Abstract
여기에 제시된 기술은 신호 전달 경로의 구성 요소와 상호 작용하는 하나의 표적 단백질, 또는 대안 적 소분자 단계를 분석 할 수있다. 방법을 기반으로 한 손으로, 특정 단백질의 발현 유도에 선택된 시그널링 캐스케이드에서 정의 된 소정의 단계에서의 시그널링 이벤트를 개시한다. 발현 된 목적 단백질의 활성이 얻어지는 신호 전달 경로의 판독에 따라, 상류 측에 위치 또는 개시 시그널링 이벤트의 하류 경우 병용 식 반면에, 관심의 유전자의 후 조사자 평가할 수있다. 여기, 세포 사멸 폭포는 프로토콜의 기능을 보여주기 위해 정의 된 신호 전달 경로로 선정되었다. 이러한 Coxiella burnetii 등의 병원균, 박테리아 세포에서의 생존을 보장하기 위해 숙주 세포에서 숙주 세포 사멸 유도 방해 효과기 단백질을 이동시키다 촉진 그들의유기체의 보급. C. burnetii 효과기 단백질 CaeB 효과적으로 UV 광 또는 스타 우로 스포린과 함께 아폽토시스의 유도 후 숙주 세포 사멸을 억제한다. 단계 CaeB는 세포 사멸 신호의 전파를 방해하는 좁히려, 잘 특성화 프로 - 세포 사멸 활성을 선택 단백질은 독시사이클린 유도 방식으로 일시적으로 발현되었다. CaeB이 단백질의 상류 역할을하는 경우, 세포 사멸은 방해받지 않고 진행됩니다. CaeB 하류 작용하면, 세포 사멸을 억제한다. 선택된 테스트 단백질 주요 집행자 프로테아제 인 미토콘드리아의 레벨, 및 카스파 제 3, Bax의 작용에이었다. CaeB는 Bax의 발현에 의해 유도되는 세포 사멸을 방해,하지만 카스파 제 3 식으로. CaeB, 따라서,이 두 단백질 사이의 사멸 캐스케이드와 상호 작용한다.
Introduction
많은 그람 음성 박테리아 병원균의 독성은 진핵 숙주 세포를 납치 전문 분비 시스템에 따라 달라집니다. 박테리아 세포 생화학 다양한 활동을 조절하는 숙주 세포에 박테리아 병원성 단백질 (이펙터) 주입이 분비 시스템을 사용한다. 효과기 단백질의 연구는 호스트 / 병원균 상호 작용의 기본적인 양상에 또한 진핵 세포 (1)의 기초 생물학에 현저한 통찰력을 제공하고뿐만 아니라. 숙주 세포 사멸의 조절은 많은 세포 내 병원체에 대한 중요한 독성기구 것으로 도시되었으며, 세포 사멸을 조절 효과기 단백질의 수는 2-9 확인되었다. 그러나, 이들 활동의 정확한 분자 메커니즘은 많은 경우에 남아 도비.
아폽토시스 프로그램 된 세포 사멸의 형태는 감염 10의 면역 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 사멸에 이르는 두 가지 주요 경로는이확인되었다 : 원형질막 (외인성 사멸)에서 세포 사멸 수용체를 통하여 미토콘드리아 (극한 아폽토시스) 또는 신호 전달의 직접적인 타겟팅. 고유 또는 미토콘드리아 매개 세포 사멸 경로는 세포 내 신호에 의해 트리거 백스와 박,하는 Bcl-2 가족의 두 프로 - 세포 사멸 회원의 활성화를 포함한다. 이 패밀리는 세포 사멸을 조절 11-14 프로 및 안티 사멸 조절 단백질로 구성된다. 백스와 박가 세포질에 시토크롬 C 릴리스의 결과로, 미토콘드리아 외막의 후속 투과성으로 다음의 세포 사멸의 활성화는 올리고머로 연결됩니다. 시토크롬 C의 릴리스는 apoptosome을 15 카스파 제 9의 활성화를 통해 이펙터 카스파 3과 7의 활성화를 시작합니다. 이것은 다른 사람의 사이에서, 세포 표면 (16)에 포스파티딜 세린의 노출 결과, 선택된 기판의 단백질 분해로 연결하고 채널을 프래그먼트 전용 DNase의를 해제romatin (17, 18).
개별 이펙터 단백질 방해 사멸 캐스케이드 내에 유도 발현 시스템 (19)을 사용 위치를 판별하기 위해. 유전자의 조건식을위한 규제 시스템은 세포 내에서 단백질의 기능이나 조직, 기관 및 유기체 개발의 중요성뿐만 아니라, 개시, 진행 및 질병 20-23의 유지 보수시를 분석에 매우 중요한 도구왔다. 전형적으로, 이러한 시스템 테트 금회 24 유도 성 제어 시스템은 인공 전사 부 (도 1 참조)를 형성한다. 하나의 컴포넌트는 전사 활성화 또는 24, 26 사일런을 매개 포유류 단백질 도메인 박테리아 전사 리프레 TetR 25의 융합에 의해 형성 TTA (테트라 사이클린 - 의존성 전사 활성제)라고 인위적 조작 된 전사 인자이다. 2 성분은 하이브리드프로모터, 적어도 TATA 박스 및 전사 개시 부위를 포함하는, 진핵 최소 프로모터로 이루어진, TRE (테트라 사이클린 - 반응 요소)라고 TetR, TETO 24,25 대한 동족 DNA 결합 부위의 다중 반복에 접합. 제 3 성분은 TetR, 테트라 사이클린 또는 독시사이클린 또는 anhydrotetracycline 25 그의 유도체, 하나의 천연 리간드이다. 문화 매체에 리간드 또한시, TetR는 TETO에 대한 친 화성을 잃고 트레에서 해리. 결과적으로, 표적 유전자의 전사가 폐지된다. 형질 전환 유전자 발현, 즉, 단단히 모두 세포 배양 시간 및 용량 - 의존적으로 동물 20,23,24 제어 될 수있다. TTA으로, 도입 유전자의 발현은 항생 물질의 존재를 제외하고는 구조적으로 발생한다. 테트라 사이클린 제 트랜스 expressio 전에, 시스템으로부터 제거되어야하기 때문에 이는 세포 독성 또는 발암 단백질의 연구에서 불리 할 수있다N이 발생하고 세포에 표적 단백질의 효과를 모니터링 할 수있다. 이것은 많은 시간이 소요될 수 특히 형질 전환 동물 (27)에, 항상 완전하지 않습니다 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 독시사이클린의 존재에 응답하여 역으로 TetR 변이주 새로운 전사 인자를 생성하는 데 사용 된, rtTA 28 (TTA 역방향). 그것은 단지 TRE에 결합하고, 부수적으로, 독시사이클린의 존재 하에서 전사를 활성화시킨다. 시스템, 즉 잔류 leakiness., TRE - 결합 전사 인자의 부재하에 트랜스 유전자 발현, 게놈 통합 사이트 위치 효과로부터의 (ⅰ)을 발생, (ⅱ) TRE 자체 (29), 또는 (ⅲ) 비부터 특이 TTA / rtTA 28의 결합, 추가 전사 사일런서를 도입하여 해결하고, 시스템 (테트라 사이클린 - 의존성 전사 소음기) (30)를 TTS 불린다. 그것은 rtTA (도 1 참조)과 함께 이중 조절기 네트워크를 형성한다.독시 싸이클린이없는 경우, TTS는 트레에 결합 적극적으로 남아있는 전사를 종료합니다. 독시사이클린의 존재 하에서 TTS는 TRE로부터 해리 rtTA 동시에 표적 유전자의 발현을 유도 결합한다. 엄격이 추가 레이어는 활성이 높은 세포 독성 단백질 31-34을 표현하는 것이 필요하다.
이 엄격하게 제어 듀얼 레귤레이터 시스템을 사용하여 세포 사멸 캐스케이드 주어진 이펙터 단백질이 아폽토시스 유도를 방해 할 수 있는지 여부를 분석 할 수 있도록 정의 단계에서 시작될 수있다. 이 방법은 세균 효과기 단백질의 세포 자멸 억제 활성을 연구하기 위해 사용될뿐만 아니라, 프로 - 세포 사멸 또는 독성 단백질의 발현을위한 유도 성 또는 다른 신호 전달 경로와 간섭을 해부 용 수 없다.
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Protocol
관심의 단백질을 발현 안정적인 세포주 1 세대
- 열 - 불 활성화 FCS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 용지를 준비 시판 Dulbecco's은 루타-I, 피루브산 4.5 g / L D- 글루코스로 보충 된 이글 중간 (DMEM)를 수정한다.
- 5 % CO 2에서 37 ° C에서 미디어 HEK293 세포를 배양. 모든 사흘 세포를 하위 육성. 용지를 제거하고 15 ml의 신선한 매체 세포를 재현 탁. 새로운 75cm 2 세포 배양 플라스크에 넣고 피펫 1ml를 14 ml의 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 혈구를 이용하여 세포 수를 분석한다.
- 웰 당 2 × 105 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시드 HEK293 세포는 24 시간 동안 배양한다.
- 형질 감염을 위해 형질 전환 시약의 제조업체에서 제공하는 프로토콜을 사용한다. 형질 전환 시약을 사용하여있는 pEGFP-C2 나있는 pEGFP-C2-CaeB와 세포를 형질. 사용 형질 reag을 따뜻하게 이전ENT과 RT에 필요한 매체. DNA로 형질 전환 시약 : 1 비율 3을 사용합니다.
- 구체적으로는, 피펫 직접 무 혈청 DMEM 배지 50 ㎕를 형질 감염 시약으로 1.5 μL. 복합체 형성의 경우, 트랜 스펙 션 시약 혼합물을 함유하는 DNA 인코딩 GFP 또는 GFP-CaeB 0.5 μg의 피펫 및 RT에서 15 분 동안 배양한다.
- 적가 방식으로 반응 혼합물을 첨가하여 세포를 형질 감염 24 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 배양한다.
- 1 ㎎을 추가 / 5 % CO 2에서 37 ° C에서 GFP 양성 클론의 선택을 위해 네티 ㎖로.
- 1 비율 : 6 일 후, 1 중간 HEK293 상층 액을 품고 96 웰 플레이트에 정렬 유동 세포 계측법에 의해 단일 세포를 분리. 4,966 × g으로 15 분간 원심 분리 하였다 배양 합류 HEK293 세포로부터 HEK293 상등액을 생성한다.
- 다음 날, 배지를 포함하는 1.5와 배지를 대체0; ㎎ / ㎖ 네티. 일주일에 한 번 미디어를 변경합니다. 세포가 컨 플루 언트 단일 층을 형성하는 경우, 24 웰 플레이트로 옮긴다. 1.5 mg의 / ml의 제 네티 함유 배지에서 5 : 1의 비율로 일주일에 두 번 세포를 서브 배양. 마지막으로, 면역 블롯 분석에 의해 GFP 양성 세포의 비율을 분석하고 유동 세포 계측법.
면역 블롯 분석에 의한 안정적인 세포주 2. 분석
- 상층 액을 제거하고 따뜻한 PBS로 한 번 부착 된 세포를 씻으십시오. -20 ° C에서 5 ° C에서 95 분, 상점 배 램 믈리 시료 완충액, 열 100 ㎕에 세포를 재현 탁.
- 12 % SDS-PAGE 겔에 샘플 당 약 4 × 10 4 세포를로드합니다. 또한, 분자량 마커로서 상업적 단백질 사다리 하중 6 μL. 1X 실행 램리 버퍼 45-60 분 동안 180 V의 정전압 하에서 겔 전기 시스템에서 젤을 실행.
- PVDF 막 위에시킨다 단백질 (0의 기공 크기.트랜스 - 블롯의 SD 세미 드라이 전송 셀을 사용하여 60 분 동안 16 V의 정전압에서 45 μm의).
- PBS 중 5 % 탈지 분유 10 ㎖ / 0.05 % 트윈 20 (MPT) RT에서 1 시간 동안 블럭 막.
- MPT 4 ㎖에 방지 GFP 항체의 4 μl를 희석하고 4 ℃에서 막 O / N을 품어.
- 10 ml의 PBS / 0.05 % 트윈 (Tween) 20 세에서 10 분 세척 단계를 수행한다.
- MPT 4 ㎖의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 접합 이차 항체 0.8 μL와 함께 막을 인큐베이션.
- RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, PBS로 세포막을 세 번 세척 / 0.05 % 트윈 20 (2.6에 기술 된 바와 같이) 및 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화하기 위해 필름 개발을위한 표준 장비를 적용합니다.
3. 흐름 사이토를 사용하여 세포를 분석 할 수 있습니다.
- PBS로 세포를 재현 탁. 순방향 SC를 조정할 음성 대조군으로서 HEK293 세포를 사용atter (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC) 세포 규모되도록. 세포는 이중, 단위 및 세포 파편을 제외하여 살아있는 세포에 게이트를 그립니다.
- 흠없는 세포가 훨씬 FL1 채널 (488 nm의 아르곤 레이저)에 대한 히스토그램의 왼쪽에 있도록 광전자 증 배관 (PMT)의 이득을 조정합니다.
- HEK293-GFP 및 HEK293-GFP-CaeB 세포의 형광 강도를 분석하는 FL1 채널의 히스토그램을 열고 게이트 모집단 만 이벤트를 취득.
- 상업적 FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.
유도 성 발현 벡터 시스템과 안정적인 세포주 4. 형질
- 종자 HEK293 세포를 안정적 / 웰의 1 × 105 세포의 밀도로 12 웰 플레이트에서 GFP 또는 GFP-CaeB 표현.
- 19 시간 후 - 시드, 레귤레이터 플라스미드 및 응답 플라스미드 중 인코딩 Bax의 또는 활성화 된 카스파 제 3 세포를 공동 - 형질.
- 안정된 HEK293 세포를 공동 트랜pWHE125-P 레귤레이터 플라스미드 100 NG (그림 2)와 응답 플라스미드 pWHE655-hBax 또는 pWHE655-revCasp3 (그림 3)과 폴리에틸렌 이민 0.4 μL의 100 NG와.
- 옵티-MEM 배지의 75 μL의 DNA와 폴리에틸렌 이민 형질 전환 시약을 각각 준비하고 실온에서 정확히 5 분 동안 품어. 복합체 형성의 경우, RT에서 15 분 동안 혼합물 모두를 함께 배양한다.
- 폴리에틸렌 이민 / DNA 용액 드롭 현명한 세포를 추가하고 5 % CO 2에서 37 ° C에서 품어.
세포 사멸 5. 유도
- 트랜 스펙 션 후 5 시간은 배지 1 μg의 / ㎖의 독시사이클린을 첨가하여 프로 - 세포 사멸 단백질의 발현을 유도한다. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 18 시간 동안 세포를 인큐베이션.
면역 블롯 분석에 의한 숙주 세포 사멸 6. 분석
- 시간 전에 세포 검사광학 현미경 arvesting하는 세포 사멸 유도를 확인합니다. 사멸 세포가 죽어가는 세포를 둘러싸는 세포 자멸 소체의 존재시켜 검출한다.
- 상층 액을 제거하고 따뜻한 PBS로 한 번 부착 된 세포를 씻으십시오. -20 ° C에서 5 ° C에서 95 분, 상점 배 램 믈리 시료 완충액, 열 100 ㎕에 세포를 재현 탁.
- 12 % SDS-PAGE 겔에 샘플 당 약 4 × 10 4 세포를로드합니다. 또한, 분자량 마커로서 상업적 단백질 사다리 하중 6 μL. 1X 실행 램리 버퍼 45-60 분 동안 180 V의 정전압 하에서 겔 전기 시스템에서 젤을 실행.
- 트랜스 - 블롯 SD 세미 드라이 전송 셀을 사용하여 60 분 동안 16 V의 전압을 일정 PVDF 멤브레인 상에 도말 단백질 (0.45 ㎛, 기공 크기).
- PBS 중 5 % 탈지 분유 10 ㎖ / 0.05 % 트윈 20 (MPT) RT에서 1 시간 동안 블럭 막.
- 4 μ를 희석MPT 4 용액에 안티 - 절단 폴리 ADP 리보오스 중합 효소 (PARP) 항체의 L과 4 ° C에서 O / N을 품어.
- 10 ml의 PBS / 0.05 % 트윈 (Tween) 20 세에서 10 분 세척 단계를 수행한다.
- 4 ML의 MPT에 희석 0.8 μL 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 - 복합 이차 항체와 세포막을 품어.
- RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, PBS로 세포막을 세 번 세척 / 0.05 % 트윈 20 (6.7에 기술 된 바와 같이) 및 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화하기 위해 필름 개발을위한 표준 장비를 적용합니다.
- 7 ml의 서쪽 오점 스트립 버퍼로 실온에서 30 분 배양에 구속 항체를 제거합니다.
- PBS로 세 세척 / 0.05 % (6.7에서 설명) 트윈 (20) 후, 4 ℃에서 MPT O / N의 4 용액에 안티 굴지 항체의 4 μL와 세포막을 조사.
- (6.7에서 설명) MPT 세 세척 단계 후, 호 0.8 μL와 세포막을 품어rseradish 퍼 옥시다아제 접합 이차 항체는 MPT 4 ㎖에 희석 하였다.
- RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, 0.05 % / PBS로 막은 6.7에 기재된 트윈 20 (세 번 세척하고 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화 막 개발 표준 장비를 적용한다.
참고 : 모든 배양 단계가 지정된 시간과 온도에 대한 플레이트 진탕 기에서 수행되었다.
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Representative Results
먼저, GFP 융합 단백질로서 안정적으로 관심 (CaeB)의 단백질을 발현하는 HEK293 세포주를 확립 하였다. 대조군으로서, 안정적 GFP를 발현 HEK293 세포주는 또한 생성 하였다. 및 GFP-CaeB GFP의 발현은 면역 블롯 분석에 의해 확인되었다. 대표적인 면역 (그림 4A)는 GFP와 GFP - CaeB의 안정적이고 명확하게 검출 식을 보여줍니다. 모든 세포가 GFP 또는 GFP - CaeB을 표현 여부 그러나이 분석은 확인할 수 없습니다. 따라서, 안정하게 형질 감염된 HEK293 세포주는 유동 세포 계측법으로 분석 하였다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, 양쪽 세포주에서 세포의 90 % 이상은 GFP를 발현. 따라서, 이들 안정적인 세포주는 또한 CaeB의 기능을 분석하는데 사용될 수있다. 다음 단계에서, CaeB의 세포 자멸 억제 활성은 PARP 절단에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯 분석으로 측정 하였다. 핵 PARP의 단백질 분해 절단은 DNA 수리 활동을 비활성화하고 TERMI의 일반적인 마커세포 사멸의 최종 단계. PARP의 분열은 GFP의 발현,도 GFP - CaeB의도가 세포에 독성이 있음을 보여주는 HEK293-GFP 또는 HEK293-GFP - CaeB 세포에서 감지되지 않습니다. 세포가 스타 우로 스포린 처리 한 경우에는, 고유의 세포 사멸의 강력한 유도제는, PARP의 분열은 (그림 5) 검출되었다. 중요한 것은, HEK293-GFP-CaeB 세포 Coxiella burnetii 타입 IV 분비 시스템 이펙터 단백질 CaeB 7의 세포 자멸 억제 활성을 나타내는, PARP의 절단을 감소 나타낸다.
단계 CaeB는 세포 사멸 경로를 방해하는 분석하기 위해, 구정 온 시스템을 사용 하였다. 구체적으로, HEK293-GFP 또는 HEK293-GFP - CaeB 세포 레귤레이터 플라스미드는 구조적으로 독시사이클린 제어 듀얼 리프레 / 활성 설정 (그림 2)와 PTRE 응답 플라스미드 인코딩 중 전체 길이 인간의 Bax의 또는 활성화 된 형태의 표현 형질했다 인간 카스파 제 3, (revCasp 3로 명명그림 3). 비 유도 조건을 (그림 6)에서 PARP 절단의 부족에 의해 입증 된 바와 같이이 시스템은 긴밀하게 조절된다. 형질 감염된 세포에 독시 싸이클린의 추가는 Bax의 발현 또는 revCasp 3. CaeB 다음 표현과 Bax의 후속 활성화에 의해 생성 된 세포 사멸 신호가 CaeB 식에 의해 차단되어야한다 Bax의 하류의 세포 사멸 경로, 방해하는 경우에 발생했습니다. 실제로, HEK293 세포를 안정적으로 표현 GFP - CaeB는 HEK293-GFP 세포는 분명 PARP 절단을 표시하면서 깊이, 독시 싸이클린 제어 Bax의 발현에 의해 세포 사멸 유도를 억제한다. 이 결과는 것을 나타냅니다 Bax의 활성화의 다운 스트림 CaeB 블록 세포 사멸 유도가. 세포 사멸 경로에 늦은 이벤트 - 다음, 그것은 CaeB가 카스파로 3 활성화를 방해 할 수 있는지 여부를 분석 하였다. 효과기 카스파 제 3 일단 액티브임을 나타내는 HEK293-GFP 세포뿐만 아니라 HEK293-GFP-CaeB 세포, 전시 PARP 절단 (도 6),ated, CaeB가 발생하지 사멸을 막을 수 없습니다. 카메라 함께, 이러한 데이터는 CaeB가 백스와 카스파 제 3의 활성화 사이에 작용하는 것을 보여줍니다.
그림 테트라 사이클린 규제 시스템의 도식 개요. 구정 온 시스템은 두 개의 서로 다른 플라스미드, 규제 및 응답 플라스미드로 구성되어있다. 그리고 구정 응답 역 transactivator (rtTA, 열린 원) 규제 플라스미드는 구정 응답 transsilencer (채워진 원 TTS)을 인코딩합니다. 두 단백질은 구조적으로 강한 구성 적 신장 요인 1 알파 발기인 (P EF-1A)의 제어에 의해 표현된다. TTS 및 rtTA는 키메라 (각각, 소음기 또는 활성화) 진핵 생물의 전사 조절 도메인으로 구성된 전사 인자와 세균 테트라 사이클린 리프레 (TetR)입니다. TetR는 DNA를 칠 TET에 결합 중재 (TETO) 시퀀스. TETO 함께 구정 응답 요소 (TRE)을 형성, 유도 최소한의 사이토 메갈로 바이러스 프로모터 (P CMV)의 상류에 위치한다. 조건을 비 유도에서, TTS는 표현을 방지 트레에 바인딩됩니다. 독시 싸이클린의 추가 (Dox가, 가득 다이아몬드) 후, rtTA는 Dox가이 구조적 변화와 활성화로 이어지는와 상호 작용합니다. 활성화 rtTA 따라서 세포 사멸 유도 및 세포 죽음에 이르는, 각각의 표적 유전자와 Bax 및 카스파 제 3의 전사를 허용, 응답 플라스미드에 TTS를 대체합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
규제 플라스미드 pWHE125 그림 2. 도식 개요. 혈중 알코올 농도에 전파 요소가 필수teria, 복제 원점 (오라이 PBR) 암피실린 대하여 항생제 내성 카세트 AMP (R)를 포함하며, 인간 사이토 메갈로 바이러스의 강한 구성 적 즉시 초기 프로모터 / 인핸서와 같은 테트 - transregulators의 식 (P 대 / E HCMV), 소아마비 바이러스 (PV-IRES)와 유인원 바이러스 40 (SV40 폴리 -A) 표시됩니다에서 폴리 -A-사이트에서 내부 리보솜 결합 사이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
응답 플라스미드의 그림 3. 도식 개요. 요소가 복제 원점 (오라 PBR)과 항생제 내성 카세트 (앰프 R)를 포함하여 세균의 증식에 필수적인, 및 형질 전환 유전자 expressi 같은 진핵 생물에서 유도 발현구정에 의존하는 최소한의 발기인 TREtight (P TREtight),이자 인간의 Bax의 (hBax)의 유전자와 유인원 바이러스 40 (SV40 폴리 -A)에서 폴리 -A 사이트와 카세트에 그려져있다. 유전자 발현 카세트는 닭 HS4 절연체 코어 시퀀스 (HS4 코어)의 두 사본의 탠덤 직접 반복에 의해 형벌이다. 또한, 쥐 포스 포 키나제 1 프로모터 (P mPGK)로 구성된 G418 저항 카세트, 네오 마이신 내성 유전자 (G418 R)과 인간의 티미 딘 키나제 폴리 -A 사이트 (TK 폴리 -A)이 존재한다. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
그림 4. HEK293-GFP 및 HEK293는-GFP는-CaeB 안정적으로 녹색 형광 단백질을 표현한다. (A) HEK293-GFP와의 전체 세포 용 해물HEK293-GFP - CaeB 세포는 안정적인 표현을 보여 GFP에 대한 immunoblotted했다. HEK293-GFP 및 HEK293-GFP - CaeB 세포의 (B)의 대표 유동 세포 계측법 (외과) 분석 GFP 발현의 강도를 보여주기 위해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 스타 우로 스포린에 의한 세포 사멸. HEK293-GFP 및 HEK293-GFP - CaeB 세포에 GFP - CaeB의 발현 5. 효과는 고유의 세포 사멸을 유도하기 위해 6 시간 동안 4 μm의 스타 우로 스포린 처리 하였다. 아폽토시스는 절단 된 PARP의 면역 블롯 분석에 의해 분석 하였다. PARP 절단은 HEK293-GFP 세포에 비해 HEK293-GFP - CaeB 세포에서 감소되었다. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의.
코스닥 시스템의 그림 6. 사용법 CaeB의 행동의 포인트를 좁힐 수 있습니다. (A) 세포 사멸은 HEK293-GFP 및 HEK293-GFP - CaeB 세포에서 Bax의 발현에 의해 유도했다. 아폽토시스는 절단 된 PARP의 면역 블롯 분석에 의해 분석 하였다. PARP 절단-GFP는 HEK293 세포에 비해 HEK293-GFP-CaeB 세포에서 감소되었다. (나) 세포 사멸은 HEK293-GFP 및 HEK293-GFP - CaeB 세포에서 revCasp 3의 발현에 의해 유도했다. 아폽토시스는 절단 된 PARP의 면역 블롯 분석에 의해 분석 하였다. PARP 절단은 HEK293-GFP - CaeB 및 HEK293-GFP 세포에서 비교했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
많은 병원성 박테리아는 분비 또는 숙주 세포에 박테리아 효과기 단백질을 분비하기 위해 이동시키다 시스템 항구. 이러한 이펙터 단백질은 박테리아가 생존하고 각 세포의 틈새 내에 복제 할 수 있도록 숙주 세포에서 처리하고 경로를 조절하는 능력을 갖는다. 생화학 활동 및 효과기 단백질의 분자 메커니즘을 이해하면 병원성의 더 나은 이해를 향해 도움 질병을 퇴치하기위한 새로운 치료 도구 개발하는 데 도움이 될 수있다. 더욱이, 효과기 단백질 자주 숙주 세포 활동을 모방하여 그 기능을 발휘하는 것처럼, 이들은 또한 하나의 진핵 세포 생물학에 대한 자세한 내용을 사용할 수있다. 효과기 단백질 중 1) 기능의 중복, 효과기 단백질의 결합, 2) 시간 조절 및 3) effec : 그러나, 단일 이펙터 단백질의 생화학 적 활성을 연구하는 것은 여러 가지 이유로 복잡 할 입증그 기능을 방해, 다른 이펙터 단백질과 문맥에서 작업 토르 단백질. 따라서, 이펙터 단백질의 활성은 일반적으로 과발현 연구가 검토되고있다. 불행하게도, 이펙터 단백질의 과발현 과도의 사용은 몇 가지 단점이 있습니다. 따라서, 단지 단일 세포 분석법 분석을 이용할 수 있고, 이펙터 단백질의 활성이 다른 이펙터 단백질의 활성에 의존하는 경우 이펙터 단백질의 활성을 분석 할 수 없다. 적어도 제 단점을 극복하기 위해서, 안정한 세포주가 사용될 수있다. 경우에 효과기 단백질의 발현은 셀이 적합하지 않다 독성이다. 우리는 세포 사멸 유도 단백질 (아래 참조)의 일시적인 발현을 위해 여기에서 설명하는 바와 같이,이 시나리오에서, 안정하고 유도 세포주 유사한 시스템을 사용하여 확립 될 수있다. 그러나, 우리의 결과 (도 5) CaeB의 발현이 세포 사멸을 겪는 세포를 보호하고, 따라서이 아니라고 보여독성. 하는 CaeB는 세포 사멸 유도를 방해하는 세포 사멸 캐스케이드 내에서 단계 해부에 몇 가지 옵션이 있습니다. 하나의 가능성은 CaeB의 숙주 세포 결합 파트너를 결정하는 것이다. 그러나, 이는 매우 도전하고 결합 파트너의 동정은 아폽토시스 캐스케이드 내의 CaeB의 작용점을 설명하는 데 도움이되지 않을 수 있습니다. 또 다른 가능성은 상이한 세포 자멸사 유도제를 사용하는 것이지만 CaeB이 방법은 또한 CaeB의 작용점의 식별 이어질하지 않을 수도 있음을 나타내는, 두 개의 다른 아폽토시스 유도제, UV 광 및 스타 우로 스포린 (7)에 의해 세포 자멸 유도를 억제한다. 여기에 이용 된 CaeB의 작용점을 좁히는 다른 가능성은, 세포 사멸 신호 전달 캐스케이드 정의 단계에서 유도 될 수있는 시스템을 사용하는 것이다.
관심의 단백질이 이미 세포 생리학, 그 expre 방해로 선정 된 세균의 이펙터 단백질의 경우 발현ssion은 또한 목적 단백질을 발현하는 데 사용되는 하나로서, 예를 들어 유도 성 발현 시스템의 제어하에 둘 수있다. 리간드는 세포 생리에 차등 효과 셀을 모니터링하는 조사원을 허용하고 시스템 출력 신호의 세포 배양에 첨가 될 때 그 다음, 관심 대상 단백질의 양의 단백질 발현을 수반하여 유도 될 것이다.
관심있는 단백질은 선택된 경로의 생리 활성을 방해하는 경우 분명히, 목적 단백질의 발현과 선택된 경로 유도 단백질의 발현에 의해 특정 세포 내 경로에서의 그것의 동작 포인트를 식별하려는 것은 잘 작동. 이 경우, 판독은 보통 이러한 Wnt 신호의 경우에는 세포 사멸 시그널링 또는 전사 활성화의 경우 세포사로서, 경로와 연관된 신호의 결여는 간단하다. 원칙적으로, 특정 경로를 활성화 단백질이 t로 프로빙 할 수있다분석 시스템의 타 입. 그것만의 Si / 쉬의 유도 성 발현을 사용하여, 예를 들면, 다르게 설정되어야 / miRNA의 통로 단백질에 대해 관심있는 단백질이 신호 전달 경로를 구출 할 경우 검사. 대안 적으로, 특정 단백질의 소분자 억제제는 통로 내 신호 전달을 방해하는 데 사용될 수 있으며, 다음 관심있는 단백질의 발현에 의해 유도 통로 구조를 확인하기 위해. 그러나, 이러한 유형의 접근법은 위에서 제시된 실험 프로토콜보다 더 어려울 것이다.
표적 유전자의 선택은 수월 원칙적 간섭 분석이다에서 프로빙된다. 그것은 미세 조정에 경로와 상호 작용의 관심의 사이트의 단백질의 식별 가능한 선택 신호 경로의 단백질의 많은 테스트를하는 것이 가장 좋습니다. 항상 모든 잠재적 년 Interac를 모니터링 실험적으로 가능 또는 불가능하므로 이는, 반복적 인 방식으로 수행되어야하나의 실험에서 기 파트너. 따라서, 먼저 첫 번째 라운드에서 얻은 정보를 사용하여 실험을 구체화 한 다음 전체 경로를 따라 균등하게 이격 여러 단백질을 시험하는 것이 최상이다. 신호 전달 경로, 많은 단백질들은 단백질 분해 절단로서는, 인산화 또는 sumoylation 또는 이벤트 처리에 의해서와 같이 공유 결합에 의해 변형하거나, 번역 후 수정된다. 따라서, 각각의 단백질은 접지 상태 또는 활성화 된 형태 중 하나이다. 가능하다면, 그 이유는 두 가지 단백질의 두 형태를 테스트하는 것이 최상이다. 하나는 활성화 된 형태가 관심 단백질보다 엄격한 도전을 제시 높은 출력 신호 (31)를 제공한다는 것이다. 우리의 원리 증명 예, 세포 사멸 신호에서 카스파 제 3 단백질 분해 절단 및 이합체에 의해 활성화된다. 이 활성화 이벤트는 미처리 프로 카스파 유전자 재 배열로 인공적으로 시뮬레이션 될 수있다. 작은 소단위 인위적 배치큰 서브 유닛의 전면과 모두에서 링커에 의해 연결된다. 이것은 "후진 카스파"를 지칭하고 35로 표현 될 때, 효소의 활성화 된 형태를 나타내고있다. 그것은 때문에 활동의 더 높은 수준으로 선택되었다. 통로 단백질의 접지 상태와 활성화 된 형태를 모두 프로빙 번째 이유는 관심있는 단백질이 표적 단백질의 활성화를 방해하는 경우 하나가 구별 할 수 있기 때문에, 또는 그 하류 경로에서 단백질의 역할을하는 경우. 첫 번째 경우, 접지 상태 양식 표현하면 세포 사멸을 억제 할 것이지만, 활성 형태가 존재하지 않을 경우. 두 번째의 경우, 어느 단백질은 세포 사멸로 이어질 것입니다. 따라서, 변형 된 단백질 형태의 양을 테스트하는 것은 분석 시스템의 해상도를 향상시킨다.
유도 성 발현 벡터에서 표적 유전자를 복제하는 것은 몇 가지 결정을 필요로한다. 벡터가 S 인 경우 먼저, 표적 유전자의 발현은 일시적으로 발생하거나한다 낫다tably 숙주 세포주의 게놈으로 통합? 단지 일시적인 발현이 요구되는 경우, 그러한 테트 - 의존성 프로모터 및 폴리 -A 부위, 또는 유전자의 PBI-2 또는 PBI-3 (36), 한 쌍의 발현과 같은 양방향 벡터를 포함 pUHC13-3 24과 같은 단순한 벡터 표적 유전자의 발현을 쉽게 모니터링 리포터 유전자의 발현의 관심, 충분할 것이다. 안정한 발현이 바람직한 경우, 예컨대 pWHE655 (33) (도 3)와 같은 벡터를 사용한다. 그것은 유도 성 유전자의 발현을 방해하는 게놈 통합 사이트 위치 효과를 방지하기 위해 유전자 발현 유닛의 측면에 절연체를 포함한다. 또한, 벡터 통합 이벤트의 선택을 용이하게하기 위해 G418, 저항성 카세트를 연결되지만 독립적 표현 포함. 이러한 변형의 최종 결과는 우수한 특성 33,37,38 규제와 클론의 수의 증가이다. cDNA를 자체표적 유전자는 quences를 EcoRI 및 EcoRV로 (33)에 대한 유일한 제한 부위를 사용하여이 벡터로 클로닝 될 수있다. 역방향 카스파 제 -3의 cDNA를 발현 벡터의 클로닝 인간 Bax의 기준은 유사하게 수행 된 발현 벡터의 클로닝 (33)에 상세히 기술되었다. Bax의 인간 cDNA를 제한 효소 EcoRI 및 EcoRV로위한 제한 부위를 도입 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 pVenus-Bax의 39로부터 PCR로 증폭 하였다. 두 효소 PCR 단편을 정제하고 제한 후, 단편 pWHE655TREtight-Bax의 항복, 마찬가지로 제한 pWHE655 결찰 하였다. 둘째, 최소하는 프로모터는 유전자 발현에 가장 적합한? 원래 최소한의 프로모터 P HCMV * -1 기능 인터페론 α 유도 응답 요소 (29)의 존재로 인해 일부 (24) 표시 일부 세포 형 특정 leakiness 30. 이것은 두 번째 세대의 개발을 주도 테트 의존발기인은 Teto의 요소 사이의 서로 다른 최소한의 프로모터 서열 33,40-42와 변경된 간격 및 시퀀스 ΔMtetO, TREtight 및 SG-트레를,라고. 그들은 크게 독시사이클린 (doxycycline)의 부재에 leakiness을 감소 표시합니다. 이러한 2 세대 프로모터 중에서 ΔMtetO는 독시사이클린 (33)의 존재하에 낮은 트랜스 진 발현 수준을 갖는다. TREtight은 트랜스 식 (33)의 중간 및 SG-TRE 높은 수준을 매개한다. 또한, 변형은 테트라 사이클린 반응성 프로모터 더욱 43,44 배경 식 최소화했다. 따라서, 테트라 사이클린 반응성 프로모터의 선택은 각각의 형질 전환 유전자의 제한 또는 요건에 따라 제조 될 수있다.
실험 방법의 유형에 독립적, 목적 단백질의 발현의 기밀성이 중요하다. 예를 들어, 프로 - 세포 사멸 단백질의 활성화 된 형태의 세포 사멸 유도 세포에 이르게각각의 표적 단백질의 최소한의 양이 31 ~ 33을 표현 사망. 필요한 엄중 조건 규제 시스템 (30)에 테트라 사이클린 의존성 transsilencer 첨가함으로써 달성된다. 이 유도 성 프로모터에서 전사가 적극적으로 일시적인 형질을 수행 할 때 그들은 일반적으로 자신의 유전자 발현 30 오히려 새는 때문에, 특히 중요하다, 억압되는 것을 보장한다. 세포 사멸을 유도하지 않는 신호 전달 경로를 탐색 할 경우 transsilencer 교번 43,44 사용될 수없는 표적 유전자 발현의 조절에 대한 엄격한 요구 사항은 완화 및 유도 시스템 일 수있다.
신호 전달 경로를 조사하는 데 사용되는 유도 성 조절 시스템 테트 시스템 일 필요는 없다. 주요 장점은 집중적 지금 20 년 이상 포유 동물 세포에서 사용되었음을이며인지 가장 높은 개발 및 제일 CHaracterized 유도 제어 시스템. 그럼에도 불구하고, 대안 적으로, 또는 테트 시스템에 더하여 사용될 수 적어도 25 다른 조건부 규제 시스템 45, 46가있다. 두 개 또는 세 개의 다른 유도 시스템은 신호 전달 경로 수렴을 프로빙 또는 표적 유전자 또는 관심의 단백질 중 하나의 중복을 테스트하기 위해 유용 할 수 있습니다.
여기에 제시된 절차는 프로빙 각 신호 전달 경로에서 견고하고 안정적인 출력 신호 발생 형질 전환 효율로 작동한다. 안정한 세포주는 동질적인 방법 (도 4B)에 대한 관심의 단백질을 발현하기 때문에, 일시적으로 관심의 단백질을 발현 유도 성 플라스미드로 형질 감염되어 모든 셀 경로 신호와 관심 단백질의 간섭게나.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
References
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