Abstract
הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת לנתח שבצעד חלבון מטרה, או לחלופין מולקולה קטנה, אינטראקציה עם הרכיבים של מסלול איתות. השיטה מבוססת, מצד האחד, על הביטוי מושרה של חלבון ספציפי ליזום אירוע איתות בצעד שהוגדר מראש ובמפל האיתות נבחר. ביטוי בד בבד, ומצד שני, של הגן של עניין לאחר מכן מאפשר לחוקר להעריך אם הפעילות של חלבון המטרה הביע ממוקמת במעלה הזרם או במורד הזרם של אירוע איתות יזם, בהתאם את ההודעה של מסלול האיתות שמתקבל. הנה, המפל אפופטוטיים נבחר כמסלול איתות מוגדר להפגין פונקציונלי פרוטוקול. חיידקים פתוגניים, כגון burnetii Coxiella, translocate חלבוני מפעיל שמפריעים לאינדוקצית מות תא מארח בתא המארח כדי להבטיח את הישרדות חיידקים בתא ולקדמםהפצה באורגניזם. ג חלבון מפעיל burnetii CaeB מעכב ביעילות מוות של תאי מארח לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס עם UV-אור או עם staurosporine. כדי לצמצם את הצעד שבי CaeB מפריע להתפשטות של האות אפופטוטיים, חלבונים שנבחרו בפעילות פרו-אפופטוטיים מאופיינת היטב לידי ביטוי באופן זמני דוקסיציקלין והעין מתנהלת. אם CaeB פועל במעלה הזרם של חלבונים אלה, אפופטוזיס ימשיך ללא הפרעה. אם CaeB פועל במורד הזרם, מוות של תאים יהיה מעוכב. חלבוני הבדיקה שנבחרו היו באקס, הפועל ברמה של המיטוכונדריה, וcaspase 3, המהווה את פרוטאז התליין הגדול. CaeB מפריע למוות של תאים הנגרם על ידי ביטוי באקס, אך לא על ידי caspase 3 ביטוי. CaeB, ובכך, אינטראקציה עם המפל אפופטוטיים בין שני החלבונים האלה.
Introduction
האלימות של חיידקים פתוגנים גראם שלילי רבים תלויה במערכות הפרשה מיוחדות לחטוף תאי מארח האיקריוטים. חיידקים משתמשים במערכות הפרשה אלה להזריק חלבוני חיידקים ארסי (effectors) לתא המארח כדי לווסת את מגוון פעילויות סלולריות וביוכימיים. המחקר של חלבוני מפעיל לא רק סיפק תובנה מדהימה להיבטים בסיסיים של מארח / אינטראקציות הפתוגן אלא גם לביולוגיה הבסיסית של תאים האיקריוטים 1. אפנון של אפופטוזיס תא המארח הוכח להיות מנגנון ארסיות חשוב עבור רבים פתוגנים תאיים, ומספר חלבוני מפעיל ויסות אפופטוזיס זוהה 2-9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים פעילותם להישאר חמקמקים במקרים רבים.
אפופטוזיס, צורה של מות תא, ממלא תפקיד חשוב בתגובה חיסונית לזיהום 10. יש שני מסלולים עיקריים שמוביל לאפופטוזיסזוהה: מיקוד מיטוכונדריה (אפופטוזיס הפנימי) או התמרה ישירה של האות באמצעות קולטני מוות של תאים בקרום הפלזמה (אפופטוזיס החיצוני). המסלול הפנימי או בתיווך מיטוכונדריה המוות של תאים מופעל על ידי אותות תאיים וכרוך בהפעלה של Bax ובק, שני חברים פרו-אפופטוטיים של משפחת Bcl-2. משפחה זה מורכב מחלבוני רגולטור בעד ונגד אפופטוטיים ששולטים תא מוות 11-14. הפעלה של אפופטוזיס מובילה לoligomerization של Bax ובק ואחריו permeabilization הבא של הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, וכתוצאה מכך שחרור ציטוכרום C לתוך הציטופלסמה. שחרור ציטוכרום C יוזם הפעלה של caspases מפעיל 3 ו -7 באמצעות הפעלה של caspase 9 בapoptosome 15. זה מוביל לproteolysis של מצעים נבחרו ש, בין יתר, בתוצאות החשיפה של phosphatidylserine על פני תא 16 ומשחרר DNase ייעודי שברי פרקromatin 17,18.
כדי לקבוע היכן בתוך המפל אפופטוטיים חלבון מפעיל בודד מפריע, מערכת ביטוי מושרה הועסקה 19. מערכות רגולטוריות לביטוי מותנה של transgenes היו כלי רב ערך בניתוח הפונקציה של חלבון בתוך התא או חשיבותו לרקמות, איברים ופיתוח גוף, כמו גם בייזום, התקדמות ותחזוקה של המחלה 20-23. בדרך כלל, מערכות בקרה מושרה, כגון מערכת ט '24 מועסקים כאן, יוצרות יחידת שעתוק מלאכותית (ראה איור 1). מרכיב אחד הוא גורם מהונדס באופן מלאכותי שעתוק נקרא TTA (activator תעתיק טטרציקלין תלוי), שהוקם על ידי מיזוג של מדכאי שעתוק חיידקי TetR 25 לתחום חלבון יונקים שמתווך הפעלת תעתיק או השתקת 24,26. המרכיב השני הוא היברידיאמרגן, כינה TRE (אלמנט טטרציקלין מגיב), בהיקף של אמרגן מינימאלי אוקריוטים, המכיל לפחות TATA-תיבה ואתר ייזום שעתוק, הצטרף לחזרות מרובות של אתר ה- DNA מחייבת אותו המקור לTetR, TETO 24,25. המרכיב השלישי הוא יגנד הטבעי של TetR, טטרציקלין או אחד מנגזרותיו, כגון anhydrotetracycline או דוקסיציקלין 25. עם בנוסף ליגנד למדיום התרבות, TetR מאבד זיקתה לTETO ומנתק מTRE. כתוצאה מכך, שעתוק של גן המטרה הוא בוטל. ביטוי transgene יכול, ובכך, להיות מבוקר היטב באופן זמן ותלוי-מינון בשתי תרבית התאים ובחיות 20,23,24. עם TTA, ביטוי transgene מתרחש constitutively, אלא בנוכחות של טטרציקלין. זה יכול להיות חסרון בחקר חלבונים רעילים לתאים סרטניים או בגלל טטרציקלין יש ראשון שהוסר מהמערכת, לפני שהשתקף transgenen מתרחש וניתן לנטר את ההשפעות של חלבון המטרה בתא. זה יכול להיות זמן רב ולא תמיד מלא, במיוחד בבעלי חיים מהונדסים 27. כדי לטפל במגבלה זו, מוטציה TetR עם תגובה הפוכה לנוכחות של דוקסיציקלין שימשה כדי ליצור גורם שעתוק חדש, rtTA (הפוך TTA) 28. זה רק נקשר לTRE ו, במקביל, מפעיל שעתוק בנוכחות דוקסיציקלין. דליפות שייר של המערכת, כלומר., ביטוי transgene בהעדר גורם שעתוק קשור-TRE, שמקורו גם (i) מהשפעות עמדה באתר אינטגרציה הגנומי, (ii) מTRE עצמו 29, או (iii) שמאינו -specific מחייב של TTA / 28 rtTA, היה ממוען על ידי החדרת משתיק תעתיק נוסף, כינה TTS (משתיק קול תעתיק טטרציקלין תלוי) 30 למערכת. הוא יוצר רשת רגולטור כפולה יחד עם rtTA (ראה איור 1).בהעדר דוקסיציקלין, TTS נקשר לTRE ופעיל כיבוי כל שעתוק שנותר. בנוכחות של דוקסיציקלין, TTS dissociates מTRE וrtTA נקשר בו זמנית גרימת ביטוי של גן המטרה. שכבה נוספת זו של החמרה לעתים קרובות יש צורך לבטא את החלבונים רעילים לתאים פעילים מאוד 31-34.
שימוש במערכת כפול רגולטור לפיקוח הדוק זה, המפל אפופטוטיים יכול להיות יזם בצעד שהוגדר מאפשר ניתוח של האם חלבון מפעיל נתון יכול להפריע אינדוקציה אפופטוזיס. שיטה זו יכולה לא רק לשמש כדי לחקור את הפעילות האנטי-אפופטוטיים של חלבוני מפעיל חיידקים, אלא גם לביטוי מושרה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לנתח הפרעה למסלולי איתות אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דור של שורות תאי יציבות המבטאות את החלבון של ריבית
- הכן תקשורת על ידי הוספת FCS מומת חום ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין למסחרי Dulbecco's זמין השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת Glutamax-אני, פירובט, ו -4.5 ג '/ D-גלוקוז L.
- לטפח HEK293 תאים בתקשורת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. תת לטפח תאים בכל יום שלישי. הסר את המדיה וresuspend התאים 15 מיליליטר תקשורת טרי. פיפטה 1 מיליליטר לתוך בקבוק 2 תאים חדש 75 סנטימטרים תרבות ולהוסיף 14 מיליליטר תקשורת.
- לנתח את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
- תאי זרע HEK293 בצלחת 6-גם בצפיפות של 2 x 10 5 תאים לכל היטב דגירה במשך 24 שעות.
- עבור transfection משתמש בפרוטוקול המסופק על ידי היצרן של מגיב transfection. Transfect תאים עם pEGFP-C2 או pEGFP-C2-CaeB באמצעות מגיב transfection. לפני שימוש, לחמם את reag transfectionאף אוזן גרון והתקשורת הנדרשת לRT. השתמש יחס 3: 1 של מגיב transfection ל- DNA.
- בפירוט, פיפטה 1.5 μl של מגיב transfection ישירות לתוך 50 μl של מדיום סרום ללא DMEM. ליצירה מורכבת, פיפטה 0.5 מיקרוגרם של ה- GFP DNA קידוד או GFP-CaeB לתערובת המכיל מגיב transfection דגירה במשך 15 דקות ב RT.
- Transfect תאים על ידי הוספת תערובת התגובה באופן טיפה חכמה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 24 שעות.
- להוסיף 1 מ"ג / מיליליטר geneticin לבחירה של שיבוטים GFP חיובי על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- לאחר 6 ימים, בודד תאים בודדים על ידי cytometry זרימת מיון בצלחת 96-היטב מחסה בינונית וsupernatant HEK293 ביחס של 1: 1. צור supernatant HEK293 מתאי ומחוברות HEK293 תרבותיים שcentrifuged במשך 15 דקות ב4966 x גרם.
- ביום הבא, להחליף בינוני תרבות עם מדיום המכיל 1.50; מ"ג / מיליליטר geneticin. שינוי תקשורת פעם בשבוע. אם התאים בצורת monolayer ומחוברות, להעביר אותם לצלחת 24 גם. תת לטפח תאים פעמיים בשבוע ביחס של 1: 5 במדיה המכיל 1.5 מ"ג / מיליליטר geneticin. לבסוף, לנתח את אחוז תאי GFP החיובי על ידי ניתוח immunoblot וcytometry זרימה.
2. ניתוח של שורות תאי יציבות על ידי ניתוח immunoblot
- הסר את supernatant ולשטוף את התאים דבקו פעם עם PBS החם. Resuspend התאים של חיץ מדגם Laemmli 2x, חום 100 μl במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחסן ב -20 ° C.
- לטעון כ 4 x 10 4 תאים לדגימה על 12% ג'ל SDS-עמוד. בנוסף, עומס 6 μl של סולם חלבון מסחרי כסמן משקל מולקולרי. הפעל ג'לי במערכת ג'ל אלקטרופורזה תחת מתח קבוע של 180 V דקות 45-60 עם חיץ פועל 1x Laemmli.
- חלבונים למחוק על ממברנות PVDF (גודל נקבובית של 0.45 מיקרומטר) במתח קבוע של 16 V עבור 60 דקות באמצעות תא העברה חצי יבש SD חוצה כתם.
- קרומי בלוק ב 10 מיליליטר של חלב ללא שומן יבש 5% ב- PBS / Tween% 0.05 20 (MPT) במשך שעה 1 ב RT.
- לדלל 4 μl של נוגדן-GFP אנטי ב 4 מיליליטר של MPT דגירה קרומי O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
- בצע שלושה שלבי כביסה 10 דקות עם 10 מיליליטר של PBS / 0.05% Tween 20.
- דגירה קרומים עם 0.8 μl של נוגדנים משני peroxidase מצומדות חזרת ב 4 מיליליטר של MPT.
- לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב2.6) ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון.
3. לנתח את התאים באמצעות Cytometer זרימה.
- Resuspend תאים בPBS. השתמש HEK293 תאים כביקורת שלילית להתאים קדימה scatter (FSC) וצד פיזור (SSC), כך שהתאים בקנה מידה. צייר שער על תאי חיים על ידי נטרול כפילויות תא, אגרגטים ופסולת תא.
- התאם את הצינור מכפיל רווח (PMT), כך שהתאים בלא כתם הם בשמאל הקיצוני של ההיסטוגרמה לערוץ FL1 (לייזר ארגון 488 ננומטר).
- כדי לנתח את עוצמת הקרינה של HEK293-GFP וHEK293-GFP-CaeB תאים לפתוח את היסטוגרמה של ערוץ FL1 ולרכוש 10,000 אירועים באוכלוסייה המגודר.
- לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח FACS המסחרי.
4. Transfection של שורת תאים יציבה עם מערכת וקטור ביטוי העין מתנהלת
- תאי זרע HEK293 להביע ביציבות GFP או GFP-CaeB בצלחת 12 גם בצפיפות של 1 x 10 5 תאים / טוב.
- לאחר זריעה 19 שעות, שיתוף transfect התאים עם פלסמיד הרגולטור ופלסמיד תגובה או Bax קידוד או caspase הופעל 3.
- שיתוף transfect HEK293 התאים יציביםעם של פלסמיד רגולטור pWHE125-P 100 ng (איור 2) ושל פלסמידים תגובת pWHE655-hBax או pWHE655-revCasp3 (איור 3) ו -0.4 μl של polyethylenimine 100 ng.
- הכן את ה- DNA ומגיב transfection polyethylenimine כל 75 μl של מדיום Opti- ממ דגירה דקות בדיוק 5 ב RT. ליצירה מורכבת, דגירה שני התערובות יחד במשך 15 דקות ב RT.
- הוסף את הירידה מבחינת פתרון polyethylenimine / DNA לתאים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
5. אינדוקציה של אפופטוזיס
- 5 שעות לאחר transfection, לגרום לביטוי של החלבונים פרו-אפופטוטיים על ידי תוספת של דוקסיציקלין / מיליליטר 1 מיקרוגרם למדיום התרבות. דגירה תאים במשך 18 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
6. ניתוח של התא המארח אפופטוזיס על ידי ניתוח immunoblot
- בדוק תאים לפני שעותarvesting תחת מיקרוסקופ האור כדי לבדוק לזירוז מוות של תאים. תאים אפופטוטיים הם detectible על ידי הנוכחות של גופים אפופטוטיים המקיפים את התא למות.
- הסר את supernatant ולשטוף את התאים דבקו פעם עם PBS החם. Resuspend התאים של חיץ מדגם Laemmli 2x, חום 100 μl במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחסן ב -20 ° C.
- לטעון כ 4 x 10 4 תאים לדגימה על 12% ג'ל SDS-עמוד. בנוסף, עומס 6 μl של סולם חלבון מסחרי כסמן משקל מולקולרי. הפעל ג'לי במערכת ג'ל אלקטרופורזה תחת מתח קבוע של 180 V דקות 45-60 עם חיץ פועל 1x Laemmli.
- חלבונים למחוק על ממברנות PVDF (גודל נקבובית של 0.45 מיקרומטר) במתח קבוע של 16 V עבור 60 דקות באמצעות תא העברה חצי יבש חוצה הכתם SD.
- קרומי בלוק ב 10 מיליליטר של חלב ללא שומן יבש 5% ב- PBS / Tween% 0.05 20 (MPT) במשך שעה 1 ב RT.
- לדלל 4 μl של נוגדן פולי-ביקע אנטי פולימראז ADP-ribose (PARP) ב 4 מיליליטר של MPT דגירה O / N ב 4 ° C.
- בצע שלושה שלבי כביסה 10 דקות עם 10 מיליליטר של PBS / 0.05% Tween 20.
- דגירה קרומים עם 0.8 נוגדני μl חזרת peroxidase מצומדות משניים מדוללים ב 4 MPT מיליליטר.
- לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7) ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון.
- הסר נוגדנים מחויבים 30 דגירה דקות ב RT עם 7 מיליליטר מערבי כתם Stripping מאגר.
- לאחר שלושה שוטף עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7), לחקור את הקרומים עם 4 μl של נוגדן אנטי אקטין ב 4 מיליליטר של MPT O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר שלושה שלבי כביסה עם MPT (כפי שמתואר ב6.7), דגירה הקרומים עם 0.8 μl של הונוגדנים משני peroxidase מצומדות rseradish מדולל ב 4 מיליליטר של MPT.
- לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7 ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון.
הערה: כל שלבי הדגירה בוצעו על שייקר צלחת בפעם והטמפרטורה המצוינת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ראשית, קווי HEK293 תאי יציבות המבטאים את החלבון של העניין (CaeB) כחלבון ה- GFP-היתוך הוקמו. כביקורת, שורות תאי HEK293 ביציבות להביע GFP היו גם נוצרו. ביטוי של ה- GFP וGFP-CaeB אומת על ידי ניתוח immunoblot. Immunoblot הנציג (איור 4 א) מדגים ביטוי יציב וברור לזיהוי של ה- GFP וGFP-CaeB. עם זאת, assay זה לא יכול לקבוע אם כל התאים להביע GFP או GFP-CaeB. לכן, שורות תאי HEK293 transfected ביציבות נותחו גם על ידי cytometry זרימה. כפי שניתן לראות באיור 4, מעל 90% מהתאים בשתי שורות התאים הביעו GFP. כך, ניתן להשתמש בשורות תאי יציבות אלה כדי לנתח את הפונקציה של CaeB נוסף. בשלב הבא, הפעילות אנטי-אפופטוטיים של CaeB הייתה assayed על ידי ניתוח immunoblot באמצעות נוגדן נגד PARP ביקע. מחשוף מפרקי חלבונים של PARP הגרעיני מנטרל פעילות תיקון DNA והוא סמן אופייני termiשלבים סופיים של אפופטוזיס. מחשוף של PARP לא זוהה בHEK293-GFP או HEK293 תאים-GFP-CaeB, הוכחה כי לא הביטוי של ה- GFP, ולא של ה- GFP-CaeB הוא רעיל לתאים. עם זאת, כאשר טופלו התאים עם staurosporine, inducer חזק של אפופטוזיס הפנימי, מחשוף של PARP זוהה (איור 5). חשוב לציין, HEK293 תאים-GFP-CaeB יפגינו מופחתים מחשוף של PARP, המציינים את הפעילות האנטי-אפופטוטיים של חלבון Coxiella burnetii IV סוג מפעיל מערכת הפרשה 7 CaeB.
כדי לנתח שבשלב CaeB מפריע למסלול אפופטוטיים, מערכת ט-האון הועסקה. בפירוט, HEK293 תאים-GFP או HEK293-GFP-CaeB היו transfected עם פלסמיד רגולטור constitutively להביע מדכא כפול / התקנה בשליטת דוקסיציקלין activator (איור 2) וקידוד פלסמיד תגובת pTRE או באורך מלא באקס אנושי או הצורה פעילה של caspase אדם 3, מכונה revCasp 3 (איור 3). מערכת זו מוסדרת בחוזקה, כפי שהודגם על ידי חוסר מחשוף PARP בתנאי גרימה-עישון (איור 6). תוספת של דוקסיציקלין לתאי transfected הביאה את הביטוי של Bax או 3. revCasp אם CaeB מפריע למסלול אפופטוטיים במורד הזרם של Bax, אז האות אפופטוטיים שנוצרה על ידי ביטוי וההפעלה הבאה של Bax צריכה להיות חסום על ידי ביטוי CaeB. ואכן, HEK293 תאים ביציבות להביע GFP-CaeB עמוק לעכב אינדוקציה אפופטוזיס על ידי ביטוי בשליטת דוקסיציקלין Bax, בעוד תאי HEK293-GFP מוצגים מחשוף PARP ברור. תוצאה זו מצביעה על כך שאינדוקצית אפופטוזיס לוקי CaeB במורד הזרם של הפעלה באקס. בשלב הבא, זה נותח אם CaeB יכול להפריע caspase 3 הפעלה - אירוע בסוף המסלול אפופטוטיים. HEK293 תאים-GFP, כמו גם תאי HEK293-GFP-CaeB, מחשוף PARP התערוכה (איור 6), מצביעים על כך שפעם אחת caspase מפעיל 3 Activated, CaeB לא יכול למנוע אפופטוזיס התרחשות. יחד נלקח, נתונים אלה מראים כי CaeB פועל בין Bax וcaspase 3 הפעלה.
איור 1. סקירה סכמטי של מערכת הרגולציה טטרציקלין. מערכת ט-האון מורכב משני פלסמידים שונים, פלסמידים רגולציה ותגובה. פלסמיד הרגולציה מקודד transsilencer ט-התגובה (TTS; עיגול מלא) וtransactivator ההפוך ט-התגובה (rtTA, מעגל פתוח). שני החלבונים באים לידי ביטוי constitutively תחת השליטה של האמרגן החזק, המכונן התארכות גורם-1 אלפא (P EF-1a). TTS וrtTA גורמי שעתוק chimeric המורכב מתחום אוקריוטים תעתיק רגולציה (משתיק קול או activator, בהתאמה) ומדכאי טטרציקלין חיידקים (TetR). TetR מתווך DNA מחייב לשבעה ט ' (TETO) על פלסמיד התגובה. TETO ממוקם במעלה הזרם של אמרגן ציטומגלווירוס המינימלי מושרה (P CMV), ביחד ויוצרים אלמנט ט-התגובה (TRE). תחת ללא גרימת תנאים, TTS חייב TRE מניעת ביטוי. לאחר תוספת של דוקסיציקלין (Dox; יהלום מלא), rtTA אינטראקציה עם Dox מוביל לשינויים ולהפעלה קונפורמציה. rtTA הופעל מחליף TTS על פלסמיד התגובה, המאפשר שעתוק של גני המטרה המתאימה Bax וcaspase 3, ובכך מוביל לאפופטוזיס אינדוקציה ומוות של תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. סקירה סכמטי של pWHE125 פלסמיד הרגולציה. אלמנטים חיוניים להתפשטות בBacקפיטריה, כולל מקור של שכפול (אורי PBR) וקלטת עמידות לאנטיביוטיקה אמפיצילין נגד (Amp R), וביטוי של ט-transregulators, כגון האמרגן / משפר החזק, מכונן המיידית המוקדמת של ציטומגלווירוס האדם (P / E hCMV), אתר הריבוזום פנימי מחייב מפוליו-וירוס (PV-IRES) ופולה-אתר מהווירוס קופי 40 (SV40 פולה) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. סקירה סכמטי של פלסמיד התגובה. אלמנטים חיוניים להתפשטות חיידקים, כולל מקור של שכפול (אורי PBR) וקלטת עמידות לאנטיביוטיקה (Amp R), וביטוי מושרה באאוקריוטים, כגון expressi transgeneבקלטת עם האמרגן ט-התלוי המינימלי TREtight (P TREtight), הגן של אדם עניין באקס (hBax) ואתר פולה מוירוס קופי 40 (SV40 פולה), מתוארים. קלטת ביטוי transgene מוקפת חוזר ישיר טנדם של שני עותקים של רצף עוף HS4 הליבה מבודדת (ליבת HS4). בנוסף, קלטת התנגדות G418 בהיקף של אמרגן קינאז phosphoglycerate עכברי 1 (P mPGK), גן נאומיצין התנגדות (G418 R) ואתר פולה קינאז תימידין האנושי (TK פולה) הוא הווה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4. HEK293-GFP וHEK293-GFP-CaeB יציבות להביע חלבוני ניאון ירוקים. () Lysates שלמות התא של HEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB היו immunoblotted לGFP להראות ביטוי יציב. ניתוח (ב) cytometry זרימת נציג (FACS) של HEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB מוצג כדי להדגים את עוצמת הביטוי של GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. השפעות של הביטוי של ה- GFP-CaeB על אפופטוזיס המושרה staurosporine. HEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB טופלו עם 4 מיקרומטר staurosporine במשך 6 שעות כדי לגרום לאפופטוזיס הפנימי. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח immunoblot PARP ביקע. מחשוף PARP הופחת בHEK293 תאים-GFP-CaeB בהשוואה לתאי HEK293-GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותרשל נתון זה.
שימוש איור 6. במערכת טיטון כדי לצמצם את נקודת פעולה של CaeB. () אפופטוזיס היה מושרה על ידי ביטוי של Bax בHEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח immunoblot PARP ביקע. מחשוף PARP הופחת בHEK293 תאים-GFP-CaeB בהשוואה לתאי HEK293-GFP. (ב) אפופטוזיס היה מושרה על ידי ביטוי של revCasp 3 בHEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח immunoblot PARP ביקע. מחשוף PARP היה דומה בHEK293 תאים-GFP-CaeB וHEK293-GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חיידקים פתוגניים רבים נמל מערכות הפרשה להפריש או translocate חלבוני מפעיל חיידקים לתוך התא המארח. יש חלבוני מפעיל אלה את היכולת לווסת את התהליכים ומסלולים בתא המארח, ומאפשר לחיידקים לשרוד ולשכפל בתוך הנישה תאית שלהם. הבנת הפעילות ביוכימית והמנגנונים המולקולריים של חלבוני מפעיל תעזור להבנה טובה יותר של פתוגניות ועשויה לעזור לפתח כלים טיפוליים חדשים כדי להילחם במחלה. יתר על כן, כפי שחלבוני מפעיל לעתים קרובות להפעיל את תפקידם על ידי חיקוי פעולות תא מארח, הם יכולים לשמש גם כדי ללמוד עוד על הביולוגיה של תאים האיקריוטים 1. עם זאת, לומד את הפעילות הביוכימית של חלבון מפעיל בודד הוכיח להיות מסובך מכמה סיבות: 1) יתירות פונקציונלית בין חלבוני מפעיל, 2) תקנה הזמנית של אירוסין של חלבוני מפעיל, ו -3) effecחלבון טור עובד בהקשר עם חלבון מפעיל אחר, להפריע לתפקודו. לכן, הפעילות של חלבון מפעיל נלמדת בדרך כלל על ידי מחקרי ביטוי יתר. למרבה הצער, השימוש בביטוי יתר של החלבון חולף מפעיל יש גם כמה חסרונות. כך, יכולים להיות מועסקים מבחני ניתוח תא בודד בלבד, והפעילות של חלבון מפעיל לא ניתן לנתח אם הפעילות של חלבון מפעיל תלויה בפעילות של חלבון מפעיל אחר. כדי להתגבר לפחות החסרון הראשון, ניתן להשתמש בשורות תאי יציבות. במקרה הביטוי של חלבון מפעיל הוא רעיל לתא, זה לא מתאים. בתרחיש זה, ניתן להקים שורות תאי יציבות ומתנהלות באמצעות מערכת דומה לזו שאנו מתארים כאן לביטוי חולף של חלבונים וישכנע אפופטוזיס (ראה להלן). עם זאת, התוצאות שלנו (איור 5) מראות כי הביטוי של CaeB מגן על תאים מעוברים אפופטוזיס, ולכן לארעיל. יש כמה אפשרויות בלנתח שבצעד בתוך המפל אפופטוטיים CaeB מפריע לאינדוקצית אפופטוזיס. אפשרות אחת היא לקבוע את השותף המחייב התא המארח של CaeB. עם זאת, זה מאוד מאתגר וזיהוי של השותף מחייב אולי לא יעזרו להסביר את נקודת פעולה של CaeB בתוך המפל אפופטוטיים. אפשרות נוספת היא להשתמש מעוררי אפופטוזיס שונים, אבל CaeB מעכב אינדוקציה אפופטוזיס על ידי שני מעוררי אפופטוזיס שונים, UV-אור וstaurosporine 7, מצביע על כך שגישה זו עשויה גם לא להוביל לזיהוי של נקודת פעולה של CaeB. אפשרות נוספת בלצמצם את נקודת פעולה של CaeB, שנוצל כאן, היא להשתמש במערכת שבה מפל אפופטוזיס איתות יכול להיגרם בשלבים מוגדרים.
במקרה ביטוי של חלבון מפעיל החיידקים שנבחר כחלבון של עניין כבר מפריע לפיזיולוגיה של תא, expreיכול גם להיות ממוקם ssion תחת שליטה של מערכת ביטוי מושרה, למשל, כמו זה המשמש כדי לבטא את חלבון המטרה. לאחר מכן, ביטוי של שני החלבונים של עניין וחלבון המטרה יהיה במקביל מושרה כאשר יגנד מתווסף לתרבית התאים המאפשר לחוקר לעקוב אחר התאים להשפעות שונות על פיזיולוגיה של תא ואיתות תפוקת מערכת.
ברור, המבטא חלבון של עניין ומנסה לזהות נקודת פעולה שלה במסלול תאיים ספציפי על ידי ביטוי מושרה של חלבוני מסלול שנבחרו עובד הכי טוב אם החלבון של עניין מפריע לפעילות הפיזיולוגית של המסלול שנבחר. במקרה זה, קריאת נתונים הוא פשוט חוסר אות בדרך כלל משויך למסלול, כגון מוות של תאים במקרה של איתות או הפעלה של שעתוק אפופטוטיים במקרה של איתות Wnt. בעיקרון, חלבונים המפעילים מסלול מסוים יכולים גם להיות נחקר עם לא זהype של מערכת assay. רק יש לו שיוקם באופן שונה, למשל, באמצעות ביטוי מושרה של sh / סי / מירנה נגד חלבון מסלול ובדיקה אם החלבון של עניין יכול להציל מסלול איתות. לחלופין, מעכבי מולקולה קטנים של חלבונים ספציפיים יכולים לשמש כדי להפריע הולכים אותות בתוך מסלול ולאחר מכן לבדוק הצלת מסלול על ידי ביטוי מושרה של חלבון של עניין. עם זאת, סוג זה של גישה יהיה ניסוי מאתגר יותר מאשר הפרוטוקול שהוצג לעיל.
הבחירה של גן המטרה להיות נחקרו בassay ההתערבות היא, בעיקרון, פשוט. עדיף לבדוק כמה שיותר החלבונים במסלול האיתות נבחר ככל האפשר כדי לכוונן את זיהוי של החלבון של האתר של האינטרס של אינטראקציה עם המסלול. זה צריך להיעשות באופן חוזר ונשנה, כי זה לא תמיד אפשרי בניסוי או אפילו אפשרי לפקח על כל Interac הפוטנציאלשותפי tion בניסוי יחיד. לכן, דרך טובה ביותר הוא ראשון לבדוק כמה חלבונים במרווחים באופן שווה לכל אורך המסלול ולאחר מכן כדי לחדד את הניסוי באמצעות המידע שנצבר בסיבוב הראשון. במסלולי איתות, חלבונים רבים שונו לאחר translationally, בין אם על ידי שינוי קוולנטיים, כגון זרחון או sumoylation, או על ידי אירוע עיבוד, כגון מחשוף פרוטאוליטים. כתוצאה מכך, החלבון המתאים הוא או בקרקע מדינה או בצורה פעילה. אם אפשר, עדיף לבדוק את שני הצורות של החלבון משתי סיבות. אחת הוא שהצורה הופעלה מספקת אות גבוהה פלט 31, המציגה אתגר מחמיר יותר לחלבון של עניין. בהוכחה של עיקרון שלנו, למשל, איתות אפופטוטיים, caspase 3 מופעל על ידי מחשוף וdimerization פרוטאוליטים. אירוע הפעלה זו ניתן לדמות באופן מלאכותי על ידי ארגון מחדש את הגן הפרו-caspase לא מעובד. המקטע הקטן ממוקם באופן מלאכותימול המקטע הגדול ושניהם הצטרפו מקשר. זה נקרא "caspase הפוך" ומייצג את הצורה פעילה של האנזים כאשר הביע 35. הוא נבחר בשל הרמה גבוהה יותר של פעילות. הסיבה השנייה לחיטוט שניהם קרקע מדינה וצורות מופעלות של חלבון מסלול, משום שהיא מאפשרת לאדם להבחין אם החלבון של עניין מפריע להפעלה של חלבון המטרה, או אם היא פועלת במורד זרם של החלבון במסלול. במקרה הראשון, מוות של תאים יהיה עכבות אם טופס קרקע המדינה בא לידי ביטוי, אבל לא אם הצורה פעילה היא הווה. במקרה השני, לא חלבון יוביל לאפופטוזיס. לפיכך, בדיקת שני הצורות של חלבון מהונדס משפרת את הרזולוציה של המערכת האנליטית.
שיבוט גן המטרה בוקטור הביטוי מושרה דורש כמה החלטות. ראשית, יהיה ביטוי של גן המטרה להתרחש רק זמני או שזה יותר טוב אם הווקטור הוא שלמשולב tably לתוך הגנום של התא המארח הקו? אם נדרש ביטוי חולף בלבד, וקטור פשוט כגון 24 pUHC13-3, המכיל מקדם ט-תלוי ואתר פולה, או וקטור דו-כיוונית כגון PBI-2 או PBI-3 36, ביטוי זוגות ששל הגן המעניין את הביטוי של גן כתב לניטור קל יותר של ביטוי גן המטרה, יהיה מספיק. אם ביטוי יציב עדיף, יש להשתמש וקטור כגון pWHE655 33 (איור 3). הוא מכיל מבודד כי האגף יחידת ביטוי transgene כדי למנוע תופעות עמדה באתר האינטגרציה הגנומי מלהתערב עם ביטוי transgene מושרה. הוא מכיל גם קשור, אבל הביע באופן עצמאי, קלטת התנגדות לG418 כדי להקל על הבחירה של אירועי אינטגרציה וקטור. התוצאה הסופית של שינויים אלה היא עלייה במספר השיבוטים עם מאפייני רגולציה מצוינים 33,37,38. cDNA sequences של גני המטרה ניתן לשכפל לוקטור זה על ידי שימוש באתרי ההגבלה הייחודיים לEcoRI וEcoRV 33. שיבוט של הווקטור המבטא את ההפך caspase-3 cDNA תואר בפירוט בהתייחסות 33. שיבוט של הווקטור להביע Bax האנושי בוצע באנלוגיה. CDNA Bax האדם היה מוגבר על ידי PCR מפלסמיד pVenus-באקס 39 באמצעות פריימרים oligonucleotide שמציגים אתרי הגבלה לEcoRI וEcoRV. לאחר הטיהור של שבר PCR והגבלה עם שני אנזימים, שבר היה ligated עם pWHE655 גם מוגבל, מניב pWHE655TREtight-באקס. שנית, שמינימאלי אמרגן הוא מתאים ביותר לביטוי transgene? האמרגן המינימלי המקורי P hCMV * -1 24 מציג כמה דליפות ספציפיות תאים מסוג 30, נובעים בחלקו הנוכחות של אלמנטי תגובה מושרה הפונקציונליים α-אינטרפרון 29. זה הוביל לפיתוח של הדור השני ט-תלוייזמים, כינו ΔMtetO, TREtight וSG-TRE, עם מרווח שינה ורצפים בין אלמנטי TETO ועם רצפי אמרגן מינימאליים שונים 33,40-42. הם מציגים מופחתים במידה ניכרת דליפות בהעדר דוקסיציקלין. בין יזמי הדור השני אלה, יש ΔMtetO רמת ביטוי transgene הנמוכה ביותר בנוכחות דוקסיציקלין 33. TREtight מתווך ברמה הגבוהה ביותר ביניים וSG-TRE ביטוי transgene 33. שינויים נוספים שממוזערים ביטוי רקע של אמרגן התגובה טטרציקלין אפילו יותר 43,44. לפיכך, הבחירה של אמרגן טטרציקלין מגיב יכולה להתבצע בהתאם לדרישות או המגבלות של transgene בהתאמה.
עצמאי של הסוג של גישה ניסויית, אטימות של ביטוי של חלבון המטרה חשובה. לדוגמא, אינדוקציה של אפופטוזיס עם צורות מופעלות של חלבונים פרו-אפופטוטיים מובילה לתאמוות, גם כאשר כמויות מזעריות בלבד של חלבון מטרת בהתאמה באות לידי ביטוי 31-33. ההחמרה הנדרשת מושגת על ידי הוספת transsilencer טטרציקלין תלוי במערכת הרגולציה המותנה 30. זה מבטיח כי שעתוק מהאמרגן מושרה מודחק באופן פעיל, וזה חשוב במיוחד כאשר transfections החולף מבוצע, שכן הם בדרך כלל לא דולפים בביטוי transgene 30. אם מסלולי איתות שלא לגרום למוות תא חקרו, הדרישה לרגולציה מחמירה של ביטוי גן המטרה יכולה להיות רגועות ומערכות מושרה ללא transsilencer יכול לשמש לחלופין 43,44.
מערכת הרגולציה מושרה נהגה לחקור את מסלול האיתות לא צריכה להיות מערכת ט. היתרון הגדול שלה הוא שזה כבר נעשה שימוש אינטנסיבי בתאי יונקים במשך יותר מ -20 שנים וכי הוא מפותח ביותר והפרק הטוב ביותרמערכת בקרה מושרה aracterized. עם זאת, יש לפחות 25 מערכות אחרות מותנות רגולציה 45,46 שיכולים להיות מועסק לחלופין, או בנוסף למערכת ט. שתיים או שלוש מערכות מושרה שונות עשויות להיות שימושיות בחיטוט מתכנס מסלולי איתות או לבדיקת יתירות של שני גני היעד או החלבון של עניין.
ההליך שהוצג כאן צריך לעבוד עם יעילות transfection שתגרום לאות פלט חזקה ואמינה ממסלול האיתות המתאים, כי הוא נחקר. בגלל שורות תאי היציבות לבטא את החלבון של העניין באופן הומוגני (איור 4), כל התאים שהם transfected זמני עם פלסמיד מושרה המבטא את החלבון של ריבית חקרו להפרעה של החלבון של עניין עם איתות מסלול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
References
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
- Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
- Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
- Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
- Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
- Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
- Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
- Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
- Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
- Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
- Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
- Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
- Cory, S.
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
- Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
- Felsher, D. W.
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
- Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
- Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J.
- Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
- Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
- Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
- Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
- Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
- Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
- Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
- Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
- Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
- Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
- Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
- Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
- Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
- Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
- Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
- Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
- Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).
