Abstract
Tekniken presenteras här tillåter en att analysera på vilket steg ett målprotein, eller alternativt en liten molekyl, interagerar med komponenterna i en signalväg. Metoden är baserad, å ena sidan, å inducerbart uttryck av ett specifikt protein för att initiera en händelse signalerings vid en definierad och förutbestämt steg i det valda signaleringskaskad. Samtidig uttryck, å andra sidan, av genen av intresse då tillåter forskaren att utvärdera om aktiviteten hos det uttryckta målproteinet är placerad uppströms eller nedströms om den initieras signalerings händelsen, beroende på utläsningen av signalvägen som erhålls. Här var apoptotiska kaskaden valts som en definierad signalväg för att visa protokoll funktionalitet. Patogena bakterier, såsom Coxiella burnetii, translokera effektorproteiner som stör värd celldöd induktion i värdcellen för att säkerställa bakterie överlevnad i cellen och att främja derasspridning i organismen. C. burnetii-effektorprotein CaeB inhiberar effektivt värd celldöd efter induktion av apoptos med UV-ljus eller med staurosporin. Att begränsa antalet vid vilket steg CaeB stör utbredningen av den apoptotiska signalen, selekterades proteiner med välkarakteriserad pro-apoptotisk aktivitet uttryckt transient i en doxycyklin-inducerbart sätt. Om CaeB agerar uppströms av dessa proteiner, kommer apoptos fortsätta obehindrat. Om CaeB agerar nedströms kommer celldöd hämmas. Test proteinerna valdes ut var Bax, som verkar vid nivån för mitokondrierna, och kaspas 3, vilket är det största bödeln proteas. CaeB stör celldöd inducerad av Bax uttryck, men inte av kaspas 3 uttryck. CaeB således samverkar med den apoptotiska kaskaden mellan dessa två proteiner.
Introduction
Virulensen av många gramnegativa bakteriella patogener beror på specialiserade sekretionssystem för att kapa eukaryota värdceller. Bakterier använder dessa sekretionssystem för att injicera bakteriella virulensproteiner (Effekten) in i värdcellen för att modulera en mängd cellulära och biokemiska aktiviteter. Studiet av effektorproteiner har inte bara gett anmärkningsvärd inblick i grundläggande aspekter av värd / patogen interaktioner men också i den grundläggande biologi eukaryota celler 1. Modulering av värdcell apoptos har visat sig vara en viktig mekanism virulens för många intracellulära patogener, och ett antal effektorproteiner modulerar apoptos har identifierats 2-9. Men deras exakta molekylära mekanismer av aktivitet förblir svårfångade i många fall.
Apoptos, en form av programmerad celldöd, spelar en viktig roll i immunsvar mot infektion 10. Två huvudvägar som leder till apoptos haridentifierats: targeting mitokondrierna (intrinsisk apoptos) eller direkt transduktion av signalen via celldödsreceptorer på plasmamembranet (extrinsic apoptos). Den inneboende eller mitokondrier-förmedlad celldöd vägen utlöses av intracellulära signaler involverar aktivering av Bax och Bak, två proapoptotiska medlemmar av Bcl-2 familjen. Denna familj består av pro- och anti apoptotiska regulator proteiner som styr celldöd 11-14. Aktivering av apoptos leder till oligomerisering av Bax och Bak följt av efterföljande permeabilization av mitokondriell yttre membran, vilket resulterar i cytokrom C släpps ut i cytoplasman. Cytokrom C frisättning initierar aktivering av effektor kaspaser 3 och 7 genom aktivering av kaspas 9 i apoptosome 15. Detta leder till proteolys av valda substrat som, bland andra, resulterar i exponeringen av fosfatidylserin på cellytan 16 och frigör en dedikerad DNas att fragment chromatin 17,18.
För att avgöra var inom den apoptotiska kaskaden en enskild effektorprotein stör, var ett inducerbart uttryckssystem som används 19. Regelsystem för villkorligt uttryck av transgener har varit ett ovärderligt verktyg för att analysera en proteinets funktion i cellen eller dess betydelse för vävnad, organ och organism utveckling, liksom under initiering, progression och underhåll av sjukdom 20-23. Typiskt inducerbara kontrollsystem, såsom Tet-systemet 24 som används här, bildar en artificiell transkriptionsenhet (se fig 1). En komponent är en artificiellt konstruerad transkriptionsfaktor kallad tTA (tetracyklin-beroende transkription aktivator), som bildas genom fusion av bakteriella transkriptions repressorn TetR 25 till en däggdjursproteindomän som medierar transkriptionsaktivering eller ljuddämpnings 24,26. Den andra komponenten är en hybridpromotor, benämnd TRE (tetracyklin-responselement), som består av en eukaryot minimal promotor, som innehåller åtminstone en TATA-box och ett transkriptionsinitieringsställe, förenad med multipla upprepningar av det besläktade DNA-bindningsställe för TetR, tetO 24,25. Den tredje komponenten är den naturliga liganden av TetR, tetracyklin eller ett av dess derivat, såsom anhydrotetracyklin eller doxycyklin 25. Vid ligand tillsats till odlingsmediet, förlorar TetR dess affinitet för tetO och dissocierar från TRE. Som ett resultat, är transkription av målgenen avskaffas. Transgen expression kan således vara hårt kontrollerad på ett tids- och dosberoende sätt i både cellkultur och i djur 20,23,24. Med tTA sker transgenexpression konstitutivt, utom i närvaro av en tetracyklin. Detta kan vara en nackdel i studiet av cytotoxiska eller onkogena proteiner eftersom tetracyklin måste först tas bort från systemet, innan transgen expression inträffar och målproteinet effekter på cellen kan övervakas. Detta kan vara tidskrävande och är inte alltid fullständig, särskilt i transgena djur 27. För att ta itu med denna begränsning, har en TetR mutant med en invers svar på närvaron av doxycyklin som används för att generera en ny transkriptionsfaktör, rtTA (omvänd tTA) 28. Det binder endast till TRE och, samtidigt, aktiverar transkription i närvaro av doxycyklin. Återstående läckage av systemet, dvs., Transgenexpression i frånvaro av TRE bundna transkriptionsfaktor, ursprung antingen (i) från positionseffekter på en genomisk plats integration, (ii) från TRE själv 29, eller (iii) från icke specifik bindning av TTA / rtTA 28 riktades genom att införa en ytterligare transkriptions ljuddämpare, kallas TTS (tetracyklin beroende transkriptions ljuddämpare) 30 till systemet. Den bildar en dubbelregulator nätet tillsammans med rtTA (se figur 1).I avsaknad av doxycyklin, binder TTS till TRE och stänger eventuellt kvarvarande transkription aktivt. I närvaro av doxicyklin, TTS dissocierar från TRE och rtTA binder samtidigt inducera uttryck av målgenen. Detta extra lager av stringens är ofta nödvändigt att uttrycka högaktiva cytotoxiska proteiner 31-34.
Med hjälp av denna hårt kontrollerad dubbla reglersystem, kan den apoptotiska kaskaden initieras vid en definierad steg möjliggör analys av huruvida den givna effektorprotein kan störa apoptosinduktion. Denna metod kan inte bara användas för att studera den anti-apoptotisk aktivitet av bakteriella effektorproteiner utan även för den inducerbara expressionen av proapoptotiska eller toxiska proteiner, eller för att dissekera interferens med andra signalvägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av stabila cellinjer som uttrycker proteinet av intresse
- Bered medier genom tillsats av värmeinaktiverat FCS och 1% penicillin / streptomycin till kommersiellt tillgängligt Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med GlutaMAX-I, pyruvat, och 4,5 g / L D-glukos.
- Cultivate HEK293-celler i medium vid 37 ° C i 5% CO2. Under odla celler var tredje dag. Ta bort media och resuspendera cellerna i 15 ml färskt medium. Pipett 1 ml i en ny 75 cm 2 cellodlings kolv och tillsätt 14 ml media.
- Analysera antalet celler genom att använda en hemocytometer.
- Seed HEK293-celler i en 6-brunnsplatta vid en densitet av 2 x 10 5 celler per brunn och inkubera under 24 timmar.
- För transfektion använda protokollet som tillhandahålls av tillverkaren av transfektionsreagens. Transfektera celler med pEGFP-C2 eller pEGFP-C2-CaeB hjälp av transfektionsreagens. Före användning, värma upp transfektion Reagent och media krävs för att RT. Använd en 3: 1 förhållande av transfektionsreagens till DNA.
- I detalj pipett 1,5 pl av transfektionsreagens direkt i 50 | il av serumfritt DMEM-medium. För komplexbildning, pipett 0,5 | ig av DNA som kodar för GFP eller GFP-CaeB till transfektionsreagens innehållande blandningen och inkubera under 15 min vid RT.
- Transfektera celler genom tillsats av reaktionsblandningen på ett droppvis sätt och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 under 24 timmar.
- Lägg ett mg / ml geneticin för val av GFP-positiva kloner vid 37 ° C i 5% CO2.
- Efter 6 dagar, isolera enstaka celler genom flödescytometri sortering i en 96-brunnars platta som härbärgerar medium och HEK293 supematant i en 1: 1-förhållande. Generera HEK293 supernatant från odlade konfluenta HEK293-celler som centrifugerades under 15 min vid 4966 x g.
- Följande dag, ersätta odlingsmediet med medium innehållande 1,50; mg / ml geneticin. Ändra media en gång i veckan. Om cellerna bildar ett sammanflytande monoskikt, överföra dem till en 24-brunnsplatta. Sub-odla cellerna två gånger i veckan i ett förhållande av 1: 5 i medium innehållande 1,5 mg / ml geneticin. Slutligen, analysera andelen GFP-positiva celler genom immunblotanalys och flödescytometri.
2. Analys av stabila cellinjer genom immunoblotanalys
- Avlägsna supernatanten och tvätta de vidhäftade cellerna en gång med varm PBS. Resuspendera cellerna i 100 pl av 2x Laemmli-provbuffert, värme under 5 min vid 95 ° C och förvara vid -20 ° C.
- Fylla på cirka 4 x 10 4 celler per prov på en 12% SDS-PAGE-gel. Dessutom, belastning 6 pl av en kommersiell protein stege som en molekylviktsmarkör. Kör geler i en gel-elektroforessystem i enlighet med en konstant spänning av 180 V under 45-60 min med 1x Laemmli löpbufferten.
- Blot proteiner på PVDF-membran (porstorlek 0.45 | j, m) vid en konstant spänning av 16 V under 60 min med användning av en Trans-Blot SD halvtorr Transfer Cell.
- Block membran i 10 ml av 5% fettfri torrmjölk i PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) för en timme vid RT.
- Späd 4 pl av anti-GFP-antikropp i 4 ml MPT och inkubera membranen O / N vid 4 ° C.
- Utför tre 10 min tvättningssteg med 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
- Inkubera membran med 0,8 | il pepparrotsperoxidas-konjugerade sekundära antikroppar i 4 ml MPT.
- Efter 1 h inkubation vid RT, tvätta membranen tre gånger med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrivs i 2,6) och detektera pepparrotsperoxidas aktivitet med ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll. Ansök standardutrustning för filmframkallning att visualisera proteinbanden.
3. Analysera celler med en flödescytometer.
- Resuspendera cellerna i PBS. Använd HEK293-celler som negativ kontroll för att justera framåt scAtter (FSC) och sidospridning (SSC) så att cellerna är på skalan. Rita en grind på levande celler genom att utesluta cell dubletter, aggregat och cellrester.
- Justera fotomultiplikatorrör (PMT) vinst så att de ofärgade celler är längst till vänster i histogrammet för FL1-kanalen (488 nm argonlaser).
- För att analysera fluorescensintensiteten av HEK293-GFP och HEK293-GFP-CaeB celler öppna histogrammet av FL1-kanalen och förvärva 10.000 händelser gated befolkningen.
- Analysera data med hjälp av kommersiella FACS analysprogram.
4. Transfektion av stabil cellinje med Inducerbar expressionsvektorsystem
- Seed HEK293-celler som stabilt uttrycker GFP eller GFP-CaeB i en 12-brunnsplatta vid en densitet av 1 x 10 5 celler / brunn.
- 19 h efter sådd, co-transfektera cellerna med regulator plasmid och svar plasmid antingen kodar Bax eller aktiverad kaspas 3.
- Co-transfektera de stabila HEK293-cellermed 100 ng av pWHE125-P regulator plasmiden (Figur 2) och 100 ng av svars plasmiderna pWHE655-hBax eller pWHE655-revCasp3 (fig 3) och 0,4 | il av polyetylenimin.
- Förbered DNA och polyetylenimin transfektionsreagens vardera i 75 | il Opti-MEM-medium och inkubera under exakt 5 min vid RT. För komplexbildning, inkubera båda blandningarna tillsammans under 15 min vid RT.
- Lägg till polyetylenimin / DNA-lösningen droppvis till cellerna och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2.
5. Induktion av apoptos
- 5 h efter transfektion, inducerar expression av de proapoptotiska proteiner genom tillsats av 1 | ig / ml doxycyklin till odlingsmediet. Inkubera cellerna under 18 h vid 37 ° C i 5% CO2.
6. Analys av värdcell Apoptos genom immunoblotanalys
- Inspektera celler före harvesting under ljusmikroskop för att kontrollera för celldödsinduktion. Apoptotiska celler är detekterbar genom närvaron av apoptotiska kroppar kring den döende cellen.
- Avlägsna supernatanten och tvätta de vidhäftade cellerna en gång med varm PBS. Resuspendera cellerna i 100 pl av 2x Laemmli-provbuffert, värme under 5 min vid 95 ° C och förvara vid -20 ° C.
- Fylla på cirka 4 x 10 4 celler per prov på en 12% SDS-PAGE-gel. Dessutom, belastning 6 pl av en kommersiell protein stege som en molekylviktsmarkör. Kör geler i en gel-elektroforessystem i enlighet med en konstant spänning av 180 V under 45-60 min med 1x Laemmli löpbufferten.
- Blot proteiner på PVDF-membran (porstorlek 0,45 ^ m) vid en konstant spänning av 16 V under 60 min med användning av en Trans-Blot SD halvtorr Transfer Cell.
- Block membran i 10 ml av 5% fettfri torrmjölk i PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) för en timme vid RT.
- Späd 4 μl av anti-klyvd poly-ADP-ribos-polymeras (PARP) antikropp i 4 ml MPT och inkubera O / N vid 4 ° C.
- Utför tre 10 min tvättningssteg med 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
- Inkubera membran med 0,8 | il pepparrotsperoxidas-konjugerade sekundära antikroppar utspädda i 4 ml MPT.
- Efter 1 h inkubation vid RT, tvätta membranen tre gånger med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrivs i 6,7) och detektera pepparrotsperoxidas aktivitet med ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll. Ansök standardutrustning för filmframkallning att visualisera proteinbanden.
- Ta bundna antikroppar genom 30 minuters inkubation vid RT med 7 ml Western Blot Stripping buffert.
- Efter tre tvättar med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrivs i 6,7), sond membranen med 4 | il av anti-aktin-antikropp i 4 ml MPT O / N vid 4 ° C.
- Efter tre tvättsteg med MPT (som beskrivs i 6,7), inkubera membranen med 0,8 pl horseradish peroxidas-konjugerade sekundära antikroppar späddes i 4 ml MPT.
- Efter 1 h inkubation vid RT, tvätta membranen tre gånger med PBS / 0,05% Tween 20 (som beskrivs i 6,7 och detektera pepparrotsperoxidas aktivitet med ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll. Applicera standardutrustning för filmframkallning att visualisera proteinbanden.
Obs: Alla inkuberingssteg utfördes på en plattskakanordning under den angivna tiden och temperaturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Först framställdes HEK293-cellinjer som stabilt uttrycker proteinet av intresse (CaeB) som en GFP-fusionsprotein etablerad. Som en kontroll, var HEK293-cellinjer som stabilt uttrycker GFP också genereras. Uttryck av GFP och GFP-CaeB verifierades genom immunoblotanalys. Den representativa immunoblot (Figur 4A) visar stabil och tydligt påvisbar uttryck av GFP och GFP-CaeB. Däremot kan denna analys inte avgöra om alla celler uttrycker GFP eller GFP-CaeB. Därför var de stabilt transfekterade HEK293-cellinjer också analyserades med flödescytometri. Såsom visas i figur 4B, över 90% av cellerna i båda cellinjerna uttryckte GFP. Således kan dessa stabila cellinjer användas för att ytterligare analysera funktion CaeB. I nästa steg, var den anti-apoptotiska aktiviteten hos CaeB analyseras genom immunoblotanalys med användning av en antikropp mot klyvd PARP. Proteolytisk klyvning av kärn PARP inaktiverar DNA-reparationsverksamhet och är en typisk markör för terminella stadier av apoptos. Klyvning av PARP inte upptäcks i HEK293-GFP eller HEK293-GFP-CaeB celler, visar att varken uttryck av GFP, eller av GFP-CaeB är giftigt för cellerna. Men när cellerna behandlades med staurosporin, en potent inducerare av inneboende apoptos, klyvning av PARP upptäcktes (Figur 5). Viktigt uppvisar HEK293-GFP-CaeB celler minskad klyvning av PARP, vilket tyder på anti-apoptotiska aktiviteten hos Coxiella burnetii typ IV sekretionssystem effektorprotein CaeB 7.
För att analysera på vilket steg CaeB stör apoptotiska vägen, var Tet-On-systemet används. I detalj var HEK293-GFP eller HEK293-GFP-CaeB celler transfekterade med en regulator plasmid konstitutivt uttrycker en doxycyklin styrd dubbel repressor / aktivator installation (Figur 2) och en PTRE svar plasmid som kodar antingen fullängds humant Bax eller den aktiverade formen av mänsklig kaspas 3, benämnd revCasp 3 (Figur 3). Detta system är hårt reglerad, vilket framgår av bristen på PARP klyvning under icke-inducerande betingelser (Figur 6). Tillsats av doxycyklin till de transfekterade celler resulterade i expression av Bax eller revCasp 3. Om CaeB stör den apoptotiska vägen nedströms Bax, då den apoptotiska signalen som genereras av expression och efterföljande aktivering av Bax skulle vara blockerad av CaeB uttryckning. I själva verket, HEK293 celler som uttrycker stabilt GFP-CaeB hämmar djupt apoptos induktion av doxycyklin kontrollerade Bax uttryck, medan HEK293-GFP celler uppvisade tydliga PARP klyvning. Detta resultat indikerar att CaeB blockerar apoptos induktion nedströms Bax aktivering. Därefter den analyserade huruvida CaeB kan störa kaspas 3 aktivering - en sen händelse i apoptotiska vägen. HEK293-GFP-celler, såväl som HEK293-GFP-CaeB celler, uppvisar PARP klyvnings (figur 6), vilket indikerar att när effektor caspas 3 är activated, CaeB kan inte hindra apoptos inträffar. Sammantaget visar dessa data att CaeB verkar mellan Bax och kaspas 3 aktivering.
Figur 1. Schematisk översikt av tetracyklin regelsystemet. Tet-On-systemet består av två olika plasmider, reglerings- och svars plasmider. Reglerings plasmiden kodar Tet-lyhörd transsilencer (TTS, fylld cirkel) och Tet-lyhörd omvända trans (rtTA, öppen cirkel). Båda proteinerna är konstitutivt uttryckt under kontroll av den starka, konstitutiva förlängningsfaktor-1-alfa-promotorn (P EF-1a). TTS och rtTA är chimära transkriptionsfaktorer som består av en eukaryot transkriptionsreglerande domän (ljuddämpare eller aktivator, respektive) och en bakteriell tetracyklin repressor (TetR). TetR medierar DNA-bindning till sju tef (tetO) sekvenser på svars plasmiden. TetO ligger uppströms om den inducerbara minimala cytomegaloviruspromotor (P CMV), tillsammans bildar den Tet-responsiva elementet (TRE). Under icke-inducerande betingelser TTS bundet till TRE förhindra uttryck. Efter tillsats av doxycyklin (Dox, fylld diamant), rtTA interagerar med Dox leder till konformationsförändringar och aktivering. Aktiverad rtTA ersätter TTS på svaret plasmiden, vilket transkription av respektive målgener Bax och kaspas 3, vilket leder till apoptos induktion och celldöd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk översikt av regelverket plasmiden pWHE125. Elements viktigt för förökning i bacterier, inklusive ett replikationsursprung (ori pBR) och en antibiotikaresistent kassett mot ampicillin (Amp ^), och för expression av Tet-transregulators, såsom den starka, konstitutiva omedelbara tidiga promotorn / förstärkaren av den humana cytomegalovirus (P / E hCMV), en intern ribosombindningssite från polio-virus (PV-IRES) och en polyA-webbplats från Simian virus 40 (SV40 polyA) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schematisk översikt av svars plasmiden. Element väsentliga för förökning i bakterier, inkluderande ett ursprung för replikation (ori pBR) och en antibiotikaresistens kassett (Amp ^) och för inducerbart uttryck i eukaryoter, såsom transgenen expressipå kassett med Tet-beroende minimal promotor TREtight (P TREtight), genen av intresse humant Bax (hBax) och en polyA-sätet från apvirus 40 (SV40 polyA), avbildas. Den transgena expressionskassetten flankeras av tandem direkta upprepningar av två kopior av kyckling HS4 isolatorkärnsekvensen (HS4 kärna). Dessutom är en neomycinresistensgen (G418 R) och en human tymidinkinas polyA plats (TK polyA) en G418-resistens kassett bestående av en mus fosfoglyceratkinas 1 promotorn (P mPGK) närvarande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. HEK293-GFP och HEK293-GFP-CaeB stabilt uttrycka gröna fluorescerande proteiner. (A) Hela-cellysat av HEK293-GFP ochHEK293-GFP-CaeB celler immun för GFP att visa stabil expression. (B) representant flödescytometri (FACS) analys av HEK293-GFP och HEK293-GFP-CaeB celler visas att visa intensiteten av GFP uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effekter av uttryck av GFP-CaeB på staurosporin-inducerad apoptos. HEK293-GFP och HEK293-GFP-CaeB-celler behandlades med 4 pM staurosporin under 6 h för att inducera inneboende apoptos. Apoptos analyserades med kluvna PARP immunoblotanalys. PARP klyvning reducerades i HEK293-GFP-CaeB celler i jämförelse med HEK293-GFP-celler. Klicka här för att se en större versionav denna figur.
Figur 6. Användning av Teton systemet att begränsa punkten handlings CaeB. (A) Apoptos framkallades genom uttryck av Bax i HEK293-GFP och HEK293-GFP-CaeB celler. Apoptos analyserades med kluvna PARP immunoblotanalys. PARP klyvning reducerades i HEK293-GFP-CaeB celler i jämförelse med HEK293-GFP celler. (B) Apoptos framkallades genom uttryck av revCasp 3 i HEK293-GFP och HEK293-GFP-CaeB celler. Apoptos analyserades med kluvna PARP immunoblotanalys. PARP klyvning var jämförbar i HEK293-GFP-CaeB och HEK293-GFP-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många patogena bakterier hamnen sekretionssystem att utsöndra eller translokera bakteriella effektor proteiner i värdcellen. Dessa effektorproteiner har kapacitet att modulera processer och vägar i värdcellen, vilket gör att bakterier att överleva och replikera inom respektive intracellulär nisch. Förstå biokemiska aktiviteter och molekylära mekanismer för effektorproteiner kommer att bidra till en bättre förståelse av patogenicitet och kan bidra till att utveckla nya terapeutiska verktyg för att bekämpa sjukdomen. Dessutom, eftersom effektorproteiner utövar ofta sin funktion genom att efterlikna värdcellaktiviteter, de kan också användas för att lära sig mer om biologi eukaryota celler 1. Emellertid har studera den biokemiska aktiviteten av ett enda effektorprotein visat sig vara komplicerat av flera skäl: 1) funktionell redundans bland effektorproteiner, 2) den tidsmässiga reglering av inkopplingen av effektorproteiner, och 3) den effekTor protein arbetar i samband med en annan effektorprotein, störa dess funktion. Därför är aktiviteten hos en effektorprotein vanligen studeras av överuttryck studier. Tyvärr har användningen av övergående överuttryck av effektorprotein också flera nackdelar. Således kan endast en enda cell analys analyser användas, och aktiviteten hos den effektorprotein kan inte analyseras om aktiviteten hos det effektor-proteinet beror på aktiviteten hos en annan effektorprotein. För att övervinna åtminstone den första nackdelen, kan stabila cellinjer användas. Vid expression av effektor-proteinet är toxiskt för cellen, är detta inte lämpligt. I det här fallet, kan stabila och inducerbara cellinjer etableras med hjälp av ett liknande system som vi beskriver här för transient uttryck av apoptosinducerande proteiner (se nedan). Emellertid våra resultat (Figur 5) visar att uttrycket av CaeB skyddar cellerna från att genomgå apoptos och är därför intetoxiska. Det finns några alternativ i dissekera på vilket steg i den apoptotiska kaskaden CaeB stör apoptos induktion. En möjlighet är att bestämma värdcellen bindningspartner till CaeB. Detta är dock mycket utmanande och identifieringen av bindningspartnern kan inte bidra till att förklara den punkt verkan av CaeB inom den apoptotiska kaskaden. En annan möjlighet är att använda olika apoptos inducerare, men CaeB hämmar apoptos induktion genom två olika apoptos inducerare, UV-ljus och staurosporin 7, vilket tyder på att detta tillvägagångssätt inte heller kan leda till identifiering av angreppspunkt för CaeB. En annan möjlighet i att minska ner punkten för verkan av CaeB, som utnyttjas här, är att använda ett system där apoptos signalkaskad kan induceras vid definierade steg.
Vid uttryck av bakteriella effektor protein som valdes som proteinet av intresse redan stör cellfysiologi, dess expression kan också placeras under kontroll av en inducerbar expressionssystem, t ex, såsom den som används för att uttrycka målproteinet. Då kommer expression av både proteinet av intresse och mål-proteinet samtidigt induceras när liganden tillsätts till cellodlingen tillåter undersökare att övervaka celler för differentiella effekter på cellfysiologi och signalsystem utgång.
Det är uppenbart att uttrycka ett protein av intresse och försöker identifiera sin angreppspunkt i ett visst intracellulär väg genom inducerbart uttryck av utvalda pathway proteiner fungerar bäst om proteinet av intresse stör den fysiologiska aktiviteten hos den valda vägen. I detta fall är avläsning helt enkelt avsaknaden av en signal som normalt är associerad med den väg, såsom celldöd i fall av apoptotisk signalering eller aktivering av transkription i fallet med Wnt-signalering. I princip kan proteiner som aktiverar en specifik reaktionsväg också sonderas med denna typ av analyssystem. Det har bara ställas in på olika sätt, till exempel med hjälp av inducerbart uttryck av en si / sh / miRNA mot en väg protein och testa om proteinet av intresse kan rädda väg signalering. Alternativt kan små molekylhämmare av specifika proteiner användas för att avbryta signaltransduktion inom en väg och sedan till kontrollen för reaktionsväg räddning genom inducerbar expression av ett protein av intresse. Dock kommer denna typ av tillvägagångssätt vara experimentellt mer utmanande än Protokollet presenteras ovan.
Valet av målgenen som skall sonderas i interferens analysen är i princip enkel. Det är bäst att testa så många av proteinerna i den valda signalvägen som möjligt att finjustera identifieringen av proteinet av intresse är platsen för interaktion med reaktionsvägen. Detta bör göras på ett iterativt sätt, eftersom det inte alltid är experimentellt möjligt eller ens möjligt att övervaka alla potentiella interactionspartner i ett enda experiment. Därför är det bäst att först testa flera proteiner fördelade jämnt längs hela vägen och sedan att förfina experimentet med hjälp av informationen som gjorts i den första omgången. I signalvägar, är många proteiner modifieras post-translationellt, antingen genom en kovalent modifiering, såsom fosforylering eller sumoylation, eller genom en bearbetnings händelse, såsom proteolytisk klyvning. Följaktligen är respektive protein antingen i ett mark tillstånd eller i en aktiverad form. Om möjligt är det bäst att testa båda former av proteinet av två skäl. En är att den aktiverade formen avger en högre utsignal 31, som presenterar ett strängare utmaning för proteinet av intresse. I vår proof-of-principle exempel apoptotiska signaleringen är kaspas 3 aktiveras genom proteolytisk klyvning och dimerisering. Denna aktiveringshändelse kan simuleras på konstgjord väg genom att arrangera den obearbetade pro-kaspas-genen. Den lilla subenheten är artificiellt placeradframför den stora subenheten och båda är förbundna genom en linker. Detta kallas en "omvänd kaspas" och representerar den aktiverade formen av enzymet när det uttrycks 35. Det valdes på grund av dess högre grad av aktivitet. Det andra skälet till sondering både mark tillstånd och aktiverade former av en väg-protein är att det tillåter en att särskilja om proteinet av intresse interfererar med aktiveringen av målproteinet, eller om den verkar nedströms av proteinet i reaktionsvägen. I det första fallet kommer celldöd inhiberas om marken-statsformen uttrycks, men inte om den aktiverade formen är närvarande. I det andra fallet, kommer varken protein leder till apoptos. Således testa båda formerna av ett modifierat protein, förbättrar upplösningen av den analytiska systemet.
Kloning av målgenen i den inducerbara expressionsvektorn kräver flera beslut. Först skall uttrycket av målgenen inträffa endast övergående eller är det bättre om vektorn är stably integrerad i genomet hos värdcellen linjen? Om endast övergående uttryck krävs, en enkel vektor, såsom pUHC13-3 24, som innehåller en Tet-beroende promotor och en polyA-sätet, eller en dubbelriktad vektor, såsom PBI-2 eller PBI-3 36, vilken kopplar expression av genen av intresse för uttrycket av en reportergen för enklare kontroll av målgenuttryck, kommer att vara tillräckligt. Om stabilt uttryck är att föredra, bör en vektor såsom pWHE655 33 (Figur 3) användas. Den innehåller isolatorer som flankerar transgenexpression enheten för att förhindra positionseffekter på iska platsen integration stör inducerbar transgenuttryck. Den innehåller också en länkad, men oberoende uttryckt motstånd kassett för G418 för att underlätta valet av händelser vektor integration. Nettoresultatet av dessa förändringar är en ökning av antalet kloner med utmärkta regulatoriska egenskaper 33,37,38. cDNA-SEderna av målgener kan klonas in i denna vektor genom att använda de unika restriktionsställen för EcoRI och EcoRV 33. Kloning av den vektor som uttrycker den omvända kaspas-3-cDNA beskrivs i detalj i referens 33. Kloning av vektorn som uttrycker humant Bax utfördes på analogt sätt. Den humana bax cDNA amplifierades genom PCR från plasmiden pVenus-Bax 39 användning av oligonukleotidprimrar som introducerar restriktionsställen för EcoRI och EcoRV. Efter rening av PCR-fragmentet och begränsning med de två enzymerna var fragmentet ligerades med på samma sätt-begränsade pWHE655, vilket gav pWHE655TREtight-Bax. För det andra, som minimal promotor är mest lämplig för transgenuttryck? Den ursprungliga minimal promotor P hCMV * -1 24 visar några celltypsspecifik läckage 30, delvis på grund av närvaron av funktionella interferon-α inducerbar responselement 29. Detta ledde till utvecklingen av andra generationen Tet-beroendepromotorer, benämnd ΔMtetO, TREtight och SG-TRE, med förändrad avstånd och sekvenser mellan této elementen och med olika minimala promotorsekvenser 33,40-42. De visar kraftigt minskad läckage i frånvaro av doxycyklin. Bland dessa andra generationens promotorer, har ΔMtetO lägsta transgen expression nivå i närvaro av doxicyklin 33. TREtight förmedlar en mellanliggande och SG-TRE den högsta nivån av transgenuttryck 33. Ytterligare modifieringar har minimerat bakgrund uttryck för tetracyklin lyhörd promotor ännu mer 43,44. Sålunda kan valet av en tetracyklin-känslig promotor göras i enlighet med kraven eller begränsningar av respektive transgen.
Oberoende av den typ av experimentell metod, är viktig täthet av uttryckning av målproteinet. Till exempel, induktion av apoptos med aktiverade former av pro-apoptotiska proteiner leder till celldöd, även om endast minimala mängder av respektive målprotein uttrycks 31-33. Den erforderliga stringens uppnås genom tillsats av en tetracyklin-beroende transsilencer till det villkorade regleringssystemet 30. Det garanterar att transkription från promotor aktivt undertryckt, vilket är särskilt viktigt när transienta transfektioner genomförs, eftersom de är oftast ganska läckande i sin transgenexpression 30. Om signalvägar som inte inducerar celldöd probas, kan kravet på strängare reglering av målgenuttryck vara avslappnad och inducerbara system utan transsilencer kan användas alternativt 43,44.
Den inducerbara regulatoriska system som används för att sondera signalväg behöver inte vara Tet-systemet. Dess största fördel är att det har varit intensivt används i däggdjursceller i mer än 20 år nu och att det är den mest utvecklade och bästa characterized inducerbara kontrollsystem. Det finns dock åtminstone 25 andra villkorade regelsystem 45,46 som kan användas alternativt eller i tillägg till Tet-systemet. Två eller tre olika inducerbara system kan vara användbara för sondering konvergerande signalvägar eller för att testa redundans av antingen målgenen eller proteinet av intresse.
Tillvägagångssättet som presenteras här bör arbeta med transfektion effektivitet som resulterar i en robust och tillförlitlig utsignal från respektive signalväg som sonderas. Eftersom stabila cellinjer uttrycka proteinet av intresse i en homogent sätt (figur 4B), är alla celler som transient transfekteras med den inducerbara plasmid som uttrycker proteinet av intresse avsöktes för störningar av proteinet av intresse med reaktionsvägen signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
References
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
- Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
- Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
- Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
- Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
- Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
- Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
- Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
- Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
- Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
- Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
- Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
- Cory, S.
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
- Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
- Felsher, D. W.
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
- Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
- Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J.
- Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
- Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
- Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
- Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
- Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
- Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
- Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
- Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
- Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
- Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
- Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
- Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
- Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
- Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
- Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
- Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
- Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).
