoylation, eller ved en behandling begivenhed, såsom proteolytisk spaltning. Derfor det respektive protein er enten i en jord-tilstand eller i en aktiveret form. Hvis det er muligt, er det bedst at teste begge former for proteinet af to grunde. Den ene er, at den aktiverede form sender et højere udgangssignal 31, som udgør en strengere udfordring for proteinet af interesse. I vores proof-of-principle eksempel apoptotisk signalering er caspase 3 aktiveres ved proteolytisk spaltning og dimerisering. Denne aktivering begivenhed kan simuleres kunstigt ved at omarrangere den uforarbejdede pro-caspase genet. Den lille underenhed er kunstigt placeretforan den store underenhed og begge er forbundet med en linker. Dette betegnes en "omvendt caspase" og repræsenterer den aktiverede form af enzymet, når det udtrykkes 35. Det blev valgt på grund af dets højere grad af aktivitet. Den anden grund til at probe både grundtilstand og aktiverede former af en pathway protein er fordi det tillader en at skelne hvis proteinet af interesse interfererer med aktivering af målproteinet, eller hvis den optræder nedstrøms for proteinet i reaktionsvejen. I det første tilfælde vil celledød inhiberes hvis grundtilstand formular udtrykkes, men ikke hvis den aktiverede form er til stede. I det andet tilfælde vil hverken protein føre til apoptose. Således teste begge former af et modificeret protein forbedrer opløsningen i den analytiske system.

Klone målgenet i den inducerbare ekspressionsvektor kræver flere beslutninger. Først skal ekspression af målgenet kun forekommer transient eller er det bedre, hvis vektoren er sgåeligt integreret i genomet af værtscellen linjen? Hvis der kun transient ekspression er påkrævet, en simpel vektor, såsom pUHC13-3 24, som indeholder en Tet-afhængig promotor og et polyA site, eller en tovejs vektor, såsom PBI-2 eller PBI-3 36, som kobler ekspression af genet af interesse for ekspressionen af ​​et reportergen for lettere at overvåge målgenekspression, vil være tilstrækkelig. Hvis stabil ekspression foretrækkes, bør en vektor, såsom pWHE655 33 (figur 3) anvendes. Det indeholder isolatorer, som flankerer transgenet ekspressionsenhed at forhindre positionseffekter på det genomiske integrationssted i at forstyrre inducerbar transgenekspression. Den indeholder også en forbundet, men uafhængigt udtrykt modstand kassette til G418 at lette udvælgelsen af ​​vektor integrationshændelser. Nettoresultatet af disse ændringer er en stigning i antallet af kloner med fremragende regulatoriske egenskaber 33,37,38. cDNA sekvenser af målgener kan klones i denne vektor ved hjælp af de unikke restriktionssteder for EcoRI og EcoRV 33. Kloning af vektor, der udtrykker den omvendte Caspase-3 cDNA blev beskrevet detaljeret med henvisning 33. Kloning af vektor, der udtrykker humant Bax blev udført analogt. Det humane bax cDNA blev amplificeret ved PCR fra plasmidet pVenus-Bax 39 ved anvendelse af oligonukleotidprimere, der indfører restriktionssteder for EcoRI og EcoRV. Efter oprensning af PCR-fragmentet og begrænsning med de to enzymer blev fragmentet ligeret med ligeledes-begrænsede pWHE655, hvilket gav pWHE655TREtight-Bax. For det andet, som minimal promotor er mest hensigtsmæssigt for transgen udtryk? Den oprindelige minimale promotor P hCMV * -1 24 viser nogle specifikke utæthed celletype 30, skyldes til dels, at tilstedeværelsen af funktionelle interferon-α inducerbare respons elementer 29. Dette førte til udviklingen af ​​anden generation Tet-afhængiginitiativtagere, betegnet ΔMtetO, TREtight og SG-TRE, med ændret afstand og sekvenser mellem tetO elementerne og med forskellige minimale promotorsekvenser 33,40-42. De udviser markant reduceret utætheder i fravær af doxycyclin. Blandt disse anden generation initiativtagere, ΔMtetO har det laveste transgenekspression niveau i overværelse af doxycyclin 33. TREtight medierer en mellemliggende og SG-TRE det højeste niveau af transgen ekspression 33. Yderligere modifikationer har minimeret baggrund ekspression af tetracyclin responsiv promotor endnu mere 43,44. Således kan valget af en tetracyclin-responsiv promotor ske i henhold til de krav eller begrænsninger af den respektive transgen.

Uafhængig af typen af ​​eksperimentelle fremgangsmåde, tæthed af ekspression af målproteinet er vigtig. For eksempel induktion af apoptose med aktiverede former af pro-apoptotiske proteiner fører til celledød, selv når der kun minimale mængder af det respektive målprotein udtrykkes 31-33. Den nødvendige stringens opnås ved tilsætning af en tetracyclin-afhængig transsilencer til den betingede reguleringssystem 30. Det sikrer, at transkription fra den inducerbare promotor aktivt undertrykkes, hvilket er særligt vigtigt, når transiente transfektioner udføres, da de typisk snarere utætte i deres transgenekspression 30. Hvis signalveje, der ikke fremkalder celledød probes kan kravet om strengere regulering af target genekspression være afslappet og inducerbare systemer uden transsilencer kunne bruges som alternativ 43,44.

Den inducerbare regulatoriske system anvendt til at probe signalvejen behøver ikke at være det Tet-systemet. Dens største fordel er, at det har været intensivt anvendt i mammale celler i mere end 20 år nu, og at det er den mest udviklede og bedste lmaracterized inducerbare kontrolsystem. Alligevel er der mindst 25 andre betingede reguleringssystemer 45,46, der kunne anvendes alternativt eller i tillæg til Tet-systemet. To eller tre forskellige inducerbare systemer kan være nyttige probing konvergent signalveje eller til afprøvning redundans af enten målgenet eller proteinet af interesse.

Proceduren præsenteres her bør arbejde med transfektionseffektiviteten som resulterer i en robust og pålidelig udgangssignal fra den respektive signalvej, der probes. Fordi de stabile cellelinjer udtrykke proteinet af interesse i en homogen måde (figur 4B), er alle celler, som er transient transficeret med den inducerbare plasmid, der udtrykker proteinet af interesse probet for interferens af proteinet af interesse med pathway signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Tags

Infektion Apoptose Bax caspase 3, Doxycyclin Effector protein inducerbar ekspression stabil cellelinie Tet-system type IV secerneringssystem
Anvende en Inducerbar Expression System til Studieinformationen Interferens med bakteriel virulensfaktorer med intracellulær signalering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck,… More

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter