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Immunology and Infection

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52903
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

Abstract

La técnica presentada aquí permite analizar en qué etapa una proteína diana, o, alternativamente, una molécula pequeña, interactúa con los componentes de una vía de señalización. El método se basa, por un lado, en la expresión inducible de una proteína específica para iniciar un evento de señalización en un paso definido y predeterminado en la cascada de señalización seleccionado. Expresión concomitante, por otro lado, del gen de interés, luego permite al investigador evaluar si la actividad de la proteína diana expresada se encuentra aguas arriba o aguas abajo del evento de señalización iniciada, dependiendo de la lectura de la vía de señalización que se obtiene. Aquí, la cascada apoptótica fue seleccionado como una vía de señalización definido para demostrar la funcionalidad de protocolo. Las bacterias patógenas, tales como Coxiella burnetii, translocación de proteínas efectoras que interfieren con la inducción de la muerte de la célula huésped en la célula huésped para asegurar la supervivencia bacteriana en la célula y para promover sudifusión en el organismo. El C. proteína efectora burnetii CAEB inhibe eficazmente la muerte de la célula huésped después de la inducción de la apoptosis con luz UV o con estaurosporina. Para reducir a la que paso CAEB interfiere con la propagación de la señal apoptótica, proteínas seleccionadas con actividad pro-apoptótica bien caracterizado se expresaron transitoriamente de una manera doxiciclina inducible. Si CAEB actúa aguas arriba de estas proteínas, la apoptosis se procederá sin obstáculos. Si CAEB actúa aguas abajo, se inhibirá la muerte celular. Las proteínas de prueba seleccionadas fueron Bax, que actúa a nivel de la mitocondria, y la caspasa 3, que es la principal proteasa ejecutor. CAEB interfiere con la muerte celular inducida por la expresión de Bax, pero no por la caspasa 3 expresión. CAEB, por lo tanto, interactúa con la cascada apoptótica entre estas dos proteínas.

Introduction

La virulencia de muchos patógenos Gram-negativas bacterias depende de sistemas de secreción especializados para secuestrar células huésped eucariotas. Las bacterias utilizan estos sistemas de secreción para inyectar proteínas de virulencia bacteriana (efectores) en la célula huésped para modular una variedad de actividades celulares y bioquímicos. El estudio de las proteínas efectoras no sólo ha proporcionado notable penetración en los aspectos fundamentales de huésped / patógeno, sino también en la biología básica de las células eucariotas 1. La modulación de la apoptosis de las células huésped ha sido demostrado ser un mecanismo de virulencia importante para muchos patógenos intracelulares, y una serie de proteínas efectoras que modulan la apoptosis se han identificado 2-9. Sin embargo, sus mecanismos moleculares precisos de actividad sigue siendo difícil en muchos casos.

Apoptosis, una forma de muerte celular programada, juega un papel importante en la respuesta inmune a la infección 10. Dos vías principales que conducen a la apoptosis tienenhan identificado: la orientación de la mitocondria (apoptosis intrínseca) o transducción directa de la señal a través de receptores de muerte celular en la membrana plasmática (apoptosis extrínseca). La vía de la muerte celular intrínseca o mediada por mitocondrias se activa por señales intracelulares e implica la activación de Bax y Bak, dos miembros pro-apoptóticos de la familia Bcl-2. Esta familia se compone de proteínas reguladoras pro-y anti-apoptóticos que controlan la muerte celular 11-14. La activación de la apoptosis conduce a la oligomerización de Bax y Bak seguidos por subsiguiente permeabilización de la membrana externa mitocondrial, lo que resulta en la liberación del citocromo C en el citoplasma. La liberación del citocromo C inicia la activación de las caspasas efectoras 3 y 7 a través de la activación de la caspasa 9 en el apoptosome 15. Esto conduce a la proteolisis de sustratos seleccionados que, entre otros, los resultados en la exposición de fosfatidilserina en la superficie celular 16 y libera una DNasa dedicado que fragmenta chromatin 17,18.

Con el fin de determinar dónde dentro de la cascada apoptótica una proteína efectora individuo interfiere, un sistema de expresión inducible se empleó 19. Los sistemas de regulación para la expresión condicional de transgenes han sido una herramienta muy valiosa en el análisis de la función de una proteína dentro de la célula o su importancia para el tejido, órgano y desarrollo del organismo, así como durante la iniciación, progresión y mantenimiento de la enfermedad 20-23. Típicamente, los sistemas de control inducibles, tales como el sistema Tet 24 empleado aquí, forman una unidad de transcripción artificial (véase la Figura 1). Uno de los componentes es un factor de transcripción diseñados artificialmente llamada tTA (activador de la transcripción dependiente de tetraciclina), formado por la fusión del represor de la transcripción bacteriana TetR 25 a un dominio de proteína de mamífero que media la activación transcripcional o silenciar 24,26. El segundo componente es un híbridopromotor, denominado TRE (elemento sensible a la tetraciclina), que consiste en un promotor mínimo eucariota, que contiene al menos una caja TATA y un sitio de iniciación de la transcripción, unido a múltiples repeticiones del sitio de unión al ADN cognado para TetR, tetO 24,25. El tercer componente es el ligando natural de TetR, tetraciclina o uno de sus derivados, tales como anhidrotetraciclina o doxiciclina 25. Después de la adición de ligando al medio de cultivo, TetR pierde su afinidad por tetO y se disocia de la TRE. Como resultado, la transcripción del gen diana es abolida. La expresión del transgen puede, por lo tanto, ser estrechamente controlada de una manera tiempo y dependiente de la dosis, tanto en cultivos celulares y en animales 20,23,24. Con tTA, la expresión del transgen se produce constitutivamente, excepto en la presencia de una tetraciclina. Esto puede ser una desventaja en el estudio de proteínas citotóxicas o oncogénicos porque tetraciclina tiene primero que ser eliminado del sistema, antes de expressio transgénn se produce y los efectos de la proteína diana en la célula puede ser monitoreado. Esto puede llevar mucho tiempo y no siempre es completa, especialmente en animales transgénicos 27. Para abordar esta limitación, se usó un mutante TetR con una respuesta inversa a la presencia de doxiciclina para generar un nuevo factor de transcripción, rtTA (inversa tTA) 28. Sólo se une a la TRE y, concomitantemente, activa la transcripción en presencia de doxiciclina. Leakiness residual del sistema, es decir., La expresión del transgen en ausencia de factor de transcripción unido a la TRE, originando ya sea (i) a partir de los efectos de posición en un sitio de integración genómica, (ii) de la propia TRE 29, o (iii) de la no específico de unión de tTA / rtTA 28, fue abordado mediante la introducción de un silenciador transcripcional adicional, denominado TTS (silenciador transcripcional dependiente de tetraciclina) 30 al sistema. Se forma una red regulador dual junto con rtTA (véase la Figura 1).En ausencia de doxiciclina, TTS se une a TRE y activamente apaga cualquier transcripción restante. En presencia de doxiciclina, TTS se disocia de TRE y ata el rtTA inducir simultáneamente la expresión del gen diana. Esta capa adicional de rigor es a menudo necesario para expresar proteínas citotóxicas altamente activos 31-34.

Usando este sistema de doble regulador estrechamente controlada, la cascada apoptótica puede iniciarse en una etapa definida que permite el análisis de si la proteína efectora dado puede interferir con la inducción de apoptosis. Este método no sólo se puede utilizar para estudiar la actividad anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas sino también para la expresión inducible de proteínas pro-apoptóticas o tóxicos, o para la disección de la interferencia con otras vías de señalización.

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Protocol

1. Generación de líneas celulares estables que expresan la proteína de interés

  1. Preparar los medios de comunicación mediante la adición de FCS inactivado por calor y 1% de penicilina / estreptomicina al comercialmente disponible Dulbecco medio Eagle modificado (DMEM) suplementado con GlutaMAX-I, el piruvato, y 4,5 g / L de D-glucosa.
  2. Cultivar las células HEK293 en medios a 37 ° C en 5% de CO 2. Sub-cultivar células cada tercer día. Retire los medios de comunicación y resuspender las células en 15 ml de medio fresco. Pipeta 1 ml en un nuevo 75 cm 2 frasco de cultivo celular y añadir 14 ml de medio.
  3. Analizar el número de células utilizando un hemocitómetro.
  4. Semilla células HEK293 en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10 5 células por pocillo y se incuban durante 24 horas.
  5. Para la transfección utilizar el protocolo proporcionado por el fabricante del reactivo de transfección. Transfectar células con pEGFP-C2 o pEGFP-C2-CAEB utilizando el reactivo de transfección. Antes de su uso, calentar el reag transfecciónent y los medios necesarios para RT. Utilice una proporción de 3: 1 de reactivo de transfección con el ADN.
    1. En detalle, pipeta 1,5 l de reactivo de transfección directamente en 50 l de medio DMEM libre de suero. Para la formación del complejo, una pipeta 0,5 g de ADN que codifica GFP o GFP-CAEB a la mezcla que contiene el reactivo de la transfección y se incuba durante 15 min a TA.
    2. Transfectar células mediante la adición de la mezcla de reacción de una manera gota a gota y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 24 horas.
  6. Añadir 1 mg / ml de geneticina para la selección de clones GFP-positivas a 37 ° C en 5% de CO 2.
  7. Después de 6 días, aislar células individuales mediante citometría de flujo de clasificación en una placa de 96 pocillos que alberga medio y HEK293 sobrenadante en una relación 1: 1. Generar HEK293 sobrenadante de las células HEK293 confluentes cultivadas que se centrifugaron durante 15 min a 4966 x g.
  8. Al día siguiente, reemplazar medio de cultivo con medio que contiene 1,50; mg / ml de geneticina. Cambie los medios una vez por semana. Si las células forman una monocapa confluente, transferirlos a una placa de 24 pocillos. Sub-cultivar las células dos veces a la semana en una proporción de 1: 5 en medio que contenía 1,5 mg / ml de geneticina. Por último, analizar el porcentaje de células positivas para GFP mediante análisis de inmunotransferencia y citometría de flujo.

2. Análisis de líneas celulares estables mediante análisis de inmunotransferencia

  1. Eliminar el sobrenadante y lavar las células adheridas una vez con PBS caliente. Resuspender las células en 100 l de tampón de muestra 2x Laemmli, el calor durante 5 minutos a 95 ° C y se almacena a -20 ° C.
  2. Cargar aproximadamente 4 x 10 4 células por muestra en un gel de SDS-PAGE 12%. Además, la carga de 6 l de una escalera proteína comercial como un marcador de peso molecular. Ejecutar geles en un sistema de electroforesis en gel en un voltaje constante de 180 V durante 45-60 min con tampón de Laemmli 1x.
  3. Proteínas Blot a membranas de PVDF (tamaño de poro de 0.45 m) a un voltaje constante de 16 V durante 60 min utilizando una célula de transferencia Semi-Dry Trans-Blot SD.
  4. Membranas bloque en 10 ml de leche en polvo desnatada al 5% en PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) para 1 hr a RT.
  5. Diluir 4 l de anticuerpo anti-GFP en 4 ml de MPT e incubar las membranas O / N a 4 ° C.
  6. Realizar tres etapas de lavado 10 min con 10 ml de PBS / 0,05% de Tween 20.
  7. Incubar membranas con 0,8 l de conjugados con peroxidasa de rábano picante anticuerpos secundarios en 4 ml de MPT.
  8. Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 2.6) y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para el desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas.

3. Analizar las células utilizando un citómetro de flujo.

  1. Resuspender las células en PBS. Utilice células HEK293 como control negativo para ajustar hacia adelante scatter (FSC) y dispersión lateral (SSC), de modo que las células están en escala. Dibuja una puerta en las células vivas mediante la exclusión de dobletes de células, agregados y restos celulares.
  2. Ajuste el tubo fotomultiplicador (PMT) de ganancia para que las células no teñidas están en el extremo izquierdo del histograma para el canal FL1 (láser de argón de 488 nm).
  3. Para analizar la intensidad de fluorescencia de las células HEK293-GFP y HEK293-GFP-CAEB abrir el histograma del canal FL1 y adquirir 10.000 eventos en la población cerrada.
  4. Analizar los datos mediante FACS comerciales de software de análisis.

4. La transfección de la línea celular estable con el sistema de vector de expresión inducible

  1. Células de semillas HEK293 que expresan establemente GFP o GFP-CAEB en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1 x 10 5 células / pocillo.
  2. 19 horas después de la siembra, co-transfectar las células con plásmido regulador y plásmido respuesta sea que codifica Bax o caspasa 3 activada.
    1. Co-transfectar las células HEK293 establescon 100 ng de plásmido regulador pWHE125-P (Figura 2) y 100 ng de los plásmidos de respuesta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 3) y 0,4 l de polietilenimina.
    2. Preparar el ADN y reactivo de transfección polietilenimina cada uno en 75 l de medio Opti-MEM e incubar durante exactamente 5 min a TA. Para la formación del complejo, incubar ambas mezclas juntos durante 15 min a TA.
  3. Añadir la solución de polietilenimina / DNA gota a gota a las células y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2.

5. inducción de la apoptosis

  1. 5 horas después de la transfección, inducir la expresión de las proteínas pro-apoptóticas mediante la adición de 1 mg / ml de doxiciclina al medio de cultivo. Se incuban las células durante 18 horas a 37 ° C en 5% de CO 2.

6. Análisis de Host Cell Apoptosis por análisis de inmunotransferencia

  1. Inspeccione las células antes de harvesting bajo el microscopio óptico para comprobar la inducción de muerte celular. Las células apoptóticas son detectable por la presencia de cuerpos apoptóticos que rodea la célula moribunda.
  2. Eliminar el sobrenadante y lavar las células adheridas una vez con PBS caliente. Resuspender las células en 100 l de tampón de muestra 2x Laemmli, el calor durante 5 minutos a 95 ° C y se almacena a -20 ° C.
  3. Cargar aproximadamente 4 x 10 4 células por muestra en un gel de SDS-PAGE 12%. Además, la carga de 6 l de una escalera proteína comercial como un marcador de peso molecular. Ejecutar geles en un sistema de electroforesis en gel en un voltaje constante de 180 V durante 45-60 min con tampón de Laemmli 1x.
  4. Proteínas Blot a membranas de PVDF (tamaño de poro de 0,45 micras) en una tensión constante de 16 V durante 60 minutos usando una célula de transferencia semi-seco Trans-Blot SD.
  5. Membranas bloque en 10 ml de leche en polvo desnatada al 5% en PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) para 1 hr a RT.
  6. Diluir 4 μl de poli anticuerpo anti-escindido ADP-ribosa polimerasa (PARP) en 4 ml de MPT e incubar O / N a 4 ° C.
  7. Realizar tres etapas de lavado 10 min con 10 ml de PBS / 0,05% de Tween 20.
  8. Incubar membranas con 0,8 rábano anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa mu l diluido en 4 ml MPT.
  9. Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7) y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial según el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para el desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas.
  10. Retire anticuerpos unidos por 30 minutos de incubación a temperatura ambiente con 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
  11. Después de tres lavados con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7), sondear las membranas con 4 l de anticuerpo anti-actina en 4 ml de MPT O / N a 4 ° C.
  12. Después de tres etapas de lavado con MPT (como se describe en 6.7), se incuban las membranas con 0,8 l de hoanticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa rseradish diluidas en 4 ml de MPT.
  13. Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7 y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas.
    Nota: Todas las etapas de incubación se realizaron en un agitador de placas durante el tiempo indicado y la temperatura.

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Representative Results

En primer lugar, se establecieron líneas de células HEK293 que expresan establemente la proteína de interés (CAEB) como una proteína GFP-fusión. Como control, también se generaron líneas de células HEK293 que expresan establemente GFP. La expresión de GFP y GFP-CAEB se verificó mediante análisis de inmunotransferencia. El representante de inmunotransferencia (Figura 4A) demuestra la expresión estable y claramente detectable de GFP y GFP-CAEB. Sin embargo, este ensayo no puede determinar si todas las células expresan GFP o GFP-CAEB. Por lo tanto, las líneas de células HEK293 transfectadas de forma estable también se analizaron por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 4B, más del 90% de las células en las dos líneas celulares expresó GFP. Por lo tanto, estas líneas celulares estables pueden utilizarse para analizar más a fondo la función de CAEB. En el siguiente paso, la actividad anti-apoptótica de CAEB se ensayó por análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo contra PARP escindida. La escisión proteolítica de PARP nuclear inactiva la actividad de reparación del ADN y es un marcador típico de la termietapas finales de la apoptosis. La escisión de PARP no se detecta en células HEK293-GFP-CAEB HEK293-GFP o, lo que demuestra que ni la expresión de GFP, ni de GFP-CAEB es tóxico para las células. Sin embargo, cuando las células fueron tratadas con estaurosporina, un potente inductor de la apoptosis intrínseca, la escisión de PARP se detectó (Figura 5). Es importante destacar que, las células HEK293-GFP-CAEB exhiben reducen la escisión de PARP, lo que indica la actividad anti-apoptótica de la burnetii tipo IV proteína efectora sistema de secreción de Coxiella CAEB 7.

Para analizar en qué etapa CAEB interfiere con la vía apoptótica, se empleó el sistema Tet-On. En detalle, las células HEK293-GFP o HEK293-GFP-CAEB fueron transfectadas con un plásmido que expresa constitutivamente un regulador dual represor configuración doxiciclina controlado / activador (Figura 2) y un plásmido que codifica respuesta pTRE ya sea de longitud completa Bax humano o la forma activada de caspasa 3 humana, denominado revCasp 3 (La Figura 3). Este sistema está estrechamente regulada, como se demuestra por la falta de escisión de PARP en condiciones no inducir condiciones (Figura 6). La adición de doxiciclina a las células transfectadas dio como resultado la expresión de Bax o revCasp 3. Si CAEB interfiere con la vía apoptótica aguas abajo de Bax, entonces la señal apoptótica generada por la expresión y la posterior activación de Bax debe ser bloqueado por la expresión CAEB. De hecho, las células HEK293 que expresan establemente GFP-CAEB inhibe profundamente la inducción de apoptosis por Bax expresión doxiciclina controlado, mientras que las células HEK293-GFP muestran PARP división obvia. Este resultado indica que CAEB bloquea la inducción de apoptosis aguas abajo de la activación de Bax. A continuación, se analizó si CAEB puede interferir con la activación de la caspasa 3 - un evento tardío en la vía apoptótica. Células HEK293-GFP, así como células HEK293-GFP-CAEB, escisión de PARP exposición (Figura 6), lo que indica que una vez que la caspasa efectora 3 se Activado, CAEB no puede prevenir la apoptosis que se produzcan. Tomados juntos, estos datos demuestran que CAEB actúa entre Bax y caspasa 3 de activación.

Figura 1
Figura 1. Esquema general del sistema regulatorio de tetraciclina. El sistema Tet-On se compone de dos plásmidos diferentes, los plásmidos de regulación y de respuesta. El plásmido regulador codifica la transsilencer Tet-sensible (TTS; círculo relleno) y el transactivador inverso Tet-sensible (rtTA, círculo abierto). Ambas proteínas se expresan constitutivamente bajo el control de la, constitutiva factor de elongación 1 alfa-promotor fuerte (P EF-1a). TTS y rtTA son factores de transcripción quiméricas que consisten en un dominio regulador transcripcional eucariota (silenciador o activador, respectivamente) y un represor de tetraciclina bacteriano (TetR). TetR media la unión del ADN a siete tet (tetO) secuencias en el plásmido respuesta. TetO está situado aguas arriba del promotor de citomegalovirus mínimo inducible (P CMV), formando el elemento Tet-sensible (TRE). En condiciones no inducir, TTS es obligado a TRE prevención de expresión. Después de la adición de doxiciclina (Dox, diamante lleno), rtTA interactúa con Dox conduce a cambios conformacionales y activación. Activado rtTA reemplaza TTS en el plásmido de respuesta, lo que permite la transcripción de los genes diana respectiva Bax y caspasa 3, lo que conduce a la inducción de la apoptosis y muerte celular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. visión general esquemática del plásmido pWHE125 reguladora. Elementos esenciales para la propagación en el CCBteria, incluyendo un origen de replicación (ori pBR) y un casete de resistencia a los antibióticos contra la ampicilina (Amp R), y para la expresión de los Tet-transregulators, tales como la fuerte, constitutiva inmediata promotor / potenciador temprano del citomegalovirus humano (P / E CMVh), un sitio de unión al ribosoma interno de la polio-virus (PV-IRES) y un poli-sitio desde Simian virus 40 (SV40 poliA) se muestran. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Vista esquemática del plásmido respuesta. Elementos esenciales para la propagación en bacterias, incluyendo un origen de replicación (ori pBR) y un casete de resistencia a los antibióticos (Amp R), y para la expresión inducible en eucariotas, tales como la expressi transgénen casete con el promotor Tet-dependiente mínimo TREtight (P TREtight), el gen de interés humano Bax (hBax) y un sitio poliA de virus Simian 40 (SV40 polyA), se representan. El casete de expresión del transgen está flanqueado por repeticiones directas en tándem de dos copias de la secuencia núcleo aislante HS4 de pollo (núcleo HS4). Además, un casete de resistencia a G418 que consiste en un murino fosfoglicerato quinasa 1 promotor (P mPGK), un gen de resistencia a la neomicina (G418 R) y un sitio de poli timidina quinasa humana (TK poli A) está presente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. HEK293-GFP y HEK293-GFP-CAEB expresan establemente proteínas fluorescentes verdes. (A) lisados ​​de células enteras de HEK293-GFP yCélulas HEK293-GFP-CAEB se inmunotransfirieron para GFP para mostrar la expresión estable. (B) citometría de flujo Representante (FACS) el análisis de las células HEK293-GFP-CAEB HEK293-GFP y se muestra para demostrar la intensidad de la expresión de GFP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Efectos de la expresión de GFP-CAEB en células HEK293-GFP-CAEB apoptosis inducida por estaurosporina. HEK293-GFP y se trataron con 4 M estaurosporina durante 6 horas para inducir la apoptosis intrínseca. La apoptosis se analizó mediante análisis de inmunotransferencia PARP escindido. PARP división se redujo en células HEK293-GFP-CAEB en comparación con las células HEK293-GFP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grandede esta cifra.

Figura 6
Figura 6. Uso del sistema de Teton a reducir el punto de acción de CAEB. (A) La apoptosis fue inducida por la expresión de Bax en células HEK293-GFP-CAEB HEK293-GFP y. La apoptosis se analizó mediante análisis de inmunotransferencia PARP escindido. De escisión de PARP se redujo en células HEK293-GFP-CAEB en comparación con las células HEK293-GFP. (B) La apoptosis fue inducida por la expresión de revCasp 3 en células HEK293-GFP-CAEB HEK293-GFP y. La apoptosis se analizó mediante análisis de inmunotransferencia PARP escindido. PARP división fue comparable en células HEK293-GFP-CAEB y HEK293-GFP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Muchas bacterias patógenas albergan sistemas de secreción para secretar o translocar proteínas efectoras bacterianas en la célula huésped. Estas proteínas efectoras tienen la capacidad de modular los procesos y vías en la célula huésped, permitiendo que las bacterias para sobrevivir y replicarse dentro de su respectivo nicho intracelular. La comprensión de las actividades bioquímicas y los mecanismos moleculares de las proteínas efectoras ayudará a una mejor comprensión de la patogenicidad y puede ayudar a desarrollar nuevas herramientas terapéuticas para combatir la enfermedad. Además, como las proteínas efectoras con frecuencia ejercen su función mediante la imitación de las actividades de la célula huésped, también pueden ser utilizados para obtener más información sobre la biología de las células eucariotas 1. Sin embargo, el estudio de la actividad bioquímica de una sola proteína efectora ha demostrado ser complicado por varias razones: 1) la redundancia funcional entre las proteínas efectoras, 2) la regulación temporal de la participación de las proteínas efectoras, y 3) la EFFECproteína tor de trabajo en el contexto de otra proteína efectora, interferir con su función. Por lo tanto, la actividad de una proteína efectora se estudia comúnmente por los estudios de sobreexpresión. Desafortunadamente, el uso de la sobreexpresión transitoria de la proteína efectora también tiene varios inconvenientes. Por lo tanto, sólo los ensayos de análisis de células individuales se pueden emplear, y la actividad de la proteína efectora no se pueden analizar si la actividad de la proteína efectora depende de la actividad de otra proteína efectora. Para superar al menos el primer inconveniente, se pueden utilizar líneas celulares estables. En caso de que la expresión de la proteína efectora es tóxico para la célula, esto no es adecuado. En este escenario, las líneas celulares estables e inducibles se pueden establecer usando un sistema similar como se describe aquí para la expresión transitoria de las proteínas inductoras de apoptosis (ver abajo). Sin embargo, nuestros resultados (Figura 5) demuestran que la expresión de CAEB protege las células de la apoptosis y por lo tanto no estóxico. Hay algunas opciones en la disección a la que paso dentro de la cascada apoptótica CAEB interfiere con la inducción de la apoptosis. Una posibilidad es determinar la pareja de unión de la célula huésped de CAEB. Sin embargo, esto es muy difícil y la identificación de la pareja de unión no podría ayudar a explicar el punto de acción de CAEB dentro de la cascada apoptótica. Otra posibilidad es utilizar diferentes inductores de apoptosis, pero CAEB inhibe la inducción de la apoptosis por dos inductores de apoptosis diferentes, luz UV y estaurosporina 7, lo que indica que este enfoque también podría no conducir a la identificación del punto de acción de CAEB. Otra posibilidad en la reducción a el punto de acción de CAEB, que fue explotada aquí, es utilizar un sistema en el que la cascada de señalización de apoptosis puede ser inducida en pasos definidos.

En caso de que la expresión de la proteína efectora bacteriana que se seleccionó como proteína de interés ya interfiere con la fisiología celular, sus expresión también se puede colocar bajo el control de un sistema de expresión inducible, por ejemplo, como el que se utiliza para expresar la proteína diana. Entonces, la expresión de tanto proteína de interés y la proteína objetivo se indujo de forma concomitante cuando se añade el ligando para el cultivo de células permitiendo que el investigador para supervisar las células para efectos diferenciales sobre la fisiología celular y la señalización de salida del sistema.

Claramente, la expresión de una proteína de interés y tratar de identificar su punto de acción en una vía intracelular específica por la expresión inducible de proteínas de la vía seleccionados funciona mejor si la proteína de interés interfiere con la actividad fisiológica de la vía seleccionada. En este caso, la lectura es simplemente la falta de una señal que normalmente se asocian con la vía, tal como la muerte celular en el caso de la señalización de apoptosis o activación de la transcripción en el caso de la señalización de Wnt. En principio, las proteínas que activan una vía específica también se pueden probaron con este tipo de sistema de ensayo. Sólo tiene que configurar de forma diferente, por ejemplo, el uso de la expresión inducible de un si / sh / miARN contra una proteína de la ruta y probar si la proteína de interés puede rescatar a la señalización de la vía. Alternativamente, inhibidores de molécula pequeña de las proteínas específicas se pueden utilizar para interrumpir la transducción de señal dentro de una vía y luego para comprobar para el rescate vía por la expresión inducible de una proteína de interés. Sin embargo, este tipo de enfoque será experimentalmente más difícil que el protocolo presentado anteriormente.

La selección del gen diana a palpar en el ensayo de interferencia es, en principio, sencillo. Lo mejor es poner a prueba como muchas de las proteínas en la vía de señalización seleccionado como sea posible para afinar la identificación de la proteína del sitio de interés de la interacción con la vía. Esto debe hacerse de forma iterativa, porque no siempre es factible experimentalmente o incluso posible controlar toda interacción potencialsocios ción en un solo experimento. Por lo tanto, lo mejor es probar primero varias proteínas espaciados uniformemente a lo largo de toda la vía y luego refinar el experimento utilizando la información obtenida en la primera vuelta. En las vías de señalización, muchas proteínas se modifican después de la traducción, ya sea mediante una modificación covalente, tal como fosforilación o sumoylation, o por un evento de procesamiento, tales como escisión proteolítica. En consecuencia, la proteína respectiva es ya sea en un estado fundamental o en una forma activada. Si es posible, lo mejor es probar ambas formas de la proteína, por dos razones. Una es que la forma activada suministra una señal de salida más alto 31, que presenta un desafío más estrictas para la proteína de interés. En nuestra prueba de principio de ejemplo, la señalización de apoptosis, la caspasa 3 se activa por escisión proteolítica y la dimerización. Este evento de activación se puede simular artificialmente por la reordenación del gen pro-caspasa sin procesar. La subunidad pequeña se coloca artificialmenteen frente de la subunidad grande y ambos están unidos por un enlazador. Esto se denomina un "caspasa inversa" y representa la forma activada de la enzima cuando se expresa 35. Fue elegido debido a su mayor grado de actividad. La segunda razón para el sondeo tanto del estado fundamental y formas activadas de una proteína de la ruta es debido a que permite distinguir si la proteína de interés interfiere con la activación de la proteína diana, o si actúa aguas abajo de la proteína en la vía. En el primer caso, la muerte celular se inhibe si la forma del estado fundamental se expresa, pero no si la forma activada está presente. En el segundo caso, ni proteínas dará lugar a la apoptosis. Por lo tanto, las pruebas de ambas formas de una proteína modificada mejora la resolución del sistema analítico.

Clonación del gen diana en el vector de expresión inducible requiere varias decisiones. En primer lugar, será la expresión del gen diana sólo se producen de forma transitoria o es mejor si el vector es stablemente integrado en el genoma de la línea celular huésped? Si sólo se requiere la expresión transitoria, un vector simple tal como pUHC13-3 24, que contiene un promotor Tet-dependiente y un sitio poliA, o un vector bidireccional tal como PBI-2 o PBI-3 36, que acopla la expresión del gen de interés para la expresión de un gen indicador para el seguimiento más fácil de expresión del gen diana, será suficiente. Si se prefiere la expresión estable, se debe utilizar un vector tal como pWHE655 33 (Figura 3). Contiene aislantes que flanquean la unidad de expresión del transgén para evitar los efectos de posición en el sitio de integración genómica de interferir con la expresión del transgén inducible. También contiene una ligados, pero expresaron de manera independiente, casete de resistencia a G418 para facilitar la selección de eventos de integración del vector. El resultado neto de estas modificaciones es un aumento en el número de clones con excelentes propiedades reguladoras 33,37,38. cDNA sesecuencias de genes diana pueden clonarse en este vector mediante el uso de los sitios de restricción únicos para EcoRI y EcoRV 33. Clonación del vector que expresa el reverso de la caspasa-3 ADNc se describe en detalle en referencia 33. Clonación del vector de expresión de Bax humano se realizó de forma análoga. El ADNc bax humano se amplificó por PCR a partir del plásmido pVenus-Bax 39 usando cebadores de oligonucleótidos que introducen sitios de restricción para EcoRI y EcoRV. Después de la purificación del fragmento de PCR y restricción con las dos enzimas, el fragmento se ligó con pWHE655 asimismo restringidos, produciendo pWHE655TREtight-Bax. En segundo lugar, el cual promotor mínimo es el más apropiado para la expresión transgénica? El promotor mínimo inicial P CMVh * -1 24 muestra algunos exudación células específicas del tipo 30, debido en parte a la presencia de elementos de respuesta inducible interferón-α funcionales 29. Esto condujo al desarrollo de la segunda generación Tet-dependientepromotores, denominados ΔMtetO, TREtight y SG-TRE, con una separación alterado y secuencias entre los elementos teto y con diferentes secuencias promotoras mínimas 33,40-42. En ellas se muestran reducen considerablemente leakiness en ausencia de doxiciclina. Entre estos promotores segunda generación, ΔMtetO tiene el nivel de expresión del transgen más bajo en presencia de doxiciclina 33. TREtight media de un compuesto intermedio y SG-TRE el más alto nivel de expresión de los transgenes 33. Otras modificaciones han minimizado fondo expresión del promotor sensible a tetraciclina aún más 43,44. Por lo tanto, la elección de un promotor sensible a la tetraciclina se puede hacer de acuerdo con los requisitos o las limitaciones de la respectiva transgén.

Independiente del tipo de enfoque experimental, opresión de la expresión de la proteína diana es importante. Por ejemplo, la inducción de apoptosis con formas activadas de las proteínas pro-apoptóticas conduce a la célulamuerte, incluso cuando sólo cantidades mínimas de la respectiva proteína diana se expresan 31-33. El rigor requerido se logra mediante la adición de un transsilencer dependiente de tetraciclina para el sistema de regulación condicional 30. Se asegura que la transcripción a partir del promotor inducible se reprime activamente, lo que es especialmente importante cuando se realizan transfecciones transitorias, ya que son típicamente más bien que gotea en su expresión de los transgenes 30. Si se sondean las vías de señalización que no inducen la muerte celular, el requisito para la regulación estricta de la expresión del gen diana puede ser relajadas y sistemas inducibles sin un transsilencer podría ser utilizado alternativamente 43,44.

El sistema regulador inducible utilizado para sondear la vía de señalización no tiene que ser el sistema Tet. Su principal ventaja es que se ha usado intensivamente en células de mamífero durante más de 20 años y que es el más desarrollado y mejor chsistema de control inducible aracterized. Sin embargo, hay al menos otros 25 sistemas de regulación condicionales 45,46 que se podrían emplear alternativamente, o además de el sistema Tet. Dos o tres sistemas inducibles diferentes podrían ser útiles en el sondeo convergente vías de señalización o para probar la redundancia de ya sea el gen diana o la proteína de interés.

El procedimiento presentado aquí debe trabajar con eficiencias de transfección que resultan en una señal de salida robusto y fiable de la vía de señalización respectiva que se sondeó. Debido a que las líneas celulares estables expresan la proteína de interés de una manera homogénea (Figura 4B), todas las células que son transfectadas transitoriamente con el plásmido inducible que expresa la proteína de interés se probaron para la interferencia de la proteína de interés con la señalización de vía.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428

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La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular
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Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).

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