Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52903
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

Abstract

A técnica aqui apresentada permite analisar em que o passo a proteína alvo, ou, alternativamente, uma molécula pequena, interage com os componentes de uma via de sinalização. O método baseia-se, por um lado, sobre a expressão indutível de uma proteína específica para iniciar um evento de sinalização a um passo definido e predeterminado na cascata de sinalização seleccionado. Expressão concomitante, por outro lado, do gene de interesse, em seguida, permite que o investigador para avaliar se a actividade da proteína alvo expressa está localizada a montante ou a jusante do evento de sinalização iniciada, de acordo com a leitura da via de sinalização que é obtido. Aqui, a cascata apoptótica foi seleccionado como uma via de sinalização definido para demonstrar a funcionalidade do protocolo. As bactérias patogénicas, tais como, Coxiella burnetii translocar proteínas efectoras que interferem com a indução da morte da célula hospedeira na célula hospedeira para assegurar a sobrevivência na célula bacteriana e para promover a suadisseminação no organismo. A C. proteína efectora burnetii CaeB inibe eficazmente a morte da célula hospedeira após indução da apoptose com luz UV ou com estaurosporina. Para diminuir no qual o passo CaeB interfere com a propagação do sinal apoptótico, as proteínas seleccionadas com actividade pro-apoptótica bem caracterizados foram expressos transitoriamente em forma doxiciclina-indutível. Se CaeB actua a montante destas proteínas, apoptose irá continuar sem obstáculos. Se CaeB actua a jusante, a morte celular é inibida. As proteínas de ensaio seleccionados foram Bax, que actua ao nível das mitocôndrias, e caspase 3, que é a principal protease verdugo. CaeB interfere com a morte celular induzida por expressão da Bax, mas não por caspase 3 expressão. CaeB, assim, interage com a cascata apoptótica entre estas duas proteínas.

Introduction

A virulência de muitos patógenos gram-negativas bactérias depende de sistemas de secreção especializados para seqüestrar células hospedeiras eucarióticas. As bactérias usam estes sistemas de secreção de proteínas para injectar de virulência da bactéria (efectoras) para dentro da célula hospedeira para modular uma variedade de actividades celulares e bioquímicas. O estudo das proteínas efetoras tem não só forneceu notável visão sobre aspectos fundamentais do host / agente patogénico, mas também para a biologia básica das células eucarióticas 1. A modulação da apoptose da célula hospedeira tem sido demonstrado ser um importante mecanismo de virulência para muitos patogénios intracelulares, e uma série de proteínas efectoras que modulam a apoptose foram identificadas 2-9. No entanto, os mecanismos moleculares precisos da actividade permanece indeterminada em muitos casos.

A apoptose, uma forma de morte celular programada, desempenha um papel importante nas respostas imunitárias à infecção de 10. Duas vias principais que conduzem à apoptose têmforam identificados: alvo as mitocôndrias (apoptose intrínseca) ou transdução directa do sinal via receptores de morte celular na membrana plasmática (apoptose extrínseca). A via intrínseca ou mediada por mitocôndrias morte celular é desencadeada por sinais intracelulares e envolve a activação do Bax e Bak, dois membros pró-apoptóticos da família Bcl-2. Esta família está composta por proteínas reguladoras pro- e anti-apoptóticas que controlam a morte celular 11-14. A activação da apoptose conduz a oligomerização de Bax e Bak, seguido por subsequente permeabilização da membrana mitocondrial externa, resultando na libertação do citocromo C para o citoplasma. Liberação do citocromo C inicia a ativação das caspases efetoras 3 e 7 a ativação de caspase 9 no apoptossomo 15. Isto leva à proteólise de substratos seleccionados que, entre outros, resulta na exposição de fosfatidilserina à superfície da célula 16 e liberta um ADNase dedicado que fragmenta chromatin 17,18.

A fim de determinar onde dentro da cascata apoptótica uma proteína efectora indivíduo interfere, um sistema de expressão indutível foi empregado 19. Os sistemas de regulação para a expressão dos transgenes condicionais têm sido uma ferramenta inestimável na análise de função de uma proteína dentro da célula ou a sua importância para o tecido, órgão e desenvolvimento organismo, bem como durante a iniciação, progressão e manutenção de doença 20-23. Tipicamente, sistemas de controlo indutíveis, tais como o sistema Tet 24 empregue aqui, formar uma unidade de transcrição artificial (ver Figura 1). Um componente é um factor de transcrição manipulado artificialmente chamado tTA (dependente da tetraciclina activador da transcrição), formado através da fusão do repressor de transcrição bacteriana TetR 25 a um domínio de proteína de mamífero que medeia a activação da transcrição ou silenciamento 24,26. O segundo componente é um híbridopromotor, denominada TRE (elemento de resposta a tetraciclina), que consiste de um promotor mínimo eucariótica, contendo, pelo menos, uma caixa TATÁ e um local de iniciação da transcrição, juntou-se a repetições múltiplas do local de ligação de ADN cognato para TetR, tetO 24,25. O terceiro componente é o ligando natural de TetR, tetraciclina ou um dos seus derivados, tais como anidrotetraciclina ou doxiciclina 25. Após a adição do ligando para o meio de cultura, TetR perde a sua afinidade para tetO e dissocia-se do TRE. Como resultado, a transcrição do gene alvo é abolida. A expressão de transgenes pode, assim, ser rigorosamente controladas de forma tempo e dependente da dose tanto na cultura de células e em animais 20,23,24. Com tTA, a expressão do transgene ocorre constitutivamente, excepto na presença de uma tetraciclina. Isto pode ser uma desvantagem no estudo de proteínas citotóxicas ou oncogénicas porque tetraciclina primeiro tem de ser removido do sistema, antes do transgene expression ocorre e os efeitos da proteína alvo na célula pode ser monitorado. Isto pode ser demorado e nem sempre é completa, especialmente em animais transgénicos 27. Para resolver esta limitação, um mutante TetR com uma resposta inversa à presença de doxiciclina foi utilizado para gerar um novo factor de transcrição, rtTA (reverso tTA) 28. Só se liga ao TRE e, concomitantemente, activa a transcrição na presença de doxiciclina. Leakiness residual do sistema, isto é., A expressão do transgene, na ausência de factor de transcrição TRE-ligado, originando quer (i) a partir de efeitos de posição a um sítio de integração genómico, (ii) a partir do próprio TRE 29, ou (iii) a partir non espec�ico ligação de tTA / rtTA 28, foi abordado através da introdução de um silenciador da transcrição adicional, denominado TTS (dependente da tetraciclina silenciador da transcrição) 30 para o sistema. Ele forma uma rede dupla juntamente com o regulador rtTA (ver Figura 1).Na ausência de doxiciclina, TTS se liga ao TRE e ativamente encerra qualquer transcrição restante. Na presença de doxiciclina, dissocia-se do TTS TRE e rtTA se liga simultaneamente induzir a expressão do gene alvo. Esta camada adicional de severidade é muitas vezes necessário para expressar proteínas citotóxicas altamente activas 31-34.

Usando este sistema de duplo-regulador rigidamente controlado, a cascata apoptótica pode ser iniciado com um passo definido, que permita a análise de se o dada proteína efectora pode interferir com a indução de apoptose. Este método não só pode ser utilizado para estudar a actividade anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas, mas também para a expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicos, ou para dissecar a interferência com outras vias de sinalização.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produção de linhas celulares estáveis ​​expressando a proteína de interesse

  1. Prepare meios por adição de FCS inactivado por calor e 1% de Penicilina / Estreptomicina a comercialmente disponível Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com GlutaMAX-I, piruvato, e 4,5 g / L de D-Glucose.
  2. Cultivar células HEK293 em meio a 37 ° C em 5% de CO 2. Sub-cultivar células a cada três dias. Remova a mídia e ressuspender as células em 15 ml de meio recente. Pipeta de 1 ml para um novo frasco de cultura de células 2 75 centímetros e adicione 14 ml de mídia.
  3. Analisar o número de células usando um hemocitômetro.
  4. Semente células HEK293 em uma placa de 6 poços a uma densidade de 2 x 10 5 células por cavidade e incubar durante 24 horas.
  5. Para a transfecção utilizar o protocolo fornecido pelo fabricante do reagente de transfecção. Transfectar células com pEGFP-C2 ou pEGFP-C2-CaeB usando o reagente de transfecção. Antes da utilização, aquecer a Reag transfecçãoent e os meios necessários para RT. Usar uma proporção de 3: 1 de reagente de transfecção de ADN.
    1. Em detalhe, pipeta 1,5 ul de reagente de transfecção directamente em 50 uL de meio DMEM isento de soro. Para a formação do complexo, pipetar 0,5 ug de ADN que codifica GFP ou GFP-CaeB à mistura contendo o reagente de transfecção e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
    2. Transfectar as células por adição da mistura reaccional de uma forma gota a gota, e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 24 horas.
  6. Adicionar 1 mg / mL de geneticina para selecção de clones GFP-positiva, a 37 ° C em 5% de CO 2.
  7. Após 6 dias, isolar células individuais por citometria de fluxo de triagem numa placa de 96 poços e abrigando forma HEK293 sobrenadante numa proporção de 1: 1. Gerar HEK293 sobrenadante a partir de células confluentes cultivadas HEK293 que foram centrifugadas durante 15 min a 4966 x g.
  8. No dia seguinte, substituir o meio de cultura com meio contendo 1,50; mg / mL de geneticina. Mudança de mídia uma vez por semana. Se as células formam uma monocamada confluente, transferi-los para uma placa de 24 poços. Sub-cultivar as células duas vezes por semana, numa proporção de 1: 5 em meios contendo 1,5 mg / mL de geneticina. Finalmente, analisar a percentagem de células positivas para GFP por análise de imunotransferência e citometria de fluxo.

2. Análise de linhas celulares estáveis ​​por análise de imunotransferência

  1. Remover o sobrenadante e lavar as células aderentes uma vez com PBS morno. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de amostra Laemmli 2x, o calor durante 5 minutos a 95 ° C e armazenar a -20 ° C.
  2. Carregar cerca de 4 x 10 4 culas por amostra sobre um gel de 12% SDS-PAGE. Além disso, a carga de 6 ul de uma escada de proteínas comercial, tal como um marcador de peso molecular. Geles em um sistema de electroforese em gel de executar sob uma tensão constante de 180 V durante 45-60 min com tampão de corrida 1x Laemmli.
  3. Blot proteínas para membranas de PVDF (diâmetro dos poros de 0.45 uM) a uma voltagem constante de 16 V durante 60 minutos utilizando um Trans-Blot SD célula de transferência semi-seca.
  4. Membranas de bloco em 10 ml de leite seco sem gordura 5% em PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) durante 1 h à TA.
  5. Dilui-se 4 ul de anticorpo anti-GFP em 4 ml de TMF e incubar as membranas o / n a 4 ° C.
  6. Realizar três etapas 10 min de lavagem com 10 ml de PBS / Tween 20 a 0,05%.
  7. Incubar as membranas com 0,8 uL de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano em 4 ml de TMF.
  8. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 2.6) e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar equipamento padrão para o desenvolvimento de filme para visualizar as bandas de proteína.

3. Analisar as células usando um citômetro de fluxo.

  1. Ressuspender as células em PBS. Use células HEK293 como controle negativo para ajustar a frente scatter (FSC) e de dispersão lateral (SSC) de forma que as células estão em escala. Desenhe um portão em células vivas ao excluir dupletos celulares, agregados e restos celulares.
  2. Ajuste o ganho tubo fotomultiplicador (PMT) para que as células não coradas estão na extrema esquerda do histograma do canal FL1 (488 nm laser de argônio).
  3. Para analisar a intensidade de fluorescência de células HEK293-GFP e HEK293-GFP-CaeB abrir o histograma do canal FL1 e adquirir 10.000 eventos na população fechado.
  4. Analisar os dados usando FACS comerciais software de análise.

4. A transfecção da linha de células estável com o sistema de vector de expressão induzível

  1. Semente células HEK293 que expressam estavelmente GFP ou GFP-CaeB numa placa de 12 poços a uma densidade de 1 x 10 5 células / poço.
  2. 19 horas após a semeadura, co-transfectar as células com plasmídeo regulador e plasmídeo resposta ou que codifica Bax ou caspase 3 activada.
    1. Co-transfectar as células HEK293 estáveiscom 100 ng de pWHE125-P plasmídeo regulador (Figura 2) e 100 ng dos plasmídeos de resposta pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (Figura 3) e 0,4 ul de polietilenimina.
    2. Prepara-se o ADN e o reagente de transfecção de polietilenimina em cada 75 uL de meio Opti-MEM e incubar durante exactamente 5 min à temperatura ambiente. Para a formação do complexo, incubar ambas as misturas em conjunto durante 15 minutos à TA.
  3. Adicionar a polietilenimina / ADN solução gota a gota às células e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO 2.

5. Indução de Apoptose

  1. 5 horas após a transfecção, induzir a expressão das proteínas pró-apoptóticas por adição de 1 ug / ml de doxiciclina ao meio de cultura. Incubar as células durante 18 h a 37 ° C em 5% de CO 2.

6. Análise da Célula Hospedeira A apoptose por análise de imunotransferência

  1. Inspecione células antes da harvesting sob o microscópio de luz para verificar se há indução de morte celular. As células apoptóticas são detectáveis ​​pela presença de corpos apoptóticos que rodeiam a célula morrer.
  2. Remover o sobrenadante e lavar as células aderentes uma vez com PBS morno. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de amostra Laemmli 2x, o calor durante 5 minutos a 95 ° C e armazenar a -20 ° C.
  3. Carregar cerca de 4 x 10 4 culas por amostra sobre um gel de 12% SDS-PAGE. Além disso, a carga de 6 ul de uma escada de proteínas comercial, tal como um marcador de peso molecular. Geles em um sistema de electroforese em gel de executar sob uma tensão constante de 180 V durante 45-60 min com tampão de corrida 1x Laemmli.
  4. Proteínas Blot em membranas de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um) a uma voltagem constante de 16 V durante 60 minutos utilizando um Trans-Blot SD célula de transferência semi-seca.
  5. Membranas de bloco em 10 ml de leite seco sem gordura 5% em PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) durante 1 h à TA.
  6. Diluir 4 μl de anticorpo anti-clivada poli ADP-ribose-polimerase (PARP) em 4 ml de TMF e incubar O / N a 4 ° C.
  7. Realizar três etapas 10 min de lavagem com 10 ml de PBS / Tween 20 a 0,05%.
  8. Incubar as membranas com 0,8 rábano anticorpos secundários conjugados com peroxidase ul diluídas em 4 ml MPT.
  9. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7) e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar equipamento padrão para o desenvolvimento de filme para visualizar as bandas de proteína.
  10. Remover anticorpos ligados por 30 minutos de incubação à temperatura ambiente com 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
  11. Após três lavagens com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7), sondar as membranas com 4 ul de anticorpo anti-actina em 4 ml de TMF O / N a 4 ° C.
  12. Depois de três passos de lavagem com MPT (como descrito em 6.7), incubar as membranas com 0,8 ul de hoOs anticorpos secundários conjugados com peroxidase rseradish diluído em 4 ml de TMF.
  13. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7, e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar o equipamento padrão para o desenvolvimento do filme de visualizar as bandas de proteína.
    Nota: Todos os passos de incubação foram realizadas num agitador de placas durante o tempo e temperatura indicada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primeiro, foram estabelecidas linhas de células HEK293 que expressam de forma estável a proteína de interesse (CaeB) como uma proteína de fusão GFP-. Como um controlo, as linhas celulares HEK293 que expressam estavelmente GFP também foram gerados. Expressão de GFP e GFP-CaeB foi verificada por análise de imunotransf erência. A imunotransferência representativo (Figura 4A) demonstra a expressão estável e facilmente detectável de GFP e GFP-CaeB. No entanto, este ensaio não pode determinar se todas as células expressam GFP ou GFP-CaeB. Portanto, as linhas celulares HEK293 transfectadas de forma estável foram também analisadas por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 4B, mais de 90% das células em ambas as linhas celulares expressaram a GFP. Assim, estas linhas de células estáveis ​​pode ser usado para analisar a função de CaeB. No passo seguinte, a actividade anti-apoptótica de CaeB foi ensaiada por análise de imunotransferência utilizando um anticorpo contra a PARP clivada. A clivagem proteolítica da PARP nuclear inactiva a actividade de reparação de ADN e é um marcador típico da termiestágios finais da apoptose. A clivagem de PARP não é detectada em células HEK293-GFP ou células HEK293-GFP-CaeB, demonstrando que nem a expressão de GFP, nem de GFP-CaeB é tóxico para as células. No entanto, quando as células foram tratadas com estaurosporina, um potente indutor da apoptose intrínseca, a clivagem de PARP foi detectada (Figura 5). Importante, células HEK293-GFP-CaeB exibem clivagem de PARP reduzida, indicando a actividade anti-apoptótica do burnetii tipo IV proteína efectora sistema de secreção Coxiella CaeB 7.

Para analisar em que passo CaeB interfere na via apoptótica, o sistema Tet-On foi empregado. Em detalhe, as células HEK293-GFP ou HEK293-GFP-CaeB foram transfectadas com um plasmídeo regulador que expressam constitutivamente um repressor de configuração dupla controlado com doxiciclina / activador (Figura 2) e um plasmídeo que codifica PTRE resposta ou de comprimento total humano Bax ou a forma activada de caspase 3 humano, denominado revCasp 3 (A Figura 3). Este sistema é fortemente regulada, tal como demonstrado pela falta de PARP clivagem sob condições não-indução (Figura 6). A adição de doxiciclina para as células transfectadas resultou na expressão do Bax ou revCasp 3. Se CaeB interfere com a via de apoptose a jusante da Bax, em seguida, o sinal apoptótico gerado por expressão e activação subsequente de Bax deve ser bloqueada por expressão CaeB. De facto, células HEK293 que expressam estavelmente GFP-CaeB profundamente inibir a indução de apoptose por controlada doxiciclina-expressão do Bax, ao passo que as células HEK293-GFP exibida óbvio clivagem de PARP. Este resultado indica que a indução de apoptose a jusante CaeB blocos de activação Bax. Em seguida, foi analisado se CaeB pode interferir com a ativação de caspase 3 - um evento no final da via apoptótica. Células HEK293-GFP, bem como células HEK293-GFP-CaeB, clivagem exibem PARP (Figura 6), indicando que uma vez que a caspase efectora 3 é activated, CaeB não pode impedir a apoptose ocorra. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que actua entre CaeB Bax e caspase 3 activação.

Figura 1
Figura 1. Visão esquemática do sistema regulatório tetraciclina. O sistema Tet-On é composta de dois plasmídeos diferentes, os plasmídeos reguladores e de resposta. O plasmídeo regulador codifica a transsilencer Tet-responsiva (TTS; círculo preenchido) e do Tet-responsivo transactivator reversa (rtTA, círculo aberto). Ambas as proteínas são constitutivamente expressos sob o controlo do forte, constitutivo factor de alongamento 1-alfa promotor (P EF-1a). TTS e rtTA são factores de transcrição quiméricos consistindo de um domínio de regulação da transcrição eucariótica (silenciador ou activador, respectivamente) e um repressor da tetraciclina bacteriana (TetR). TetR medeia a ligação de ADN a sete tet (tetO) sequências no plasmídeo de resposta. TetO está localizado a montante do promotor indutível mínima de citomegalovírus (CMV P), formando em conjunto o elemento de Tet-responsivo (TRE). Em condições não indutoras de, TTS é obrigado a TRE evitar a expressão. Após a adição de doxiciclina (Dox, cheio de diamantes), rtTA interage com Dox levando a mudanças de conformação e ativação. Activado rtTA substitui TTS no plasmídeo resposta, permitindo a transcrição dos genes-alvo respectivo Bax e caspase 3, levando a indução de apoptose e morte celular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Visão esquemática do plasmídeo pWHE125 regulamentar. Elementos essenciais para a propagação no CCBTeria, incluindo uma origem de replicação (ori pBR) e uma cassete de resistência a antibióticos contra ampicilina (Amp R), e para a expressão das Tet-transregulators, tais como o forte, constitutivo imediato promotor / potenciador precoce do citomegalovírus humano (P / E hCMV), um sítio de ligação do ribossoma interno da pólio-vírus (PV-IRES) e um poli-site a partir de vírus Simian 40 (SV40 poliA) são exibidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Visão esquemática do plasmídeo de resposta. Os elementos essenciais para a propagação em bactérias, incluindo uma origem de replicação (ori pBR) e uma cassete de resistência aos antibióticos (Amp R), e para a expressão indutível em eucariotas, tais como o transgene expressina cassete com o promotor Tet-dependente TREtight mínima (P TREtight), o gene de interesse humano Bax (hBax) e um local de poliA de vírus de símio 40 (SV40 poliA), estão representados. A cassete de expressão do transgene é em tandem flanqueada por repetições directas de duas cópias do frango HS4 sequência núcleo isolante (HS4 núcleo). Além disso, uma cassete de resistência G418 consistindo de um murino fosfoglicerato quinase 1 promotor (P mPGK), um gene de resistência à neomicina (G418 R) e um local de poliA humano timidina quinase (TK poliA) está presente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior este valor.

Figura 4
Figura 4. HEK293-GFP e HEK293-GFP-CaeB estavelmente expressam proteínas fluorescentes verdes. (A) Os lisados ​​de células inteiras de células HEK293-GFP eCélulas HEK293-GFP-CaeB foram imunotransferidas para GFP para mostrar a expressão estável. (B) citometria de fluxo Representante (FACS) de HEK293-GFP e células HEK293-GFP-CaeB é mostrado para demonstrar a intensidade da expressão de GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Efeitos da expressão de GFP-CaeB na apoptose induzida por estaurosporina. HEK293-GFP e células HEK293-GFP-CaeB foram tratados com 4 uM estaurosporina durante 6 horas para induzir a apoptose intrínseca. A apoptose foi analisada por análise de imunotransf erência de PARP clivada. PARP clivagem foi reduzida em células HEK293-GFP-CaeB em comparação com células HEK293-GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maiordesta figura.

Figura 6
Figura 6. Uso do sistema de Teton para diminuir o ponto de ação da CaeB. (A) A apoptose foi induzida pela expressão do Bax em HEK293-GFP e células HEK293-GFP-CaeB. A apoptose foi analisada por análise de imunotransf erência de PARP clivada. Clivagem de PARP foi reduzida em células HEK293-GFP-CaeB em comparação com células HEK293-GFP. (B) A apoptose foi induzida por expressão de revCasp 3 em HEK293-GFP e células HEK293-GFP-CaeB. A apoptose foi analisada por análise de imunotransf erência de PARP clivada. PARP clivagem foi comparável em células HEK293-GFP-CaeB e HEK293-GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Muitas bactérias patogénicas abrigar sistemas de secreção para segregar proteínas efectoras ou translocar bacterianas na célula hospedeira. Estas proteínas efectoras têm a capacidade de modular processos e vias na célula hospedeira, permitindo que as bactérias para sobreviver e replicar no respectivo nicho intracelular. Entender as atividades bioquímicas e os mecanismos moleculares das proteínas efetoras contribuirá para um melhor entendimento da patogenia e podem ajudar a desenvolver novas ferramentas terapêuticas para combater a doença. Além disso, como as proteínas efectoras frequentemente exercer a sua função, imitando as actividades de células hospedeiras, que pode também ser utilizado para aprender mais sobre a biologia de células eucarióticas 1. No entanto, o estudo da actividade bioquímica de uma única proteína efectora provou ser complicada por várias razões: 1) de redundância funcional entre proteínas efectoras, 2) a regulação temporal do envolvimento das proteínas efectoras, e 3) o effecproteína tor trabalhando em contexto com uma outra proteína efectora, interferindo com a sua função. Portanto, a actividade de uma proteína efectora é vulgarmente estudada por estudos sobre-expressão. Infelizmente, o uso de sobre-expressão transiente da proteína efectora também tem vários inconvenientes. Assim, apenas os ensaios de análise de célula única pode ser empregue, e a actividade da proteína efectora não pode ser analisado se a actividade da proteína efectora depende da actividade de outra proteína efectora. Para ultrapassar, pelo menos, o primeiro inconveniente, linhas de células estáveis ​​podem ser utilizados. No caso de a expressão da proteína efectora é tóxica para a célula, isto não é apropriado. Neste cenário, as linhas celulares indutíveis estáveis ​​e pode ser estabelecida utilizando um sistema semelhante ao aqui descrito para a expressão transitória de proteínas indutoras da apoptose (ver abaixo). No entanto, os nossos resultados (Figura 5) demonstram que a expressão de CaeB protege as células de apoptose e não é, por conseguinte,tóxico. Há poucas opções na dissecção em que o passo dentro da cascata apoptótica CaeB interfere com a indução de apoptose. Uma possibilidade é o de determinar o parceiro de ligação da célula hospedeira de CaeB. No entanto, este é um grande desafio e a identificação do parceiro de ligação não pode ajudar a explicar o ponto de acção da CaeB dentro da cascata apoptótica. Outra possibilidade é a utilização de diferentes indutores de apoptose, mas CaeB inibe a indução da apoptose por dois indutores de apoptose diferentes, luz UV e estaurosporina 7, indicando que esta abordagem também não pode conduzir à identificação do ponto de acção de CaeB. Outra possibilidade de estreitamento do ponto de acção de CaeB, que foi aqui explorada, é a utilização de um sistema em que a cascata de sinalização de apoptose pode ser induzida em passos definidos.

No caso da expressão da proteína efectora bacteriana que foi escolhida como a proteína de interesse já interfere com a fisiologia celular, seus expreSsion também pode ser colocada sob controlo de um sistema de expressão indutível, por exemplo, tal como o utilizado para expressar a proteína alvo. Em seguida, a expressão de ambos proteína de interesse e da proteína alvo será concomitantemente induzida quando o ligando é adicionado à cultura de células que permite ao investigador para monitorar as células para efeitos diferenciais sobre a fisiologia celular e de saída do sistema de sinalização.

Claramente, expressando uma proteína de interesse e tentar identificar o seu ponto de acção em uma via intracelular específica por expressão induzível de proteínas da via seleccionados funciona melhor se a proteína de interesse interfere com a actividade fisiológica da via seleccionada. Neste caso, a leitura é simplesmente a falta de um sinal normalmente associado com a via, tais como a morte celular no caso de sinalização apoptótica ou de activação da transcrição no caso de sinalização Wnt. Em princípio, as proteínas que activam uma via específica também pode ser sondado com este tipo do sistema de ensaio. Só tem que ser configurado de forma diferente, por exemplo, utilizando a expressão indutível de uma Si / sh / miARN contra uma proteína de via e testar se a proteína de interesse pode resgatar via de sinalização. Em alternativa, os inibidores de moléculas pequenas de proteínas específicas pode ser usado para interromper a transdução de sinal dentro de uma via e, em seguida, para verificar se há resgate por via expressão indutível de uma proteína de interesse. No entanto, este tipo de abordagem será experimentalmente mais desafiador do que o protocolo apresentado acima.

A selecção do gene-alvo a ser detectada no ensaio de interferência é, em princípio, simples. É melhor testar como muitas das proteínas da via de sinalização seleccionado quanto possível para afinar a identificação da proteína do sítio de interesse da interacção com a via. Isto deve ser feito de forma iterativa, porque nem sempre é viável experimentalmente ou mesmo possível monitorar todos Interac potencialção parceiros em um único experimento. Portanto, o melhor é primeiro testar várias proteínas espaçadas uniformemente ao longo de todo o percurso e, em seguida, para refinar a experiência usando a informação obtida na primeira rodada. Em vias de sinalização, muitas proteínas são modificadas pós-tradução, quer por uma modificação covalente, tal como a fosforilação ou sumoilação, ou por um evento de processamento, tal como clivagem proteolítica. Por conseguinte, a respectiva proteína é ou em um estado fundamental ou numa forma activada. Se possível, é melhor para testar as duas formas da proteína, por duas razões. Uma delas é que a forma activada proporciona um sinal de saída superior 31, que apresenta um desafio mais rigorosos para a proteína de interesse. Na nossa prova de princípio exemplo, a sinalização de apoptose, caspase 3 é activado por clivagem proteolítica e a dimerização. Este evento de ativação pode ser simulado artificialmente pelo rearranjo do gene pró-caspase não transformados. A subunidade pequena é colocado artificialmentena frente da subunidade grande e ambos são unidas por um ligante. Este é denominado um "caspase inversa" e representa a forma activada da enzima quando expresso 35. Ele foi escolhido devido ao seu maior grau de atividade. A segunda razão para sondar tanto do estado fundamental e formas activadas de uma via de proteína é porque permite distinguir se a proteína de interesse interfere com a activação da proteína alvo, ou se actua a jusante da proteína na via. No primeiro caso, a morte celular é inibida se a forma do estado fundamental é expresso, mas não se forma activada está presente. No segundo caso, nem a proteína irá conduzir à apoptose. Assim, ambas as formas de testes de uma proteína modificada melhora a resolução do sistema analítico.

Clonagem do gene alvo no vector de expressão indutível requer várias decisões. Em primeiro lugar, deve expressão do gene alvo ocorrem apenas transitoriamente ou é melhor, se o vector é svitavelmente integrado no genoma da linha celular hospedeira? Se apenas for necessária a expressão transiente, um vector simples, tais como pUHC13-3 24, que contém um promotor Tet-dependente e um local poliA, um vector ou bidireccional, tal como PBI-2 ou PBI-3 36, a qual acopla a expressão do gene de interesse para a expressão de um gene repórter para a monitorização fácil da expressão do gene alvo, será suficiente. Se a expressão estável é o preferido, um vector tal como pWHE655 33 (Figura 3) deve ser usado. Ele contém isoladores que flanqueiam a unidade de expressão do transgene para evitar efeitos de posição no local de integração genómica de interferir com a expressão do transgene indutível. Ele também contém uma ligada, mas expresso de forma independente, cassete de resistência de G418 para facilitar a selecção de acontecimentos de integração de vector. O resultado destas modificações é um aumento no número de clones com excelentes propriedades reguladoras 33,37,38. cDNA secias de genes alvo pode ser clonado neste vector, utilizando os locais de restrição únicos para EcoRI e EcoRV 33. A clonagem do vector que expressa o inverso da caspase-3 de ADNc foi descrito em detalhe na referência 33. A clonagem do vector de expressão da Bax humano foi realizada de forma análoga. O ADNc bax humano foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pVenus-Bax 39 usando os oligonucleótidos iniciadores que introduzem os locais de restrição para EcoRI e EcoRV. Após purificação do fragmento de PCR e restrição com as duas enzimas, o fragmento foi ligado com o mesmo modo pWHE655-restritos, originando pWHE655TREtight-Bax. Em segundo lugar, promotor mínimo que é mais apropriada para a expressão do transgene? O promotor mínimo inicial P hCMV * -1 24 exibe alguns leakiness específico do tipo de célula 30, devido em parte à presença de elementos de resposta induzível interferão-α funcionais 29. Isto levou ao desenvolvimento de segunda geração Tet-dependentepromotores, denominado ΔMtetO, TREtight e SG-TRE, com espaçamento alterada e sequências entre os elementos tetO e com diferentes sequências de promotor mínimo 33,40-42. Eles exibem bastante reduzido leakiness na ausência de doxiciclina. Entre estes promotores de segunda geração, ΔMtetO tem o nível mais baixo de expressão do transgene na presença de doxiciclina 33. TREtight medeia um intermediário e SG-TRE o mais alto nível de expressão do transgene 33. Outras modificações têm minimizado expressão do promotor que responde a tetraciclina ainda mais fundo 43,44. Assim, a escolha de um promotor responsivo a tetraciclina-pode ser feita de acordo com os requisitos ou limitações do respectivo transgene.

Independentemente do tipo de abordagem experimental, aperto de expressão da proteína alvo é importante. Por exemplo, a indução da apoptose com formas activadas de proteínas pró-apoptóticas conduz à célulamorte, mesmo quando apenas quantidades mínimas da respectiva proteína alvo são expressos 31-33. O rigor necessário é obtido pela adição de um transsilencer dependente de tetraciclina para o sistema de regulação 30 condicional. Assegura-se que a transcrição a partir do promotor indutível é activamente reprimido, o que é especialmente importante quando se transfecções transientes são realizadas, uma vez que são normalmente bastante permeável na sua expressão do transgene 30. Se vias de sinalização que não induzem a morte celular são sondados, o requisito para a regulação rigorosa da expressão do gene alvo podem ser relaxados e sistemas indutíveis sem transsilencer poderia ser usado alternativamente 43,44.

O sistema regulador indutível utilizado para sondar a via de sinalização não tem de ser o sistema Tet. A sua principal vantagem é que ele tem sido utilizado intensivamente em células de mamífero há mais de 20 anos e que é o mais altamente desenvolvidos e melhor characterized sistema de controlo induzível. No entanto, existem pelo menos 25 outros sistemas reguladoras condicionais 45,46 que podem ser empregues, alternativamente, ou em adição ao sistema de Tet. Dois ou três sistemas indutiveis diferentes pode ser útil no convergente vias de sinalização de sondagem ou para o teste de redundância tanto o gene alvo ou a proteína de interesse.

O procedimento aqui apresentados devem funcionar com a eficiência de transfecção que resultam num sinal de saída robusta e fiável a partir da respectiva via de sinalização que é sondado. Uma vez que as linhas de células estáveis ​​expressar a proteína de interesse de uma forma homogénea (Figura 4B), todas as células que são transfectadas de forma transiente com o plasmídeo de expressão induzível da proteína de interesse são sondadas para a interferência da proteína de interesse com a via de sinalização.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Tags

Infecção Edição 100 apoptose Bax caspase 3, Doxiciclina proteínas efetoras expressão Inducible linha celular estável sistema Tet Tipo IV Secreção Sistema
Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck,… More

Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter