Abstract
Burada sunulan teknik, bir sinyal yolunun bileşenleri ile etkileşime girer, biri bir hedef proteini ya da alternatif olarak, küçük bir molekül adım analiz etmeyi sağlar. yöntem dayanır, bir yandan, belirli bir proteinin endüklenebilir ifadesi üzerindeki seçilen sinyalleşme kademeli olarak tanımlanmış ve önceden tespit edilmiş bir aşamada bir sinyal olayını gerçekleştirmek için kullanılır. Ifade edilen hedef proteinin aktivitesi elde edilen sinyal yolunun okumaya bağlı olarak, yukanya doğru yer alan veya başlatılan sinyal olayının alt baş halinde birlikte ifadesi, diğer yandan, söz konusu genin, sonra araştırmacı değerlendirmelerini sağlar. Burada, apoptotik kaskad protokolü özelliğe göstermek için belirli bir sinyal yolu olarak seçilmiştir. Böyle Coxiella burnetii gibi patojenik bakteriler, hücre içinde bakteri hayatta kalmasını sağlamak için konak hücreye konak hücre ölümü indüksiyon müdahale efektör proteinleri yerini değiştirmek ve geliştirmek için onlarınOrganizmada yaygınlaştırılması. C. burnetii'nin efektör protein, CaeB etkili bir UV ışığı veya staurosporin ile apoptoz indüksiyonu sonrasında konakçı hücre ölümünü engeller. Adım CaeB apoptotik sinyalin yayılma müdahale ettiği daraltmak için, iyi karakterize edilmiş, pro-apoptotik etkinliğe sahip seçilen proteinler doksisiklin indüklenebilir bir şekilde geçici olarak ifade edilmiştir. CaeB Bu proteinlerin yukarı hareket ederse, apoptoz engelsiz devam edecektir. CaeB aşağı hareket ederse, hücre ölümü önlenir. seçilen test proteinleri büyük cellat proteazıdır mitokondri düzeyi ve kaspaz 3, en davranır Bax idi. CaeB Bax ifadesi ile indüklenen hücre ölümü engeller, ama kaspaz 3 sentezlenmesiyle. CaeB, bu şekilde, bu iki protein arasında apoptotik kaskad ile etkileşime girer.
Introduction
birçok Gram-negatif bakteriyel patojenlerin hastalık oluşturma ökaryotik konakçı hücreleri kaçırmak için özel bir salgı sistemleri bağlıdır. Bakteriler hücresel ve biyokimyasal çeşitli aktiviteler modüle edilmesi için bir ev sahibi hücre içerisine bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri (efektörler) enjekte etmek için, bu salgılama sistemleri kullanırlar. efektör proteinlerin çalışma konak / patojen etkileşimleri temel yönlerini içine değil, aynı zamanda ökaryotik hücreler 1 temel biyoloji içine olağanüstü bir fikir vermiştir sadece. Konakçı hücre, apoptoz modülasyonu birçok hücre içi patojenler için önemli bir virülans mekanizma olduğu gösterilmiştir, ve apoptoz modüle efektör protein bir dizi 2-9 tespit edilmiştir. Bununla birlikte bir aktivite bunların kesin moleküler mekanizmalar birçok durumda halen mevcuttur.
Apoptoz, programlanmış hücre ölümü olup, enfeksiyon 10 immün yanıtlarda önemli bir rol oynamaktadır. Apoptoz giden iki ana yollar vartespit edilmiştir: plazma zarı (dışsal apoptosis) hücre ölümü reseptörleri aracılığıyla mitokondri (içsel apoptosis) ya da sinyal iletimini doğrudan hedef. intrinsik veya mitokondri aracılı hücre ölüm yolunu hücre içi sinyaller ile tetiklenir ve Bax ve Bak, Bcl-2 ailesine ait iki pro-apoptotik üye aktivasyonunu içerir edilir. Bu aile hücre ölümü 11-14 kontrol pro- ve anti-apoptotik düzenleyici protein oluşmaktadır. Bax ve Bak sitoplazmaya sitokrom C salınımı ile sonuçlanan, mitokondriyal dış membran daha sonra permeabilization ardından apoptoz aktivasyonu oligomerizasyonu yol açar. Sitokrom C salma apopitozom 15 kaspaz 9 aktivasyonu yoluyla efektör kaspaz 3 ve 7 aktivasyonunu başlatır. Bu diğerlerinin yanı sıra, hücre yüzeyi 16 fosfatidilserin maruz sonuçlanır, seçilen alt-tabakaların proteoliz yol açar ve CH fragmanları özel bir DNaz boşaltırromatin 17,18.
Bağımsız bir efektör protein, müdahale eden apoptotik kaskad içinde indüklenebilir bir ekspresyon sistemi 19 kullanılmıştır belirlemek amacıyla. Transgenlerin koşullu ifadesi için düzenleyici sistemler hücre içinde bir proteinin fonksiyonunu veya doku, organ ve organizma gelişimi için önemini, hem de inisiyasyon, ilerlemesi ve hastalık 20-23 bakımı sırasında analiz değerli bir araç olmuştur. Tipik haliyle, örneğin Tet sistemi Burada kullanılan 24 indüklenebilir kontrol sistemleri, yapay bir transkripsiyon birimi (Şekil 1 e bakınız) oluşturur. Bir bileşen, transkripsiyonel aktivasyonu veya 24,26 susturulması aracılık eden bir memeli protein etki bakteriyel transkripsiyon bastırıcı TetR 25 füzyonu ile oluşturulan tTA (tetrasilin bağımlı transkripsiyon aktivatörü) olarak adlandırılan bir yapay tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüdür. İkinci bileşen, bir melezpromoteri, en az bir TATA-kutu ve bir transkripsiyon başlatma bölgesi içeren, bir ökaryotik minimal promotör aşağıdakilerden oluşan, TRE (tetrasiklin-duyarlı öğesi) olarak adlandırılan TetR, teto 24,25 için aynı kökenli DNA bağlanma sitesi birden fazla kopyası katıldı. Üçüncü bileşen TetR, tetrasiklin ya da anhydrotetracycline veya doksisiklin 25 bunun türevleri, biri doğal bir liganddır. Kültür ortamına ligand ilave edilmesinden sonra, TetR teto için afiniteye kaybeder ve TRE ayrışmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, hedef genin transkripsiyonu kaldırılmıştır. Transgen ekspresyonu, bu nedenle sıkı bir şekilde her iki hücre kültüründe, bir zaman ve doza bağlı bir şekilde ve hayvanların 20,23,24 kontrol edilebilir. TTA'nın ile, transgen ekspresyonu, tetrasiklin varlığında dışında, yapısal olarak ortaya çıkar. Tetrasiklin transgen expressio önce sistemden çıkarılması gerekir, bu sitotoksik veya onkojen protein çalışmada bir dezavantaj olabilirN oluşur ve hücre hedef proteinin etkisi izlenebilir. Bu zaman alıcı olabilir ve özellikle transgenik hayvanlarda 27, her zaman tam değil olabilir. Bu sınırlama çözmek için, doksisiklin varlığına ters yanıt veren bir TetR mutant yeni bir transkripsiyon faktörü üretmek için kullanıldı, rtTA 28 (tTA ters). Sadece TRE bağlanan ve eş zamanlı olarak, doksisiklin varlığında transkripsiyonu aktive eder. Sistem, örneğin, kalıntı leakiness. TRE-bağlanmış transkripsiyon faktörünün yokluğunda transgen ekspresyonu, bir genomik entegrasyon sahasında pozisyon etkilerinden ya (i) menşeli, (ii) TRE kendisinin 29, ya da (iii) dan -spesifik tTA / rtTA 28 bağlanmasını, ek bir transkripsiyonel susturucu getirerek hitap etti, sisteme (tetrasiklin bağımlı transkripsiyon susturucu) 30 TTS adlandırılan. Bu rtTA (Şekil 1 e bakınız) ile birlikte bir ikili regülatörü ağı oluşturur.Doksisiklin yokluğunda TTS TRE bağlanan ve aktif bir diğer transkripsiyon kapanır. Doksisiklin varlığında TTS TRE ayrışmaktadır ve rtTA aynı zamanda, hedef genin ekspresyonunu indükleyen bağlar. Sıkılık Bu ek tabaka, yüksek ölçüde aktif, sitotoksik proteinleri 31-34 ifade etmek çoğu zaman gereklidir.
Bu sıkı bir şekilde kontrol çift regülatör sistemi kullanarak, apoptotik kaskad verilen efektör protein, apoptosisin engelleyebilir olmadığı analize izin tanımlanmış bir adımda başlatılabilir. Bu yöntem, yalnızca bakteriyel efektör protein, anti-apoptotik aktivitesi çalışma için kullanılan hem de pro-apoptotik ya da toksik proteinlerin uyanlabilir ifadesi için ya da diğer sinyal yollarının parazit kesme için mümkün değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ilgi konusu proteini eksprese eden kararlı hücre soyları 1. Üretim
- Isı ile inaktive edilmiş FCS ve% 1 penisilin / streptomisin eklenmesi ile ortamı hazırlamak ticari olarak temin edilebilen Dulbecco's GlutaMAX-I, piruvat, ve 4.5 g / L D-glükoz ile takviye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) Modifiye etmek.
- % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de ortam içinde HEK293 hücrelerinin geliştirin. Her üç günde bir hücrelerini Alt yetiştirmek. Ortamı çıkarın ve 15 ml taze medya hücrelerin tekrar süspansiyon. Yeni 75 cm 2 hücre kültürü şişesi içine pipetle 1 ml 14 mi ortamı eklenir.
- Hemasitometre kullanarak hücre sayısını analiz.
- Oyuk başına 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plaka içerisinde tohum HEK293 hücreleri, 24 saat süre ile inkübe edilir.
- Transfeksiyon için transfeksiyon reaktif üreticisi tarafından sağlanan protokolünü kullanır. Transfeksiyon ayıracı kullanılarak pEGFP-C2 ya da pEGFP-C2-CaeB olan hücreleri transfekte. Kullanmak transfeksiyon extra pure ısınmak için önceent ve RT için gerekli ortam. DNA transfeksiyon reaktifi: 1 oranını 3 kullanın.
- Ayrıntılı olarak, bir pipet ile doğrudan serumsuz DMEM ortamı içinde 50 ul transfeksiyon reaktifi 1.5 ul. Kompleks oluşumu için, transfeksiyon reaktifi ihtiva eden karışıma kodlayan DNA, GFP ya da GFP-CaeB 0.5 mg pipet ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
- Bir damla damla bir tarzda, reaksiyon karışımı ekleyerek hücreleri transfekte ve 24 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
- 1 mg ekleme /% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de GFP-pozitif klonların seçilmesi için geneticin'e ml.
- : 1 oranında 6 gün sonra, 1, orta ve HEK293 süpernatan barındıran bir 96-çukurlu plaka içinde sıralama akış sitometrisi ile, tek hücrelerin izole eder. 4966 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj edildi kültürlenmiş konfluent HEK293 hücrelerinden HEK293 süpernatant oluşturur.
- Ertesi gün, ortam 1,5 ihtiva eden kültür ortamı yerine0 mg / ml genetisin. Haftada bir kez medya değiştirin. Hücreler konfluent tek tabaka oluşturmak için, bir 24-çukurlu plaka aktarın. 1.5 mg / ml genetisin içeren ortamda 5: 1 arasındaki bir oranda, haftada iki kez hücreleri alt yetiştirirler. Son olarak, bağışıklık beneklenme analizi ile GFP-pozitif hücrelerin yüzdesi analiz etmek ve akış sitometrisi.
Bağışıklık beneklenme analizi ile kararlı hücre kuşaklarının 2. analizi
- Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C 'de 5 ila 95 ° C'de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri.
- % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 4 hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın.
- PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0 gözenek boyutu.Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde 45 um).
- PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar.
- MPT 4 ml anti-GFP antikorunun 4 ul seyreltilir ve 4 ° C'de membranlar O / N inkübe edin.
- 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları.
- MPT 4 ml yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor, 0.8 ul membranlar inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (2.6 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın.
3. Bir Akış Sitometreyi Kullanarak Hücreleri analiz edin.
- PBS hücrelerin tekrar. Ileri sc ayarlamak için negatif kontrol olarak HEK293 hücreleri kullanınardıl (FSC) ve yan dağılım (SSC) hücreleri ölçekte böylece. Hücre çiftleri, agrega ve hücre artıkları dışlayarak canlı hücrelerin üzerinde bir kapı çizin.
- Lekesiz hücreler çok FL1 kanalı (488 nm argon lazer) için histogram soldaki böylece photomultiplier tüp (PMT) kazanç ayarlayın.
- HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinin floresan yoğunluğu analiz etmek FL1 kanalının histogram açıp kapı nüfus 10.000 olayları kazanır.
- Ticari FACS analiz yazılımı kullanarak verileri analiz.
Uyarımlı Ekspresyon Vektör Sistemi ile Sabit bir Hücre Serisinin 4. transfeksiyonu
- Tohum HEK293 hücreleri / oyuk 1 x 10 5 hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bir plaka içerisinde GFP ya da GFP-ifade eden CaeB.
- 19 saat sonrası tohumlama, regülatör plazmid ve tepki plazmid ya kodlayan Bax veya aktive kaspaz 3 ile hücreleri co-transfect.
- Stabil HEK293 hücrelerinin birlikte transfekte edilmesipWHE125-P regülatörü plazmid 100 ng (Şekil 2) ve yanıt plazmid pWHE655-hBax ya pWHE655-revCasp3 (Şekil 3) ve polietilenimin 0.4 ul, 100 ng.
- Opti-MEM ortamı 75 ul DNA ve polietilenimin transfeksiyon reaktifi, her hazırlama ve oda sıcaklığında tam olarak 5 dakika boyunca inkübe edin. Kompleks oluşumu için, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca her iki karışımları birlikte inkübe edilir.
- Polietilenimin / DNA solüsyonu damla damla hücrelere ilave edin ve% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
Apoptoz 5. İndüksiyon
- Post-transfeksiyon 5 saat, kültür ortamına 1 ug / ml doksisiklin ilavesiyle pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu indükler. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 18 saat inkübe hücreleri.
İmmünoblot Analizi Ana Hücre Apoptoz 6. Analizi
- H öncesinde hücrelerin kontrol edinışık mikroskobu altında arvesting hücre ölümü indüksiyonu için kontrol edin. Apoptotik hücreler ölüyor hücreyi çevreleyen apoptotik cisimlerin varlığıyla algılanabilir vardır.
- Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C 'de 5 ila 95 ° C'de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri.
- % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 4 hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın.
- Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0.45 um gözenek boyutu).
- PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar.
- 4 μ seyreltinMPT 4 ml anti-ayrıldı poli ADP-riboz polimeraz (PARP) antikorun L ve 4 ° C de O / N inkübe edin.
- 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları.
- 4 mi MPT içinde seyreltilmiş 0.8 ul yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor ile membranlar inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (6.7 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın.
- 7 mi Western Blot Sıyırma Tamponu ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek suretiyle bağlanan antikorlar çıkarın.
- PBS ile üç yıkamadan /% 0.05 (6.7 de tarif edildiği gibi), Tween 20 sonra, 4 ° C'de MPT O / N 4 ml anti-aktin antikor 4 ul membranlar prob.
- (6.7 de tarif edildiği gibi) MPT üç yıkama aşamasından sonra, ho, 0.8 ul membranlar inküberseradish peroksidaz-konjuge sekonder antikor MPT 4 ml seyreltilmiştir.
- Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra,% 0.05 / PBS ile membranlar 6.7 de tarif edildiği gibi Tween 20 (üç defa yıkamak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için bir film gelişimi için standart donanım uygulayın.
Not: Tüm bekletme işlemleri, belirtilen süre ve sıcaklıkta, bir plaka karıştırıcısı üzerinde gerçekleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk olarak, bir GFP füzyon proteini olarak kararlı bir şekilde ilgi (CaeB) proteinini eksprese eden HEK293 hücre soyları kurulmuştur. Bir kontrol olarak, kararlı bir şekilde GFP eksprese eden HEK293 hücre hatları da oluşturulmuştur. GFP ve GFP-CaeB sentezlenmesi bağışıklık beneklenme analizi ile doğrulanmıştır. Örnek immünoblot (Şekil 4A), GFP ve GFP-CaeB istikrarlı ve net bir şekilde tespit edilebilir ifadesi gösterilmiştir. Tüm hücreleri GFP veya GFP-CaeB ifade edip Ancak, bu deney belirleyemiyor. Bu nedenle, stabil bir şekilde transfekte edilmiş HEK293 hücre çizgileri aynı zamanda akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, her iki hücre hatlarının hücre üzerinde% 90 GFP olarak ifade edilmiştir. Bu nedenle, bu kararlı hücre çizgileri daha CaeB fonksiyonunu analiz etmek için kullanılabilir. Bir sonraki adımda, CaeB anti-apoptotik aktivitesi klivaj olmuş PARP karşı bir antikor kullanılarak bağışıklık beneklenme analizi ile test edilmiştir. Nükleer PARP'nin proteolitik bölünme DNA onarım faaliyeti inaktive ve Termi tipik bir belirtecidirapoptoz nal aşamaları. PARP yarılması GFP ekspresyonu ne de GFP-CaeB hiçbiri hücreler için toksik olduğunu gösterdi HEK293-GFP veya HEK293-GFP-CaeB hücrelerde algılanmaz. Hücreler staurosporin ile muamele edildi, ancak, iç apoptoz güçlü bir indükleyicisi, PARP bölme (Şekil 5) tespit edilmiştir. Önemli olarak, HEK293-GFP CaeB hücreleri Coxiella burnetii'nin tip IV salgılama sistemi efektör protein CaeB 7, anti-apoptotik etkinliği gösteren, PARP bölünme indirgenmiş görülmez.
Adım CaeB apoptotik yolun müdahale hangi analiz etmek, Tet-On sistemi kullanıldı. Ayrıntılı olarak, HEK293-GFP veya HEK293-GFP CaeB hücreler düzenleyici bir plazmid konstitütif bir doksisiklin kumandalı çift bastırıcı / aktivatör setup (Şekil 2) ve bir pTRE yanıtı plazmid kodlayan, ya tam uzunlukta, insan Bax ya da aktive edilmiş formu içinde eksprese ile transfekte edilmiştir İnsan kaspaz 3, (revCasp 3 olarak adlandırılanŞekil 3). Uyarıcı olmayan koşullar (Şekil 6) altında PARP-bölünme olmaması ile gösterildiği gibi, bu sistem sıkıca düzenlenir. Transfekte edilmiş hücrelere doksisiklin eklenmesi Bax ekspresyonu veya revCasp 3. CaeB daha sonra ifade ve Bax aktivasyonu tarafından üretilen apoptotik sinyal CaeB ekspresyonu bloke edilmelidir Bax alt apoptotik yolu ile uğratır sonuçlandı. Gerçekten de, HEK293 hücreleri stabil şekilde eksprese eden, GFP-CaeB HEK293-GFP hücreleri belirgin bir PARP-bölünmesini sergilemiştir derinden, doksisiklin kontrollü Bax ekspresion neden olduğu apoptosisi inhibe eder. Bu sonuç göstermektedir Bax aktivasyonu akış aşağısında CaeB blok apoptosis. Apoptotik yolun bir geç olay - Daha sonra, CaeB kaspaz 3 aktivasyonu müdahale edip analiz edildi. Efektör kaspaz 3 kez activ belirten HEK293-GFP hücreleri, hem de HEK293-GFP CaeB hücreleri, sergi, PARP bölme (Şekil 6),ated, CaeB meydana gelen apoptozu engel olamaz. Birlikte alındığında, bu veriler CaeB Bax ve kaspaz 3 aktivasyonu arasındaki hareket ettiğini göstermektedir.
Şekil tetrasiklin düzenleyici sistemin 1. şematik bakış. Tet-On sistemi iki farklı plazmidler, düzenleyici ve müdahale plazmid oluşmaktadır. ve Tet duyarlı ters transaktivatörü (rtTA açık daire) düzenleyici plazmid Tet duyarlı transsilencer (dolu daire TTS) kodlar. Her iki protein de yapısal olarak güçlü ve konstitütif uzama faktörü-1 a promotörü (P EF-1 a) kontrolü altında ifade edilmiştir. TTS ve rtTA kimerik (sırasıyla, susturucu ve aktivatör) bir ökaryotik transkripsiyonel düzenleyici etki kapsayan, transkripsiyon faktörleri ve bakteriyel bir tetrasiklin bastırıcı (TetR) 'dir. TetR DNA, yedi Tet bağlanma aracılık (teto) dizileri içerir. teto birlikte Tet-duyarlı element (TRE) oluşturulması, uyarılabilir az sitomegalovirüs promoteri (CMV P) akıntı yukarısında konumlanır. Olmayan koşullar uyaran altında TTS ekspresyonunu önleme TRE bağlıdır. Doksisiklin ek (Dox; dolu elmas) sonra rtTA Dox bu şekilsel değişikliklere ve aktivasyonuna yol ile etkileşime girer. Aktif rtTA böylece apoptosis indüksiyonu ve hücre ölümüne yol açan, ilgili hedef genler Bax ve kaspaz 3 transkripsiyonunu sağlayan yanıt plazmid üzerinde TTS değiştirir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Düzenleyici plazmid pWHE125 Şekil 2. şematik bakış. Bac içinde yayılması için gerekli Elemanlarıbakterilerin, bir replikasyon kaynağı (ori pBR) ve ampisilin bir antibiyotik direnç kaseti (Amp R) dahil olmak üzere, ve bu, insan sitomegalovirüsü, güçlü yapısal hemen erken promoteri / güçlendiricisi gibi Tet-transregulators, ekspresyonu (P, / E hCMV), çocuk felci-virüs (PV-IRES) ve Simian virüsü 40 (SV40 poliA) görüntülenir bir polyA-site bir iç ribozom bağlanma yeri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yanıtı plazmid Şekil 3 şematik bir bakış. Elemanlar bir replikasyon orjini (ori pBR) ve bir antibiyotik direnç kaseti (Amp R) dahil olmak üzere, bakteri, çoğalma için esas teşkil eden ve bu transgen expressi olarak ökaryotlarda, indüklenebilir ekspresyon içinTet-bağımlı minimal promotör TREtight (P TREtight), faiz, insan Bax (hBax) geninin ve Simian virüsü 40 (SV40 poliA) bir polyA site ile kaset üzerinde tasvir edilmiştir. transgen ifade kaseti tavuk HS4 izolatör çekirdek dizisi (HS4 çekirdek) iki kopya tandem direkt tekrarları ile çevrili. Ayrıca, bir fare fosfogliserat kinaz 1 yükseltici (P mPGK) oluşan bir G418 direnç kaseti, bir neomisin direnç geni (G418 R) ve insan timidin kinaz polyA sitesi (TK poliA) mevcuttur. büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakam.
Şekil 4. HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB stabil bir şekilde yeşil floresan proteini ifade eder. (A) HEK293-GFP ve tüm hücre lizatlarıHEK293-GFP-CaeB hücreleri kararlı ifadeyi göstermek GFP için imünoblotlanır bulundu. HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücreleri (B) Temsilcisi akış sitometri (FACS) analizi GFP yoğunluğunu göstermek için gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil staurosporin kaynaklı apoptoz. HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde GFP-CaeB ifade 5. Etkileri içsel apoptozu indükleme 6 saat boyunca 4 uM staurosporin ile tedavi edildi. Apoptoz yarık PARP bağışıklık beneklenme analizi ile analiz edilmiştir. PARP bölünme HEK293-GFP hücrelerine kıyasla HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde azalma oldu. Bir büyük halini görmek için tıklayınızBu rakamın.
Teton sisteminin Şekil 6. Kullanım CaeB etki noktası daraltmak için (A). Apoptosis, HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde Bax ekspresyonu ile indüklenmiştir. Apoptoz yarık PARP bağışıklık beneklenme analizi ile analiz edilmiştir. PARP boşluğuna HEK293-GFP hücrelere kıyasla HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde indirgendi. (B) Apoptoz HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde revCasp 3 ekspresyonu ile indüklenmiştir. Apoptoz yarık PARP bağışıklık beneklenme analizi ile analiz edilmiştir. PARP bölünme HEK293-GFP-CaeB ve HEK293-GFP hücrelerinde karşılaştırılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birçok patojen bakteri salgılar veya konakçı hücreye bakteri efektör proteinleri yerini değiştirmek için salgılama sistemleri liman. Bu efektör proteinler bakteriler hayatta ve ilgili hücre içi niş içinde kopyalanmasına olanak tanıyan, konakçı hücre süreçleri ve yolların modüle kapasitesine sahiptir. Biyokimyasal faaliyetler ve efektör proteinlerin moleküler mekanizmaların anlaşılması patojenite daha iyi anlaşılmasına yönelik yardımcı olacak ve bu hastalıkla mücadele için yeni tedavi araçları geliştirmek için yardımcı olabilir. Ayrıca, efektör proteinler sıklıkla konak hücre faaliyetlerini taklit ederek onların fonksiyonlarını gösterirler, onlar da ökaryotik hücrelerde 1 biyolojisi hakkında daha fazla bilgi için kullanılabilir. Efektör proteinler arasında 1) fonksiyonel fazlalık, efektör proteinler angajman 2) zamansal düzenlenmesi, ve 3) effec: Bununla birlikte, tek bir efektör proteinin biyokimyasal aktivitesi okuyan çeşitli nedenlerle karmaşık olduğu kanıtlanmıştırişlevi ile müdahale, başka bir efektör protein ile bağlamda çalışan tor proteini. Bu nedenle, bir efektör proteinin aktivitesi genel olarak aşırı ekspresyonu çalışmaları ile incelenmiştir. Ne yazık ki, efektör protein, geçici aşırı ifadesinin kullanımı da bazı dezavantajlara sahiptir. Bu nedenle, sadece tek bir hücre analizi deneyler kullanılabilir ve efektör proteinin aktivitesi bir efektör proteinin aktivitesine bağlı halinde efektör proteinin aktivitesi analiz edilemez. En azından ilk dezavantajı aşmak için, stabil hücre hatları da kullanılabilir. Durumunda, efektör protein sentezleme hücre için, bu uygun değildir toksiktir. Biz apoptosis teşvik edici proteinler (aşağıya bakınız) geçici ifadesi için burada tarif edildiği üzere, bu senaryo içinde, kararlı ve uyarılabilir hücre çizgileri de benzer bir sistemi kullanılarak tespit edilebilir. Ancak, sonuçlar (Şekil 5) CaeB ekspresyonu apoptozise hücreleri korur ve bu nedenle olmadığını göstermektedirzehirlidir. Hangi CaeB apoptosis indüksiyon ile müdahale apoptotik kaskad içinde adım diseksiyon birkaç seçenek vardır. Bir olasılık CaeB konakçı hücre bağlanma partneri belirlemektir. Ancak, bu çok zor ve bağlanma partnerinin belirlenmesi apoptotik çağlayan içinde CaeB eylem noktasını açıklamaya yardımcı olabilir. Diğer bir olasılık, farklı apoptosis indükleyicilerini kullanmaktır, fakat CaeB bu yaklaşım aynı zamanda CaeB etki alanına tanımlanmasına neden olmayabilir gösteren, iki farklı apoptosis teşvik ediciler, UV ışığı ve staurosporin 7 neden olduğu apoptosisi inhibe eder. Burada istismar edildi CaeB, eylem noktası aşağı daralma başka olasılık, apoptoz sinyal çağlayan tanımlanan adımlarda uyarılan edilebilir bir sistem kullanmaktır.
Ilgi protein zaten hücre fizyolojisi, onun Expre müdahale olarak seçildi bakteriyel efektör protein durumda ifadedesalgılanması ayrıca, hedef proteini ifade etmek için kullanılan olarak, örneğin, bir uyarılabilir sentezleme sisteminin kontrolü altına yerleştirilebilir. Ligand, hücre fizyolojisi üzerinde farklı etkileri hücreleri izlemek için araştırmacı sağlayan ve sistem çıkışı sinyal hücre kültürüne ilave edilir Sonra, ilgi ve hedef proteinin hem protein hem de ekspresyonu eş zamanlı olarak bağlı olacaktır.
İlgi dahilindeki protein, seçilen yolu fizyolojik aktivitesine müdahale Açıkçası, eğer ilgili bir proteini eksprese eden ve seçilen yolu proteinlerinin uyanlabilir ifadesi ile, belirli bir hücre içi yolunda etki yerine noktasını belirlemeye çalışırken en iyi şekilde çalışır. Bu durumda, okuma normal Wnt sinyallemesinin durumunda apoptotik sinyal ya da transkripsiyon aktivasyon durumunda, hücre ölümü gibi, yolu ile bağlantılı bir sinyal olmaması basitçe. Prensip olarak, belirli bir yol aktive proteinleri de bu T ile problanabilirdeney sisteminin ype. Bu sadece bir si / sh indüklenebilir ifade kullanarak, örneğin, farklı şekilde ayarlanmalıdır / miRNA bir yol proteinine karşı ve ilgi protein yolu sinyalini kurtarma eğer test. Alternatif olarak, belirli bir protein, küçük molekül inhibitörleri, bir yol içinde sinyal iletimini kesmek için kullanılabilir ve daha sonra ilgi konusu bir proteinin uyanlabilir ifadesi ile yol kurtarma kontrol etmek için. Ancak, yaklaşımın bu tip Yukarıda sunulan protokolü daha deneysel daha zorlu olacak.
hedef genin seçimi basit, ilke olarak, girişim deneyidir taranmasında edilmesi. Bu ince ayar yapmak yolun ile etkileşim paylarının sitenin proteinin tanımlanması mümkün olduğunca seçilen sinyal yolunun proteinlerin gibi birçok test etmek en iyisidir. Her zaman tüm potansiyel interac izlemek için deneysel mümkün, hatta mümkün değildir, çünkü bu bir iteratif bir şekilde yapılmalıdırtek bir deneyde yon ortakları. Bu nedenle, ilk ilk turda kazandı bilgileri kullanarak deney rafine sonra tüm yol boyunca eşit aralıklı birkaç proteinleri test etmek en iyisidir. Sinyal yollar, bir çok proteinleri, proteolitik bölünme gibi fosforilasyon ya sumoylation veya bir işlem bir olay ile olduğu gibi, bir kovalent modifikasyonla ya translasyon sonrası modifiye edilir. Sonuç olarak, söz konusu protein, bir zemin halde ya da aktive edilmiş bir formda ya da bir. Mümkünse, bu iki nedenden dolayı protein hem de formlarını test etmek en iyisidir. Bir aktif formu ilgi protein için daha sıkı bir meydan okuma sunuyor yüksek çıkış sinyali 31, teslim olmasıdır. Bizim-kanıtlama prensibi, örneğin apoptotik sinyal, kaspaz 3 proteolitik bölünme ve dimerizasyonu ile aktive edilir. Bu aktivasyon olayı işlenmemiş yanlısı kaspaz geni yeniden düzenleyerek yapay simüle edilebilir. küçük alt-ünite yapay olarak yerleştirilenBüyük alt biriminin ön ve hem de bir bağlayıcı ile birleştirilir. Bu, bir "ters kaspaz" olarak adlandırılır ve 35 sentezlendiğinde enzimin aktive edilmiş bir şeklini temsil eder. Bu nedeniyle etkinlik daha yüksek bir dereceye kadar seçildi. Bir yolu proteinin zemin devlet ve aktif formları hem sondalama ikinci nedeni bu ilgi protein hedef proteinin aktivasyonu ile müdahale olursa kimse ayırmasına olanak sağlar, çünkü, ya da aşağı yolunda protein hareket halinde. İlk durumda, taban durumu bir şekilde ifade edilir, eğer hücre ölümü inhibe olacak, ancak aktive edilmiş bir şekli mevcut değilse. İkinci durumda ise, ne de bir protein apoptoza neden olur. Böylece, değiştirilmiş proteinin iki formu test analitik sistemin çözünürlüğünü artırır.
Uyanlabilir sentezleme vektörü içinde hedef genin klonlanması birçok kararları gerektirmektedir. Vektör s İlk olarak, hedef genin ekspresyonu sadece geçici olarak meydana gelen ya da daha iyi olan ederanmalıyım konakçı hücre hattı genomuna entegre? Sadece geçici sentezleme gerekli ise, örneğin, bir Tet bağımlı promoteri ve poliA sitesi veya bu genin PBI-2 veya PBI-3 36, çiftlerin ifadesi olarak çift yönlü bir vektör içeren pUHC13-3 24 gibi basit vektör Hedef gen ekspresyonu kolaylaştırmak izlenmesi için bir raportör geninin sentezlenmesi ilgi, yeterli olacaktır. Stabil ekspresyon tercih edilir, bu tür pWHE655 33 (Şekil 3) gibi bir vektör kullanılır. Bu uyarılabilir transgen ifadesi ile müdahale genomik entegrasyon yerinde pozisyon etkileri önlemek için transgen ifade birimini kanadını izolatörler içerir. Ayrıca bir vektör entegrasyon olaylarının seçimini kolaylaştırmak için G418 için, direnç kasedi bağlantılı, fakat bağımsız bir şekilde ifade içerir. Bu modifikasyonların net sonucu mükemmel bir düzenleyici özellikleri 33,37,38 ile klon sayısında bir artıştır. cDNA seHedef genlerin ra yol EcoRI ve EcoRV 33 için benzersiz sınırlama bölgeleri kullanılarak, bu vektöre klonlanabilir. Ters Kaspaz-3 cDNA eksprese eden vektör klonlanması referans insan Bax benzer şekilde yapılmıştır ifade vektörü 33. klonlanması ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. İnsan bax cDNA, EcoRI ve EcoRV kısıtlama yerleri sokacak oligonükleotid primerler kullanılarak plazmid pVenus-Bax 39 PCR ile amplifiye edildi. Iki enzim ile PCR fragmanının ve kısıtlama ve saflaştırmadan sonra, fragman, pWHE655TREtight-Bax, sonuçta benzer şekilde kısıtlı pWHE655 ile bağlanmıştır. İkinci olarak, çok az olan promotör transgen sentezlenmesi için en uygun? orijinal minimal promotör P hCMV * -1 fonksiyonel interferon-α uyarılabilir müdahale elemanları 29 varlığı nedeniyle kısmen 24 görüntüler bir hücre türüne özgü leakiness 30. Bu ikinci nesil gelişmesine yol açmıştır Tet bağımlıpromoterler, teto elemanları arasında ve farklı minimal promotör sekansları 33,40-42 ile değiştirilmiş aralık ve dizileri ile ΔMtetO, TREtight SG-TRE, olarak adlandırılır. Onlar büyük ölçüde doksisiklin yokluğunda leakiness azalır görüntüleyebilen. Bu ikinci kuşak promoterler arasında, ΔMtetO doksisiklin 33 varlığında düşük transgen ekspresyon seviyesine sahiptir. TREtight transgen ekspresyonu 33 arasında bir ara SG-TRE üst düzeyde aracılık eder. Daha fazla modifikasyonlar tetrasiklin duyarlı promoter daha 43,44 arka plan ifadesini minimize var. Bu durumda, bir tetrasiklin-tepkimeli yükseltici seçimi, ilgili transgen gereklilikleri veya sınırlamalara göre yapılabilir.
Deney yaklaşımı tipine bakılmaksızın, hedef proteinin ekspresyonunun sıkılığı önemlidir. Örneğin, pro-apoptotik proteinlerin aktif biçimleri ile apoptosisin hücreye nedenilgili hedef proteinin sadece çok az miktarlarda 31-33 ifade edilmiştir hatta ölüm. gerekli sıkılık koşullu düzenleme sisteminin 30 bir tetrasiklin bağımlı transsilencer ekleyerek elde edilir. Bu uyarımlı promotör transkripsiyon aktif geçici nakiller gerçekleştirilir zaman tipik olarak transgen ekspresyonu 30 oldukça sızıntılı olduğundan, özellikle önemli olan, baskı temin eder. Hücre ölümünü teşvik olmayan sinyal yolları problanır Bir transsilencer alternatif 43,44 kullanılabilir olmadan hedef gen ekspresyonunun sıkı düzenlenmesi için daha geniştir ve indüklenebilir sistemleri olabilir.
sinyal yolunu incelemek için kullanılan indüklenebilir düzenleyici sistem Tet sistem olmak zorunda değildir. En önemli avantaj, bu yoğun fazla 20 yıl boyunca, memeli hücrelerinde kullanılmış olduğunu ve bunun çoğu gelişmiş ve en CHaracterized endüklenebilir kontrol sistemi. Bununla birlikte, alternatif olarak veya Tet sistemine ek olarak kullanılabilir olabilir en azından 25 başka bir koşullu düzenleme sistemleri, 45,46 vardır. Iki ya da üç farklı uyarılabilir sistemler sinyal yollarının yakınsak sondalama veya hedef gen ya da ilgi duyulan proteini ya artıklık test etmek için yararlı olabilir.
Burada sunulan prosedür incelenir, ilgili sinyal yolundan sağlam ve güvenilir çıkış sinyali neden transfeksiyon verimliliği ile çalışması gerekir. Stabil hücre hatları, bir homojen bir şekilde (Şekil 4B) 'de ilgili bir proteini eksprese için, geçici olarak ilgili proteini eksprese eden uyarılabilir plasmid ile transfekte edilir tüm hücreler sinyal yolu ile söz konusu proteinin bir girişim için sondalandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
References
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
- Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
- Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
- Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
- Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
- Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
- Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
- Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
- Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
- Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
- Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
- Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
- Cory, S.
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
- Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
- Felsher, D. W.
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
- Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
- Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J.
- Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
- Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
- Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
- Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
- Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
- Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
- Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
- Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
- Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
- Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
- Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
- Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
- Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
- Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
- Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
- Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
- Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).
