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Immunology and Infection

L'applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52903
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

Abstract

La tecnica qui presentata consente di analizzare in cui il passaggio a proteina bersaglio, o in alternativa una piccola molecola, interagisce con i componenti di un percorso di segnalazione. Il metodo si basa, da un lato, l'espressione inducibile di una proteina specifica per avviare un evento di segnalazione ad un passo definito e predeterminato nella cascata di segnalazione selezionato. Espressione concomitante, invece, del gene di interesse quindi permette al ricercatore di valutare se l'attività della proteina bersaglio espressa si trova a monte oa valle della manifestazione segnalazione avviato, in funzione della lettura del percorso di segnalazione che si ottiene. Qui, la cascata apoptotica è stata selezionata come una via di segnalazione definito per dimostrare la funzionalità del protocollo. I batteri patogeni, come Coxiella burnetii, traslocare proteine ​​effettrici che interferiscono con l'induzione della morte della cellula ospite nella cellula ospite per garantire la sopravvivenza dei batteri nella cella e di promuovere la lorodiffusione nell'organismo. Le C. proteine ​​effettrici burnetii CAEB inibisce efficacemente la morte della cellula ospite dopo l'induzione di apoptosi con luce UV o con staurosporina. Per restringere in cui passo CAEB interferisce con la propagazione del segnale apoptotico, proteine ​​selezionate con ben caratterizzato l'attività pro-apoptotica sono stati espressi transitoriamente in maniera doxiciclina inducibile. Se CAEB agisce a monte di queste proteine, l'apoptosi procederà senza ostacoli. Se CAEB agisce a valle, la morte cellulare sarà inibito. Le proteine ​​di prova prescelti erano Bax, che agisce a livello dei mitocondri e caspasi 3, che è il principale proteasi esecutore. CAEB interferisce con la morte cellulare indotta da espressione Bax, ma non da caspasi 3 espressione. CAEB, pertanto, interagisce con la cascata apoptotica tra queste due proteine.

Introduction

La virulenza di molti batteri patogeni Gram-negativi dipende sistemi di secrezione specializzati di dirottare cellule ospiti eucariotiche. I batteri usano questi sistemi di secrezione di iniettare proteine ​​di virulenza batterica (effettori) nella cellula ospite per modulare una varietà di attività cellulari e biochimici. Lo studio delle proteine ​​effettrici ha fornito non solo straordinario di approfondire alcuni temi fondamentali della ospitanti / patogeno, ma anche nella biologia di base delle cellule eucariotiche 1. Modulazione dell'apoptosi cellula ospite ha dimostrato di essere un meccanismo di virulenza importante per molti patogeni intracellulari, e un certo numero di proteine ​​effettrici modulazione dell'apoptosi sono stati identificati 2-9. Tuttavia, i loro precisi meccanismi molecolari dell'attività rimangono sfuggente in molti casi.

L'apoptosi, una forma di morte cellulare programmata, svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria all'infezione 10. Due vie principali che portano alla apoptosi averestati individuati: mira i mitocondri (apoptosi intrinseca) o trasduzione diretta del segnale tramite i recettori di morte cellulare a livello della membrana plasmatica (apoptosi estrinseca). Il percorso di morte cellulare intrinseca o mitocondri-mediata è innescato da segnali intracellulari e prevede l'attivazione di Bax e Bak, due membri pro-apoptotici della famiglia di Bcl-2. Questa famiglia è composta da proteine ​​regolatore pro- ed anti-apoptotici che controllano la morte cellulare 11-14. Attivazione di apoptosi porta a oligomerizzazione di Bax e Bak seguiti da successiva permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale, con conseguente rilascio del citocromo c nel citoplasma. Rilascio del citocromo C avvia attivazione delle caspasi effettrici 3 e 7, attraverso l'attivazione della caspasi 9 nella apoptosoma 15. Questo porta alla proteolisi di substrati selezionate che, tra l'altro, si traduce nella esposizione della fosfatidilserina sulla superficie cellulare 16 e libera un DNasi dedicato che frammenta chromatin 17,18.

Al fine di determinare se all'interno della cascata apoptotica una proteina effettore individuo interferisce, un sistema di espressione inducibile è stato impiegato 19. I sistemi di regolamentazione per l'espressione condizionale di transgeni sono stati uno strumento prezioso nell'analisi funzione di una proteina all'interno della cellula o la sua importanza per il tessuto, organo e organismo sviluppo, così come durante l'iniziazione, progressione e manutenzione della malattia 20-23. Tipicamente, i sistemi di controllo inducibili, come il sistema Tet 24 impiegato qui, formano una unità di trascrizione artificiale (vedi Figura 1). Un componente è un fattore di trascrizione artificialmente ingegnerizzato chiamato tTA (tetraciclina-dipendente trascrizione attivatore), formata dalla fusione della trascrizione repressore batterico TetR 25 ad un dominio proteine ​​di mammiferi che media l'attivazione trascrizionale o silenziamento 24,26. Il secondo componente è un ibridopromoter, chiamato TRE (elemento tetraciclina-sensibile), costituito da un promotore minimo eucariotico, contenente almeno un TATA-box e un sito inizio della trascrizione, unita a più ripetizioni del sito di legame al DNA cognate per TetR, teto 24,25. Il terzo componente è il ligando naturale TetR, tetraciclina o uno dei suoi derivati, come anhydrotetracycline o doxiciclina 25. Su ligando aggiunta al mezzo di coltura, TetR perde la sua affinità per této e dissocia dal TRE. Come risultato, la trascrizione del gene bersaglio è abolito. Espressione del transgene può, pertanto, essere strettamente controllata in maniera tempo e dose-dipendente sia in coltura cellulare e in animali 20,23,24. Con tTA, espressione del transgene verifica costitutivamente, se non in presenza di tetraciclina. Questo può essere uno svantaggio nello studio delle proteine ​​citotossiche o oncogeniche perché tetraciclina deve prima essere rimosso dal sistema, prima transgene expression verifica e gli effetti della proteina bersaglio sulla cellula può essere monitorato. Questo può richiedere molto tempo e non è sempre completa, soprattutto negli animali transgenici 27. Per affrontare questa limitazione, un mutante TetR con una risposta inversa alla presenza di doxiciclina stato utilizzato per generare un nuovo fattore di trascrizione, rtTA (reverse tTA) 28. Si lega solo al TRE e, contemporaneamente, attiva la trascrizione in presenza di doxiciclina. Leakiness residua del sistema, cioè., L'espressione del transgene in assenza del fattore di trascrizione TRE-bound, originario sia (i) da effetti di posizione in un sito di integrazione genomica, (ii) dal TRE sé 29, o (iii) da non -specific legame di tTA / rtTA 28, è stata affrontata introducendo un silenziatore trascrizionale aggiuntivo, denominato TTS (tetraciclina-dipendente silenziatore trascrizionale) 30 al sistema. Si forma una rete dual regolatore insieme rtTA (vedi Figura 1).In assenza di doxiciclina TTS si lega a TRE e attivamente spegne qualsiasi trascrizione rimanente. In presenza di doxiciclina, TTS dissocia da TRE e rtTA si lega contemporaneamente inducendo l'espressione del gene bersaglio. Questo ulteriore livello di rigorosità è spesso necessario per esprimere proteine ​​citotossiche altamente attivi 31-34.

L'utilizzo di questo sistema a doppia regolazione strettamente controllata, la cascata apoptotica può essere iniziato con una fase definita che consente l'analisi di se la data proteina effettrici può interferire con l'induzione di apoptosi. Questo metodo non può essere utilizzato solo per studiare l'attività anti-apoptotica di proteine ​​effettrici batteriche, ma anche per l'espressione inducibile di proteine ​​pro-apoptotica o tossici, o per dissezione interferenze con altre vie di segnalazione.

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Protocol

1. Generazione di linee cellulari stabili che esprimono la proteina di interesse

  1. Preparare i media con l'aggiunta di FCS inattivato al calore e 1% penicillina / streptomicina per commercialmente disponibile Dulbecco's Modificato (DMEM) supplementato con Glutamax-I, piruvato, e 4,5 g / l D-glucosio.
  2. Coltivare cellule HEK293 in mezzi a 37 ° C in 5% CO 2. Sub-coltivare cellule ogni tre giorni. Rimuovere la carta e sospendere nuovamente le cellule in 15 ml di mezzi freschi. Pipettare 1 ml in un nuovo 75 centimetri a 2 celle pallone di coltura e aggiungere 14 ml media.
  3. Analizzare il numero di cella utilizzando un emocitometro.
  4. Seed HEK293 cellule in un 6-pozzetti ad una densità di 2 x 10 5 cellule per pozzetto e incubare per 24 ore.
  5. Per la trasfezione utilizzare il protocollo fornito dal produttore del reagente di trasfezione. Trasfezione cellule con pEGFP-C2 o pEGFP-C2-CAEB utilizzando il reagente di trasfezione. Prima dell'uso, scaldare la REAG trasfezioneent e il supporto richiesto per RT. Utilizzare un rapporto 3: 1 di reagente di trasfezione di DNA.
    1. Nel dettaglio, pipetta 1,5 ml di reagente di trasfezione direttamente in 50 ml di medio DMEM privo di siero. Per la formazione del complesso, pipettare 0,5 mg di DNA codifica GFP o GFP-Caeb alla miscela reagente contenente trasfezione e incubare per 15 minuti a RT.
    2. Trasfettare cellule aggiungendo alla miscela di reazione in maniera goccia a goccia e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 24 ore.
  6. Aggiungere 1 mg / ml geneticina per la selezione di cloni GFP-positive a 37 ° C in 5% CO 2.
  7. Dopo 6 giorni, isolare le cellule singole mediante citofluorimetria classificare in una piastra a 96 pozzetti ospitare medie e HEK293 supernatante in un rapporto 1: 1. Generare HEK293 supernatante da coltura cellule confluenti HEK293 che sono stati centrifugati per 15 min a 4966 x g.
  8. Il giorno seguente, sostituire terreno di coltura con terreno contenente 1.50; mg / ml geneticina. Modificare i media una volta alla settimana. Se le cellule formano un monostrato confluente, trasferirli ad una piastra da 24 pozzetti. Sub-coltivare cellule due volte alla settimana in un rapporto di 1: 5 in mezzi contenenti 1,5 mg / ml geneticina. Infine, analizzare la percentuale di cellule GFP-positive mediante analisi immunoblot e citometria a flusso.

2. Analisi di linee cellulari stabili di Analisi Immunoblot

  1. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule aderito una volta con caldo PBS. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone campione 2x Laemmli, calore per 5 min a 95 ° C e conservare a -20 ° C.
  2. Caricare circa 4 x 10 4 cellule per campione su un gel SDS-PAGE 12%. Inoltre, carico 6 ml di una scala commerciale proteine ​​come marcatore di peso molecolare. Eseguire gel in un sistema di elettroforesi in gel con una tensione costante di 180 V per 45-60 min con 1x Laemmli tampone di corsa.
  3. Proteine ​​macchia su membrane PVDF (dimensione dei pori di 0.45 micron) ad una tensione costante di 16 V per 60 minuti utilizzando un Trans-Blot SD Semi-Dry Cell Transfer.
  4. Membrane blocchi in 10 ml di latte secco non grasso 5% in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) per 1 ora a RT.
  5. Diluire 4 ml di anticorpo anti-GFP in 4 ml di MPT e incubare le membrane O / N a 4 ° C.
  6. Eseguire tre fasi di lavaggio 10 min con 10 ml di PBS / 0.05% Tween 20.
  7. Incubare membrane con 0,8 ml di anticorpi secondari perossidasi coniugata in 4 ml di MPT.
  8. Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 2.6) e rilevare l'attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare equipaggiamento standard per lo sviluppo di pellicole di visualizzare bande proteiche.

3. Analizzare le cellule utilizzando un citometro di flusso.

  1. Risospendere le cellule in PBS. Utilizzare cellule HEK293 come controllo negativo per regolare in avanti scAtter (FSC) e side scatter (SSC), in modo che le cellule sono in scala. Disegnare un cancello sulla cellule viventi escludendo doppietti cellulari, inerti e detriti cellulari.
  2. Regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) guadagno in modo che le cellule non colorate sono all'estrema sinistra dell'istogramma per il canale FL1 (488 nm laser argon).
  3. Per analizzare l'intensità di fluorescenza delle cellule HEK293-GFP e HEK293-GFP-CAEB aprire l'istogramma del canale FL1 e acquisire 10.000 eventi sulla popolazione recintato.
  4. Analizzare i dati utilizzando FACS commerciali software di analisi.

4. Transfection della linea cellulare stabile con il inducibile Expression System Vector

  1. Cellule HEK293 Seed esprimono stabilmente GFP o GFP-Caeb in un 12-pozzetti ad una densità di 1 x 10 5 cellule / pozzetto.
  2. 19 hr post-semina, co-trasfezione delle cellule con regolatore plasmide e risposta plasmide codificante sia Bax o caspasi attivate 3.
    1. Co-trasfezione le cellule stabili HEK293con 100 ng di pWHE125-P regolatore plasmide (Figura 2) e 100 ng del plasmide risposta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 3) e 0,4 ml di polyethylenimine.
    2. Preparare il DNA e polyethylenimine reagente trasfezione ciascuno in 75 ml di Opti-MEM e incubare per esattamente 5 minuti a temperatura ambiente. Per la formazione del complesso, incubare entrambi miscele insieme per 15 minuti a RT.
  3. Aggiungere la soluzione polyethylenimine / DNA goccia a goccia per le cellule e incubare a 37 ° C in 5% CO 2.

5. induzione di apoptosi

  1. 5 ore dopo la trasfezione, inducono l'espressione delle proteine ​​pro-apoptotiche mediante aggiunta di 1 ug / ml di doxiciclina al terreno di coltura. Incubare le cellule per 18 ore a 37 ° C in 5% CO 2.

6. Analisi della Cell Host Apoptosis da Analysis Immunoblot

  1. Ispezionare le cellule prima di harvesting sotto il microscopio ottico per controllare per l'induzione della morte cellulare. Le cellule apoptotiche sono rilevabili dalla presenza di corpi apoptotici circondano la morte cellulare.
  2. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule aderito una volta con caldo PBS. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone campione 2x Laemmli, calore per 5 min a 95 ° C e conservare a -20 ° C.
  3. Caricare circa 4 x 10 4 cellule per campione su un gel SDS-PAGE 12%. Inoltre, carico 6 ml di una scala commerciale proteine ​​come marcatore di peso molecolare. Eseguire gel in un sistema di elettroforesi in gel con una tensione costante di 180 V per 45-60 min con 1x Laemmli tampone di corsa.
  4. Proteine ​​macchia su membrane PVDF (dimensione dei pori di 0,45 micron) ad una tensione costante di 16 V per 60 minuti con un Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellulare.
  5. Membrane blocchi in 10 ml di latte secco non grasso 5% in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) per 1 ora a RT.
  6. Diluire 4 μl di anticorpo anti-spaccati poli ADP-ribosio polimerasi (PARP) in 4 ml di MPT e incubare O / N a 4 ° C.
  7. Eseguire tre fasi di lavaggio 10 min con 10 ml di PBS / 0.05% Tween 20.
  8. Incubare membrane con 0,8 microlitri rafano perossidasi-coniugato anticorpo secondario diluito in 4 ml MPT.
  9. Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 6.7) e rilevare l'attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare equipaggiamento standard per lo sviluppo di pellicole di visualizzare bande proteiche.
  10. Rimuovere gli anticorpi legati da 30 minuti di incubazione a RT con 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
  11. Dopo tre lavaggi con PBS / Tween 20 0,05% (come descritto in 6.7), sondare le membrane con 4 ml di anticorpo anti-actina in 4 ml di MPT O / N a 4 ° C.
  12. Dopo tre lavaggi con MPT (come descritto in 6.7), incubare le membrane con 0,8 ml di hoanticorpi secondari rseradish perossidasi coniugato diluiti in 4 ml di MPT.
  13. Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 6.7 e rilevare l'attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare attrezzature standard per lo sviluppo della pellicola di visualizzare bande proteiche.
    Nota: Tutte le incubazioni sono state eseguite su un agitatore per il tempo indicato e la temperatura.

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Representative Results

In primo luogo, sono stati stabiliti linee cellulari HEK293 esprimenti stabilmente la proteina di interesse (Caeb) come una proteina di fusione GFP-. Come controllo, sono stati generati anche linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente GFP. L'espressione di GFP e GFP-CAEB è stata verificata mediante analisi immunoblot. L'immunoblot rappresentante (figura 4A) dimostra espressione stabile e chiaramente rilevabile di GFP e GFP-CAEB. Tuttavia, questo test non è in grado di determinare se tutte le cellule esprimono GFP o GFP-CAEB. Pertanto, le linee cellulari HEK293 stabilmente transfettate sono stati analizzati anche mediante citometria a flusso. Come mostrato in Figura 4B, oltre il 90% delle cellule in entrambe le linee cellulari espresso GFP. Così, queste linee cellulari stabili possono essere utilizzati per analizzare ulteriormente la funzione di Caeb. Nella fase successiva, l'attività anti-apoptotica di Caeb è stato analizzato mediante analisi immunoblot usando un anticorpo contro PARP spaccati. Scissione proteolitica di PARP nucleare inattiva attività di riparazione del DNA ed è un indicatore tipico del termile fasi finali del apoptosi. La scissione di PARP non viene rilevato in HEK293-GFP o cellule HEK293-GFP-CAEB, dimostrando che né l'espressione di GFP, nè di GFP-CAEB è tossico per le cellule. Tuttavia, quando le cellule sono state trattate con staurosporina, un potente induttore di apoptosi intrinseca, clivaggio di PARP è stato rilevato (Figura 5). È importante sottolineare che le cellule HEK293-GFP-CAEB mostrare una ridotta scissione di PARP, che indica l'attività anti-apoptotica del Coxiella burnetii tipo IV sistema di secrezione delle proteine ​​effettrici CAEB 7.

Per analizzare a che punto CAEB interferisce con il processo apoptotico, il sistema Tet-On è stato impiegato. In particolare, le cellule HEK293-GFP o HEK293-GFP-Caeb sono state trasfettate con un plasmide che esprime costitutivamente regolatore duplice repressore configurazione doxiciclina controllato / attivatore (figura 2) e una codifica PTRE risposta plasmide sia piena lunghezza Bax umana o forma attivata caspasi 3 umana, definito revCasp 3 (Figura 3). Questo sistema è strettamente regolata, come dimostrato dalla mancanza di PARP sotto non indurre condizioni (Figura 6). L'aggiunta di doxiciclina alle cellule trasfettate portato alla espressione di Bax o revCasp 3. Se Caeb interferisce con la via apoptotica valle di Bax, allora il segnale apoptotico generato dall'espressione e successiva attivazione di Bax deve essere bloccato mediante espressione Caeb. Infatti, le cellule HEK293 che esprimono stabilmente GFP-CAEB profondamente inibiscono l'induzione di apoptosi da espressione Bax doxiciclina controllato, mentre le cellule HEK293-GFP visualizzati evidente PARP scissione. Questo risultato indica che l'induzione Caeb blocchi apoptosi valle dell'attivazione Bax. Successivamente, si è analizzato se CAEB può interferire con l'attivazione della caspasi 3 - un evento in ritardo nel percorso apoptotico. Cellule HEK293-GFP, così come le cellule HEK293-GFP-CAEB, mostre PARP scissione (Figura 6), indicando che una volta che la caspasi effettrici 3 è activated, CAEB non può impedire l'apoptosi si verifichi. Nel loro insieme, questi dati dimostrano che CAEB agisce tra Bax e caspasi 3 attivazione.

Figura 1
Figura 1. Schema del sistema di regolamentazione tetraciclina. Il sistema Tet-On è composto da due plasmidi diversi, i plasmidi di regolamentazione e di risposta. Il plasmide normativo codifica l'transsilencer Tet-reattiva (TTS; cerchio pieno) e la transattivatore inverso Tet-reattiva (rtTA, aperto cerchio). Entrambe le proteine ​​sono costitutivamente espresse sotto il controllo del forte, costitutiva allungamento fattore-1 alfa promotore (P EF-1a). TTS e rtTA sono fattori trascrizionali chimerici costituiti da un dominio eucariotico trascrizionale di regolamentazione (silenziatore o un attivatore, rispettivamente) e un repressore tetraciclina batterica (TetR). TetR media legame al DNA a sette tet (této) sequenze sul plasmide risposta. této si trova a monte del promotore minimo inducibile citomegalovirus (CMV P), insieme formano l'elemento Tet-reattiva (TRE). In condizioni non induce, TTS è destinata a TRE prevenire espressione. Dopo l'aggiunta di doxiciclina (Dox; diamante pieno), rtTA interagisce con Dox che porta a cambiamenti conformazionali e l'attivazione. Attivato rtTA sostituisce TT sul plasmide risposta, consentendo la trascrizione dei geni rispettivo bersaglio Bax e caspasi 3, determinando in tal modo l'induzione di apoptosi e morte cellulare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Schema del plasmide pWHE125 normativo. Elementi essenziali per la propagazione in bacteria, compresa una origine di replicazione (ori PBR) e una cassetta di resistenza antibiotica contro ampicillina (Amp R), e per l'espressione dei Tet-transregulators, come il forte, costitutiva immediato precoce promotore / enhancer del citomegalovirus umano (P / E HCMV), un sito interno ribosoma vincolante da polio-virus (PV-IRES) e un polyA-sito da virus Simian 40 (SV40 polyA) vengono visualizzati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Schema del plasmide risposta. Elementi essenziali per la propagazione in batteri, tra un'origine di replicazione (ori PBR) e una cassetta di resistenza antibiotica (Amp R), e per l'espressione inducibile in eucarioti, come il transgene expressisulla cassetta con il promotore Tet-dipendente minimal TREtight (P TREtight), il gene di interesse umano Bax (hBax) e un sito polyA da virus Simian 40 (SV40 polyA), sono raffigurati. La cassetta di espressione del transgene è affiancato da tandem ripetizioni dirette di due copie del HS4 core sequenza isolante pollo (nucleo HS4). Inoltre, una cassetta di resistenza G418, rappresentati da un murino fosfoglicerato chinasi 1 promoter (P MPGK), una resistenza gene neomicina (G418 R) e di un sito polyA timidina chinasi umana (TK polyA) è presente. Cliccare qui per vedere una versione più grande questa cifra.

Figura 4
Figura 4. HEK293-GFP e HEK293-GFP-CAEB stabilmente esprimono proteine ​​fluorescenti verdi. (A) lisati Whole-cellulari di HEK293-GFP eCellule HEK293-GFP-CAEB sono stati immunoblotted per GFP mostrare espressione stabile. (B) citometria a flusso Rappresentante (FACS) analisi dei HEK293-GFP e le cellule HEK293-GFP-CAEB è mostrato per dimostrare l'intensità dell'espressione GFP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Effetti della espressione di GFP-CAEB sull'apoptosi staurosporina-indotta. HEK293-GFP e le cellule HEK293-GFP-CAEB sono stati trattati con 4 mM staurosporina per 6 ore di indurre apoptosi intrinseco. L'apoptosi è stata analizzata da spaccati analisi PARP immunoblot. PARP scissione è stata ridotta in cellule HEK293-GFP-CAEB rispetto alle cellule HEK293-GFP. Clicca qui per vedere una versione più grandedi questa figura.

Figura 6
Figura 6. L'utilizzo del sistema di Teton a restringere il punto d'azione di CAEB. (A) L'apoptosi è stata indotta dalla espressione di Bax in HEK293-GFP e le cellule HEK293-GFP-CAEB. L'apoptosi è stata analizzata da spaccati analisi PARP immunoblot. PARP scissione è stata ridotta in cellule HEK293-GFP-CAEB rispetto alle cellule HEK293-GFP. (B) L'apoptosi è stata indotta dalla espressione di revCasp 3 in HEK293-GFP e le cellule HEK293-GFP-CAEB. L'apoptosi è stata analizzata da spaccati analisi PARP immunoblot. PARP scissione era paragonabile in cellule HEK293-GFP-CAEB e HEK293-GFP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Molti batteri patogeni porto sistemi di secrezione di secernere o traslocare proteine ​​effettrici batteriche nella cellula ospite. Queste proteine ​​effettrici hanno la capacità di modulare i processi e percorsi nella cellula ospite, permettendo ai batteri di sopravvivere e replicare quanto di rispettiva nicchia intracellulare. Comprendere le attività biochimiche e dei meccanismi molecolari delle proteine ​​effettrici contribuirà ad una migliore comprensione di patogenicità e può aiutare a sviluppare nuovi strumenti terapeutici per combattere le malattie. Inoltre, come le proteine ​​effettrici spesso esercitano la loro funzione imitando le attività della cellula ospite, possono essere utilizzati anche per saperne di più sulla biologia delle cellule eucariotiche 1. Tuttavia, studiando l'attività biochimica di una singola proteina effettore ha dimostrato di essere complicato per vari motivi: 1) ridondanza funzionale tra proteine ​​effettrici, 2) la regolazione temporale di aggancio delle proteine ​​effettrici, e 3) la effecproteine ​​tor lavorare nel contesto con un'altra proteina effettore, interferire con la sua funzione. Pertanto, l'attività di una proteina effettore è comunemente studiato da studi iperespressione. Sfortunatamente, l'utilizzo di sovraespressione transiente della proteina effettore ha anche diversi inconvenienti. Così, solo saggi di analisi singola cellula possono essere impiegati, e l'attività della proteina effettore non possono essere analizzate se l'attività della proteina effettore dipende dall'attività di un'altra proteina effettore. Per superare almeno il primo inconveniente, possono essere utilizzate linee cellulari stabili. Nel caso l'espressione della proteina effettore è tossico per la cellula, questo non è adatto. In questo scenario, linee cellulari stabili e inducibili possono essere stabiliti utilizzando un sistema simile a descriviamo qui per l'espressione transiente di proteine ​​apoptosi induzione (vedere sotto). Tuttavia, i nostri risultati (Figura 5) dimostrano che l'espressione di Caeb protegge le cellule da apoptosi e non è quinditossici. Ci sono alcune opzioni in sezionare in cui passo all'interno della cascata apoptotica CAEB interferisce con l'induzione di apoptosi. Una possibilità è quella di determinare la cellula ospite socio vincolante CAEB. Tuttavia, questo è molto impegnativo e l'identificazione del partner legante potrebbe non aiuta a spiegare il punto di azione del Caeb all'interno della cascata apoptotica. Un'altra possibilità è quella di utilizzare differenti induttori dell'apoptosi, ma Caeb inibisce l'induzione dell'apoptosi da due differenti induttori dell'apoptosi, raggi UV e staurosporina 7, indicando che questo approccio potrebbe anche non portare alla identificazione del punto di azione del Caeb. Un'altra possibilità per circoscrivere il punto di azione di Caeb, che è stato sfruttato qui, è quello di utilizzare un sistema in cui l'apoptosi cascata di segnalazione può essere indotta a passi definiti.

In caso espressione della proteina effettore batterica che è stato selezionato come proteina di interesse interferisce già con fisiologia cellulare, le sue espresfissione può anche essere posto sotto il controllo di un sistema di espressione inducibile, ad esempio, come quello usato per esprimere la proteina bersaglio. Quindi, l'espressione di entrambi proteina di interesse e proteina bersaglio sarà concomitanza indotta quando il legante viene aggiunto alla coltura cellulare che consente al ricercatore di monitorare le cellule per effetti differenziali sulla fisiologia cellulare e di segnalazione di uscita del sistema.

Chiaramente, esprimendo una proteina di interesse e cercando di individuare il punto di azione di una determinata pathway intracellulare mediante espressione inducibile di proteine ​​pathway selezionati funziona meglio se la proteina di interesse interferisce con l'attività fisiologica del percorso selezionato. In questo caso, la lettura è semplicemente la mancanza di un segnale normalmente associato con il percorso, come la morte cellulare in caso di segnale apoptotico o l'attivazione della trascrizione in caso di segnalazione Wnt. In linea di principio, le proteine ​​che attivano un percorso specifico possono anche essere sondati con questo tipo del sistema di test. Si deve solo essere impostato in modo diverso, per esempio, usando l'espressione inducibile di un si / sh / miRNA contro una proteina percorso e testare se la proteina di interesse può salvare percorso di segnalazione. In alternativa, piccole molecole inibitrici di proteine ​​specifiche possono essere usati per interrompere trasduzione del segnale all'interno di un percorso e quindi per controllarne il percorso di ripristino facendo espressione inducibile di una proteina di interesse. Tuttavia, questo tipo di approccio sarà sperimentale più impegnativo rispetto al protocollo di cui sopra.

La selezione del gene bersaglio da tastare nel dosaggio interferenza è, in linea di principio, semplice. È preferibile provare come molte delle proteine ​​nella via di segnalazione selezionato come possibile ottimizzare l'identificazione della proteina del sito di interesse di interazione con il percorso. Questo deve essere fatto in modo iterativo, perché non è sempre sperimentalmente fattibile o possibile controllare tutti i potenziali interacpartner zione in un singolo esperimento. Pertanto, è meglio testare prima diverse proteine ​​distanziate in modo uniforme lungo tutto il percorso e poi per perfezionare l'esperimento utilizzando le informazioni acquisite nel primo turno. In vie di segnalazione, molte proteine ​​vengono modificate post-traduzionale, o da una modificazione covalente, come fosforilazione o sumoylation, o un evento di elaborazione, come ad esempio scissione proteolitica. Di conseguenza, la rispettiva proteina è sia in stato fondamentale o in una forma attivata. Se possibile, è meglio testare entrambe le forme della proteina per due ragioni. Uno è che la forma attivata fornisce un segnale di uscita superiore 31, che presenta una sfida più severo per la proteina di interesse. Nella nostra prova di principio esempio segnale apoptotico, la caspasi 3 viene attivato per scissione proteolitica e dimerizzazione. Questo evento di attivazione può essere simulato artificialmente riorganizzando il non trasformati gene pro-caspasi. La piccola subunità è artificialmente collocatodavanti subunità grande ed entrambi sono uniti da un linker. Questo viene chiamato "caspasi inversa" e rappresenta la forma attiva dell'enzima se espresso 35. È stato scelto per la sua maggiore grado di attività. Il secondo motivo di tastatura sia stato fondamentale e forme attivate di una proteina percorso è perché permette di distinguere se la proteina di interesse interferisce con l'attivazione della proteina bersaglio, o se agisce valle della proteina nella via. Nel primo caso, la morte cellulare sarà inibita se la forma dello stato fondamentale è espresso, ma non se la forma attivata è presente. Nel secondo caso, né proteine ​​porterà ad apoptosi. Così, testare entrambe le forme di una proteina modificata migliora la risoluzione del sistema analitico.

La clonazione del gene bersaglio nel vettore di espressione inducibile richiede diverse decisioni. In primo luogo, è espressione del gene bersaglio avvenire solo transitoriamente o è meglio se il vettore è stably integrato nel genoma della linea cellulare host? Se è richiesta solo espressione transiente, un vettore semplice come pUHC13-3 24, che contiene un promotore Tet-dipendente e un sito polyA, o un vettore bidirezionale come PBI-2 o PBI-3 36, che accoppia l'espressione del gene di interesse per l'espressione di un gene reporter per facilitare il monitoraggio di espressione del gene bersaglio, sarà sufficiente. Se l'espressione stabile si preferisce, deve essere utilizzato un vettore come pWHE655 33 (Figura 3). Contiene isolanti che fiancheggiano l'unità espressione del transgene per evitare gli effetti della posizione del sito di integrazione genomica di interferire con l'espressione del transgene inducibile. Esso contiene anche un legato, ma espresso in maniera indipendente, cassetta di resistenza alla G418 per facilitare la selezione di eventi di integrazione vettoriale. Il risultato netto di queste modifiche è un aumento del numero di cloni con eccellenti proprietà regolatorie 33,37,38. cDNA seconseguenze di geni bersaglio possono essere clonati in questo vettore utilizzando i siti di restrizione unici per EcoRI e EcoRV 33. Clonazione del vettore che esprime il contrario caspasi-3 cDNA è stata descritta in dettaglio con riferimento 33. La clonazione del vettore che esprime Bax umana è stata eseguita in modo analogo. Il cDNA bax umana è stato amplificato mediante PCR dal plasmide pVenus-Bax 39 con primer oligonucleotidi che introducono siti di restrizione per EcoRI e EcoRV. Dopo la purificazione del frammento di PCR e di restrizione con i due enzimi, il frammento è stato ligato con pWHE655 similmente-ristretti, producendo pWHE655TREtight-Bax. In secondo luogo, il quale promotore minimo è il più adatto per l'espressione del transgene? Il promotore minimo originale P HCMV * -1 24 schermi certo tipo cellulare leakiness specifico 30, dovuto in parte alla presenza di funzionali elementi di risposta inducibile-interferone α 29. Questo ha portato allo sviluppo di seconda generazione Tet-dipendentepromotori, chiamati ΔMtetO, TREtight e SG-TRE, con spaziatura alterata e sequenze tra gli elementi Teto e con diverse sequenze minime promotore 33,40-42. Essi mostrano notevolmente ridotto leakiness in assenza di doxiciclina. Tra questi promotori di seconda generazione, ΔMtetO ha il più basso livello di espressione del transgene in presenza di doxiciclina 33. TREtight media intermedio e SG-TRE il massimo livello di espressione del transgene 33. Ulteriori modifiche hanno minimizzato espressione della tetraciclina promotore di risposta ancora più 43,44 sfondo. Così, la scelta di un promotore tetraciclina-sensibile può essere fatto secondo i requisiti o limitazioni del rispettivo transgene.

Indipendentemente dal tipo di approccio sperimentale, la tenuta di espressione della proteina bersaglio è importante. Ad esempio, l'induzione di apoptosi con forme attivate di proteine ​​pro-apoptotici porta alla cellala morte, anche quando gli importi solo minime della rispettiva proteina bersaglio sono espressi 31-33. La stringenza richiesta si ottiene aggiungendo un transsilencer tetraciclina-dipendente al sistema regolamentare condizionale 30. Assicura che la trascrizione dal promotore inducibile è attivamente represso, che è particolarmente importante quando vengono eseguite trasfezioni transienti, dal momento che sono in genere piuttosto che perde nella loro espressione del transgene 30. Se vie di segnalazione che non inducono la morte delle cellule vengono sondate, l'obbligo di una disciplina rigorosa dell'espressione genica di destinazione potrebbe essere sistemi rilassata e inducibile senza transsilencer potrebbe essere utilizzato in alternativa 43,44.

Il sistema normativo inducibile utilizzato per sondare la via di segnalazione non deve essere il sistema Tet. Il suo principale vantaggio è che è stato utilizzato intensamente in cellule di mammifero per più di 20 anni e che è il più altamente sviluppata e meglio chSistema di controllo inducibile aracterized. Tuttavia, ci sono almeno 25 altri sistemi regolatori condizionali 45,46 che potrebbero essere utilizzati in alternativa o in aggiunta al sistema Tet. Due o tre diversi sistemi inducibili potrebbero essere utili per sondare convergenti vie di segnalazione o per testare la ridondanza sia del gene bersaglio o la proteina di interesse.

La procedura qui presentata dovrebbe funzionare con l'efficienza di trasfezione che si traducono in un segnale di uscita robusta e affidabile dal rispettivo percorso di segnalazione che viene controllato. Poiché le linee cellulari stabili esprimono la proteina di interesse in modo omogeneo (Figura 4B), tutte le cellule che sono transitoriamente trasfettate con il plasmide inducibile che esprime la proteina di interesse vengono sondati per interferenza della proteina di interesse con percorso di segnalazione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428

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References

  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

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Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).

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