Introduction
في المختبر ثنائية الأبعاد (2D) الشبكات العصبية بالإضافة إلى مايكرو الكهربائي صالحة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) arethe نموذج تجريبي الذهب القياسية المعتمدة لدراسة التفاعل بين الديناميات العصبية والربط الأساسي. خلال تطوير وإعادة الخلايا العصبية الشبكات المعقدة التي تعرض جيدا definedspatio-temporalpatternsof النشاط 1،2 (أي رشقات نارية، رشقات نارية الشبكة، والنشاط ارتفاعه عشوائي). الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسجل النشاط الكهربية من العديد من المواقع (من عشرات الآلاف من الميكروية)، والسماح لتحقيق مفصل لديناميات أعرب على مستوى الشبكة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الثقافات فصلها يجعل المحتملة التي لتصميم الشبكات الهندسية. فمن الأسهل للفهم بهذه الطريقة العلاقات الوظيفية بين النشاط الكهربية تسجيلها والمعلمات من تنظيم الشبكة مثل كثافة الخلية 3، ودرجة نمطية 4،5، وجود غير متجانسة البوب العصبيةulations 6، وما إلى ذلك، تقوم كل الدراسات في المختبر على خلايا المستزرعة نأت على 2D الشبكات العصبية. هذا النهج يؤدي إلى التبسيط فيما يتعلق (في جوهرها 3-الأبعاد، 3D) نظام في الجسم الحي: (ط) في 2D هي بالارض نموذج، somata والنمو الأقماع وثمرة المحاور-التشعبات لا يمكن أن تنتشر في كل الاتجاهات 7. (ب) نمطية 2D في المختبر شبكات المعرض ديناميات الكهربية التي تهيمن عليها تنفجر نشاط يشمل معظم الخلايا العصبية للشبكة 8.
مؤخرا، تم وضع حلول مختلفة للسماح للبناء في المختبر فصل 3D الشبكات العصبية. تتكون فكرة مشتركة في خلق سقالة حيث يمكن للخلايا العصبية تنمو بطريقة 3D. لا يمكن أن تتحقق هذه سقالة مع المواد الهلامية البوليمر والمصفوفات التي يسهل اختراقها الصلبة 13/09. من خلال استغلال الخواص الميكانيكية للبوليمرات، فمن الممكن تضمين الخلايا داخل تساهياكل البريد عن طريق تحديد كتلة موحدة من الثقافات 3D من neurospheres 11. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي ملك الميكانيكية الصارمة للneurospheres 9،12. ومع ذلك، فإن هذه المواد المسامية محدودة، وأنها لا نضمن هجرة الخلايا داخل المصفوفة. للتغلب على هذا العائق، حلا ممكنا يتكون تشريح المصفوفة إلى 'وحدة' وحدات في. لسوء الحظ، يمكن أن حجم وشكل تنوع الجسيمات تعوق التعبئة في الهياكل الطبقات العادية. في 7، كولين وزملاء العمل بتصميم بناء الخلايا العصبية 3D تتكون من الخلايا العصبية و / أو النجمية ضمن الخلية سقالة القائم على المصفوفة النشطة بيولوجيا. هذه الأنسجة العصبية المهندسة سمحت في التحقيقات المختبر لدراسة ومعالجة استجابات العصبية الحيوية داخل البيئات الصغرى 3D. يتكون هذا النموذج من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية توزع في جميع أنحاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) و / أو السقالات هيدروجيل (500-600 ميكرون سميكة). في هذا التعاونتم العثور على ndition، وبقاء الخلية المثلى (أكبر من 90٪) من خلال طلاء الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائية حول 3750 - 5000 خلية / ملم 3. وتجدر الإشارة إلى أن هذه القيمة كثافة أقل بكثير من واحد في حالة في الجسم الحي، حيث الكثافة خلية من خلايا القشرة مخ الفأر حوالي 90000 خلية / ملم 3 14. للتغلب على هذا القيد Pautot وزملاء العمل 15 حققت 3D في المختبر نظام حيث يتم التحكم في كثافة الخلايا والاتصال بالشبكة تشبه في ظروف الجسم الحي في حين تمكن في الوقت الحقيقي التصوير من الشبكة. عمليا، يقوم هذا الأسلوب على مفهوم فصل الخلايا العصبية مثقف هي قادرة على النمو على بلي السيليكا. توفر هذه الخرز سطح نمو كبيرة بما يكفي لأجسام الخلايا العصبية على الالتزام وarborizations على النمو، وناضجة، تمديد، وتحديد الاتصالات متشابك على الخلايا العصبية الأخرى. هذا الأسلوب يستغل خصائص التجمع العفوي من الخرز فرقت أحادية لFOالطبقات جمهورية مقدونيا 3D صفائف سداسية تحتوي على مجموعات فرعية متميزة من الخلايا العصبية في طبقات مختلفة مع اتصال مقيدة بين الخلايا العصبية في حبات مختلفة. كانت كثافة الخلايا التي تحققت مع هذا الأسلوب عن 75000 خلية / مم 3.
في الآونة الأخيرة، ونحن تكيفت طريقة Pautot في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف 16: وتظهر النتائج أن النشاط الكهربية 3D يعرض ذخيرة واسعة من الأنشطة من واحد التي أعربت عنها الشبكات 2D. ثقافات ناضجة 3D يحمل ديناميكية معززة فيه كل انفجار شبكة وعشوائي تصاعد النشاط جنبا إلى جنب. وبالمثل، تانغ Schomer وزملاء العمل 17 أدرك سقالة مسامية على البروتين والحرير الذي يحافظ على الثقافة القشرية الأولية في المختبر لعدة أشهر، وسجلت النشاط الكهربية عن طريق التنغستن القطب.
في هذا العمل، والإجراءات التجريبية لبناء الشبكات العصبية 3D بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ويمكن وصفها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على بروتوكول تجريبي بموجب التشريع الأوروبي رعاية الحيوان (2010/63 / EU)، من قبل وزارة الصحة الإيطالية وفقا للDL 116/1992 وفقا للمبادئ التوجيهية للجامعة جنوى (بروت. N. 13130، مايو 2011). تم بذل كل الجهود للحد من عدد الحيوانات للمشروع والتقليل من معاناتهم.
1. إعداد المواد ويدعم
- بناء قالب لبناء PDMS (بولي ميثيل-Siloxane) القيد عن طريق CNC (الكمبيوتر التحكم العددي) آلة الطحن. ويتحقق هذا العفن في البولي مع الاسطوانة المركزية في تترافلوروإيثيلين (PTFE). هذه المواد يسمح لاستخراج أسهل من القناع مرة واحدة وقد تصلب PDMS.
ملاحظة: تصميم القالب تم يؤديها بمساعدة الحاسوب التصميم (CAD) ومن ثم تسليمها إلى آلة طحن CNC. - إعداد المطاط الصناعي PDMS. PDMS هو بوليمر عضوي. وهو يتألف من عنصرينوكيل علاج والبوليمر. مزجها من قبل نسبة حجم 01:10، جزء واحد من وكيل علاج وتسعة أجزاء من البوليمر. وضع هذين العنصرين في طبق بيتري، ويهز إدراج المزيج في فراغ الغرفة لمدة 10 دقيقة للقضاء على فقاعات الهواء. 3 غرام من PDMS كافية لعقبة واحدة.
- بناء القيد PDMS. إدراج مادة PDMS في أبلى ووضعها في الفرن لمدة 30 دقيقة في 120 درجة مئوية. القيد PDMS ديه على شكل اسطوانة مثالية مع القطر الخارجي والداخلي 22.0 و 3.0 ملم على التوالي وارتفاع 650 ميكرون.
- قبل يوم من الطلاء، واثنين من قناع لمنطقة نشطة من المصفوفات الدقيقة الكهربائي (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) عن طريق منتاش تحت stereomicroscope وتعقيم قناع PDMS في الفرن على 120 درجة مئوية.
- تعقيم بلي زجاجي دقيق (القطر الاسمي من 40 ± 2 ميكرون، شهادة قطر متوسط 42.3 ± 1.1 ميكرون) في 70٪ من الإيثانول لمدة 2 ساعة في قارورة المخروطية وتدوير EVريها 30 دقيقة للكشف عن بلي.
- إزالة حل الإيثانول من القارورة وشطف بلي مرتين بالماء المعقم.
- شرط الجزء المركزي من منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا محددة بواسطة قناع PDMS (قطر يساوي 3.0 مم) مع 24 ميكرولتر من محلول خليط من بولي-D-ليسين و laminin في 0.05 ميكروغرام / مل.
- معطف بلي مع بروتينات الالتصاق، Laminin وبولي-D-ليسين في 0.05 ميكروغرام / مل وترك لهم بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، للحصول على الشبكة العصبية مستقرة وطويلة الأمد.
- إزالة عوامل التصاق كلا من السطح الزجاجي لMEA ومن بلي زجاجي دقيق. نضح ما يقرب من 95٪ من الحل طلاء مع ماصة وتطبيق volume- صغيرة 24μl- من الماء المعقم على سطح MEA. نضح مرة أخرى أكثر من 95٪ من المياه، والسماح للMEA الجافة تحت غطاء محرك السيارة الصفحي لمدة 1 ساعة قبل طلاء الخلايا.
ملاحظة: في حالة بلي بدلا من ذلك، نضح طلاءحل وجعل غسل الأولى مع الماء المعقم وثانية واحدة مع المتوسط القاعدية وملحقها مثل B27، من أجل تلطيف سطح الزجاج حيث سيتم مطلي الخلايا العصبية. لا تدع بلي الجافة. تركها في تعليق في مستنبت داخل القارورة. - توزيع، عن طريق ماصة -200 μl-، تعليق بلي المعالجة (حوالي 32،000) على طبق من ذهب multiwell مع إدراج غشاء (المسام قطرها 0.4 ميكرون) حيث سيتم تجميع الذاتي تشكيل طبقة موحدة.
- ملء كل بئر من الغشاء مع 0.5 مل من المتوسط وضعه في الحاضنة (T = 37.0 درجة مئوية، CO 2 = 5٪) حتى الخلايا العصبية على استعداد لتكون مطلية (3.2).
2. تشريح الأجنة وتفكك النسيج
- بيت الكبار إناث الفئران (200-250 ز) في درجة حرارة ثابتة (22 ± 1 درجة مئوية) ورطوبة نسبية (50٪) في إطار جدول زمني للضوء الظلام العادي (الضوء على 07:00 حتي 07:00) فيمنشأة الحيوان. ضمان أن المواد الغذائية وهي المياه المتاحة بحرية.
- تخدير الفئران الإناث الحوامل بعد 18 يوما من وضع (E18) باستخدام 3٪ الأيزوفلورين. ثم، التضحية الحيوانية خلع عنق الرحم.
- إزالة الحصين من كل جنين فأر ووضعها في محلول ملحي متوازن الجليد الباردة هانك دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. في يوم 18 من الحصين التنمية وأنسجة القشرة لينة جدا ولست بحاجة إلى أن تقطع الى قطع صغيرة. مزيد من التفاصيل يمكن الاطلاع على 18،19.
- فصل الأنسجة في 0.125٪ من حل التربسين / هانك تحتوي على 0.05٪ من الدناز عن 18-20 دقيقة عند 37 ° C.
- إزالة الحل طاف مع ماصة باستور ووقف الهضم الأنزيمي بإضافة المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لمدة 5 دقائق.
- إزالة المتوسطة مع FBS ويغسل مرة واحدة مع المتوسط مع ملحقها، 1٪ L-الجلوتامين، جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل. إزالة مرة أخرى على المدى المتوسط مع نقطة باستورETTE وإعادة ملء مرة أخرى مع كمية صغيرة (500 ميكرولتر) من متوسط النمو مع ملحقها، 1٪ L-الجلوتامين، جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل.
- فصل بيليه الأنسجة ميكانيكيا مع ماصة باستور الضيقة حتى تعليق حليبي الخلايا هو واضح. ليس من الضروري أن أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية.
- تمييع كمية صغيرة من تعليق الخلية مع متوسط النمو للحصول على الحجم النهائي من 2.0 مل. عد تركيز الخلوية التي تم الحصول عليها مع غرفة عدادة الكريات. تمييع هذا التركيز في 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوبة من 600-700 خلية / ميكروليتر.
3. خلية التصفيحات
- لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة حوالي 2000 خلية / ملم 2 على منطقة نشطة للMEA، التي يحددها القيد PDMS لإنشاء شبكة العصبية 2D.
ملاحظة: كل الحصين يحتوي على حوالي 5 × 10 5 خلايا (1 × 10 6 لجنين واحد). تشريح 6 الأجنة للحصول على المبلغ الإجمالي لل6 × 106 الخلايا في 2 مل، وتركيز قدر من 3000 خلية / ميكرولتر. تمييع هذا التركيز في 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوبة وصفيحة حول 600-700 خلية / ميكروليتر. إذا كانت المنطقة MEA محدد بواسطة القيد PDMS حوالي 7.065 مم 2، والعدد الكلي للخلايا مطلي 600 خلية / ميكرولتر × 24 ميكرولتر = 14،400 الخلايا، وكثافة الأخيرة من 2038 خلية / ملم 2. - وضع أجهزة MEA في حاضنة مع ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية.
- توزيع 160 ميكرولتر من تعليق مع تركيز خلية من خلايا 600-700 / ميكرولتر (حوالي 100،000 الخلايا) على سطح أحادي الطبقة بلي المتمركزة داخل لوحات multiwell لاستكمال خطوة تمهيدية لبناء ثقافة ثلاثية الأبعاد. وضع لوحات multiwell في الحاضنة مع ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية.
البناء 4. 3D الشبكة العصبية
- 6-8 ساعة بعد الطلاء، ونقل تعليق (بلي مع الخلايا العصبية) من لوحات multiwell بعناية فائقة داخل منطقة محددة من قبل القيد PDMS باستخدام ماصة مجموعة لحجم حوالي 30-40 ميكرولتر. بعد كل عملية تحويل، الانتظار لمدة نصف دقيقة، للسماح للبلي في التجمع الذاتي في هيكل مدمج سداسية.
- مرة واحدة يتم إيداع جميع الطبقات وعفوية تجميعها، إعادة ملء مع انخفاض كبير حوالي 300 ميكرولتر من المتوسطة الجزء العلوي من منطقة محددة من قبل القيد PDMS.
- وضع هيكل 3D بالإضافة إلى MEA في حاضنة (T = 37.0 درجة مئوية، CO 2 = 5٪) لمدة 48 ساعة قبل أن يضيف الحجم النهائي (حوالي 1 مل) من النمو مستنبت مع ملحقها.
ملاحظة: النظر في عدد من الخرز على لوحات multiwell مع إدراج غشاء (30000) وعدد من الخرز على طبقة واحدة على الجهاز MEA (6000). ويتكون هيكل 3D الناتجة من 5 طبقات من ميلcrobeads والخلايا. مع الأخذ بعين الاعتبار أن الشبكة العصبية 3D ليست مثالية هندسيا، يمكن أن يتألف هيكل 3D الناتجة من 5-8 طبقات. - اليوم بعد الطلاء، إضافة إلى الحجم النهائي من المتوسط (حوالي 900 ميكرولتر) داخل الحلبة MEA بعناية. الحفاظ على الثقافات 3D في ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 4-5 أسابيع. استبدال نصف المتوسط مرة واحدة في الأسبوع.
5. متحد البؤر المجهري شراء
- إصلاح العينات البيولوجية إلى مرحلة المجهر في حامل. ضبط الليزر (الأرجون، 496-555 نانومتر)، وسرعة المسح الضوئي (400 هرتز) الذي لالتقاط الصور، وكسب وتعويض (-0.3٪) من PMT لكل صورة لالتقاط الصحيح مرشح الانبعاثات وعرض النطاق الترددي من أجل لتجنب التشبع وزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء. تقارير قسم النتائج والقيم المستخدمة للحصول على الصور من الشكل 4.
- لاقتناء ض -stack تسلسل، والتنوبالحادي وتحديد، وقيمة موقف Z من أعلى وأسفل طبقة من العينة، ثم حدد حجم الخطوة إلى جعل عملية الاستحواذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. في هذا الإجراء التجريبي، لعبت دورا ذات الصلة من قبل بلي التي تحدد سقالة الميكانيكية لنمو الشبكة العصبية 3D أرقام 1A و B عرض الترتيب من بلي (القطر الاسمي من 40 ± 2 ميكرون، شهادة يبلغ متوسط قطر 42.3 ± 1.1 ميكرون) في الطائرة. خصوصية هذه الهياكل هي أن بلي عفويا التجمع الذاتي تعريف الهندسة سداسية المدمجة (1B الشكل وC). السقالة ولدت حتى تضمن سطح نموا ثابتا لneurites التي والفضاء الخلالي كبيرة بما فيه الكفاية لتبادل التمثيل الغذائي للأجسام الخلايا. هذا البعد microbead يبرهن على أن تكون حلا وسطا معقولا لتباعد الخلالي وكثافة الخلايا العصبية النهائية. وبالنظر إلى أن هيكل PDMS بإعادة "مثالية" اسطوانة، ومنذ سداسية عامل التأثير هيكل مدمج (HPF) يساوي 0.74، الحد الأقصى لعدد حبات (قطره 4081؛ م) الواردة في القيد PDMS حوالي 100،000، وهو ما يعادل حوالي 6000 بلي في كل طبقة. كما هو موضح في قسم البروتوكول، هذه بلي هي مع عوامل التصاق (أي Laminin وبولي-D-ليسين) مكيفة مسبقا. يضمن هذا الإجراء أن الخلايا العصبية التمسك بلي. ويبين الشكل 1D على سبيل المثال حيث تقترن ثلاثة الخلايا العصبية إلى microbead التي يبلغ قطرها 40 ميكرومتر.
الشكل 1. صور من بلي المستخدمة لإنشاء سقالة للشبكة العصبية. (A، B) مثالان من الطبقات الوحيدة من بلي على سطح لوحة multiwell مع إدراج الغشاء. (C) بلي استقرت تحت قوة الجاذبية وتجميعها بشكل عفوي في 2D صفائف سداسية. مرة واحدة هي معبأة في الطبقة الأولى تماما، تضاف حبات أخرى، بناءجي طبقة أمر الثانية لها نفس التماثل سداسية. أسفرت مزيد إضافة بلي في بناء التجمع 3D معبأة. يتم تعبئة المساحة الحرة بين بلي التي كتبها العمليات العصبية وأجسام الخلايا. وترسو (D) ثلاثة الخلايا العصبية على سطح microbead واحد، مكيفة سابقا مع عوامل التصاق (Laminin وبولي-D-ليسين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هو تفاعل من بلي والخلايا العصبية مع المنطقة النشطة من MEA المقرر أن عقبة من اللدائن المرنة (الشكل 2C)، أدرك مع القالب يصور في أرقام 2A و B. ويبين الشكل 2A تخطيط والأبعاد المحددة. ومن تخوم منطقة نشطة للMEA بواسطة اقتران هيكل PDMS من الشكل 2C إلى الركيزة MEA (الشكل 2D). في هذه الطريقة، ويضطر الخلايا العصبية على الانضمام إلى منطقة القطب النشطة للMEA. وفي وقت لاحق، وسيتم استيعاب أكوام الزجاج microbead مع الخلايا العصبية تمسكا على هذه الطبقة الأولى. ويبين الشكل 2D قطاعا عريضا من التكوين النهائي، حيث دور هيكل PDMS يمكن تقدير بوضوح. مساحة محددة من قبل هيكل PDMS يحتوي على خليط من بلي والخلايا العصبية (مسحوق أبيض في لوحة أسفل الشكل 2D). هيكل PDMS لديه على شكل اسطوانة مع بني القالب هو مبين في الشكل 2B مع الأبعاد التالية: القطر الخارجي والداخلي من 22.0 و 3.0 ملم على التوالي وارتفاع 650 ميكرون. بنيت القالب باستخدام البولي وPTFE التي تجعل مادة ناعمة ومقاومة مثالية لتسهيل استخراج مطاطية عرض القيود mask.The PDMS العمر أقصر، منذ خصائص لزجة من انخفاض PDMS بعد كل استخدام. عادة ، كل بنية PDMS يمكن أن تستخدم بنجاح ثلاث مرات.
الشكل 2. المواد اللازمة لبناء الشبكة العصبية 3D. (A) تصميم و(B) صورة من القالب المستخدم في إنشاء القيد البدني. الرمادية 3 مم اسطوانة يناظر حفرة من القيد هو مبين في (C). (C) PDMS القيد وضعها على منطقة نشطة للصفيف الصغرى الكهربائي (MEA). استخدام مثل حاجز مادي يسمح لاحتواء بلي داخل المنطقة المستهدفة (حوالي 7 ملم 2) والحد من تطوير شبكة 3D. (D) مقطع عرضي لنظام MEA والقيد. تمتلئ بلي (يصور المجهر في أعلى الزاوية اليمنى) في مساحة محددة من قبل القيد PDMS (اللوحة السفلية).080fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد الحبس من منطقة نشطة للMEA عن طريق قناع PDMS، فإن البروتوكول كما هو مبين في الشكل (3) لوحات من واصفا خطوات رئيسية لتحقيق تجميع الخلايا العصبية وبلي.
الخطوة الأولية الأولى تتمثل في الطلاء فصل الخلايا العصبية على سطح MEA الذي كان في السابق قبل المغلفة مع جزيئات الالتصاق Laminin وبولي-D-ليسين (الشكل 3A). ومن الضروري أن الشبكة العصبية 2D تلتزم مباشرة إلى منطقة نشطة للMEA: فقط في ظل هذه الظروف، وتسجيل الإشارات الكهربية (أي طفرات ورشقات نارية) ممكنا. هذا الجزء الأول من البروتوكول يتوافق مع الإجراءات القياسية المستخدمة في لوحة الخلايا العصبية 2D. ويصور البناء الفعلي للنظام 3D في أرقام 3B، C، D و (الشكل 3B)؛ بعد ذلك، يتم توزيع تعليق 160 ميكرولتر مع تركيز خلية من خلايا 600-700 / ميكرولتر (حوالي 100،000 الخلايا) على بلي أحادي الطبقة (الشكل 3C). وبالنظر إلى أن الخلايا يمكن أن تشغل نصف مساحة حبة، مجموع مساحة حرة 75 مم 2. كثافة الخلية على أحادي الطبقة بلي حوالي 1500 خلية / ملم 2. لوحات multiwell تستخدم مع إدراج غشاء تمثل غشاء مسامي مع سطح 33.6 مم 2. من خلال النظر في شكل أسطواني الظاهري مع منطقة قاعدة مساو لاختراق سطح الغشاء وعلى ارتفاع 40 ميكرون (قطر حبة)، ويقترن طبقة موحدة تتألف من 30000 بلي لوحات multiwell مع إدراج الغشاء. تعليق أدركت ذلك من بلي والخلايا العصبية يبقى لمدة 6-8 ساعة داخل لوحات multiwell مع إدراج الغشاء. ذات مرةالخطوات المذكورة أعلاه يتم الانتهاء من بناء شبكة 3D يمكن أن تبدأ. في هذا الوقت، يتم إزالة خليط من الخلايا العصبية وبلي من لوحات multiwell مع إدراج الغشاء ووضعها على الشبكة العصبية 2D مطلي سابقا على منطقة محددة من قبل القيد PDMS (الشكل 3D). خلال هذا الإجراء، وفقدان حوالي 20-30٪ من الخلايا العصبية يحدث بسبب (ط) التلاعب الميكانيكية و (ب) لنقل خارج الغشاء. من خلال النظر في منطقة قاعدة القيد (7.06 ملم 2) وعلى ارتفاع 178.56 ميكرون (5 طبقات من الخرز)، وتقسيم عدد من الخلايا عن طريق حجم الاسطوانة المثالية التي شكلتها 5 طبقات من الخرز، و3D الناتجة العصبية كثافة شبكة خلية حوالي 80000 خلية / مم 3.
الشكل 3. رسم الخطوات الأساسية لإنشاء 2D و 3D الشبكات العصبية. (A) الطلاء سالخلايا العصبية و على المنطقة النشطة من MEA. ومطلي تعليق من الخلايا العصبية على سطح MEA، مكيفة سابقا مع عوامل الالتصاق ومحددة بواسطة القيد PDMS. تسمح هذه الخطوة لتحقيق: أ) شبكة العصبية 2D الكلاسيكية بالإضافة إلى MEA. ب) الطبقة الأولى من شبكة 3D من الذي سوف يتم تسجيل النشاط الكهربية (B) بلي و(يتم تسليم C) الخلايا العصبية على سطح لوحات multiwell مع إدراج غشاء بعد 6-8 ساعة. (D) تعليق من الخلايا العصبية وبلي ونقلها من لوحات multiwell مع إدراج الغشاء إلى شبكة 2D. تكرار هذه الخطوة عدة مرات يسمح لتعريف متعدد الطبقات 3D بنية كثيفة. (E) عند اكتمال هيكل 3D، يضاف قطرة من المتوسط، ويتم تخزين هيكل الناتج في الحاضنة لمدة 48 ساعة. (F ) بعد 48 ساعة، يتم تعبئتها ثقافة 3D تماما مع الحجم النهائي من المتوسط.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مرة واحدة وقد تم وضع الطبقة الأولى، يتم تكرار نفس العملية للحصول على فرقة 3D معبأة. هيكل 3D الناتجة يعيد تنظيم نفسه تحديد الكريستال الغروية التي يتجمع الذاتي في بنية مدمجة تتكون من حوالي 5-8 طبقات بلي والخلايا العصبية (الشكل 4). مرة واحدة تتشكل كل الطبقات، وشبكة 3D لابد من تعبئتها مع قطرة من 300 ميكرولتر من المتوسطة (الشكل 3E). في هذه المرحلة، والشبكات 3D بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ويمكن تخزين في الحاضنة لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، يتم إضافة 1 مل من المتوسط لملء حلقة من الشرق الأوسط وأفريقيا (الشكل 3F).
مرة واحدة وقد تم تجميع جميع الطبقات، neurites التي تنمو فوق سقالة microbead التوصل إلى كثافة الخلية النهائية من حوالي 80000 خلية / مم 3. ومن الجدير NOTICجي أن القيمة التي تم الحصول عليها ليست بعيدة من 92000 خلية / ملم 3، ومتوسط كثافة الخلايا العصبية في القشرة الخارجية للدماغ الفأر 14.
الرقم 4 يعرض ثلاثة أمثلة من شبكات 3D بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التقاطها بواسطة المجهر متحد البؤر تستقيم. في الشكل 4A، ومدينة دبي للإنترنت (تدخل الفرق النقيض) تظهر صورة طبقة واحدة من الخرز بالإضافة إلى السطح MEA. وقد رافق المجهر مع 20.0 NA 0.50 هدف المياه وتم الحصول على الصور مع المنقولة PMT وشملت لالمجهر والأرجون ليزر (488nm). وتظهر الصور بشكل واضح جدا في التخطيط المكاني من الأقطاب الكهربائية (النقاط السوداء) والتنظيم المكاني العادية للبلي.
في الشكل 4B، وتلطيخ المناعي للخريطة-2 (إشارة حمراء) يعرض توزيع arborizations شجيري وsomata من الخلايا العصبية في جميع أنحاء بلي يقترن مباشرة إلى الطائرة الكهربائي من MEA (وجود اتصالات سوداء ويمكن ملاحظة). الشكل 4B هو إسقاط الحد الأقصى لتسلسل كومة Z- (108 ميكرون) مع حجم خطوة يساوي 1.53 ميكرون. تم الحصول على الصور مع الهدف 40.0 NA 0.80 المياه؛ الإثارة هي الأرجون ليزر (488 نانومتر)، وعرض النطاق الترددي الانبعاثات 496nm-655nm.
وأخيرا، يعرض الشكل 4C إسقاط الحد الأقصى لض -stack تسلسل (187.79 ميكرون) ثقافة الحصين 3D (حجم الخطوة هو 2.27 ميكرون). وقد اكتسب -stack تسلسل ض مع الهدف 25.0 NA 0.95 المياه. لقناة الخضراء، واستخدمت ل488nm ليزر الأرجون وانبعاث عرض النطاق الترددي مرشح 499nm-551nm. لالقناة الحمراء، وتم استخدام 543 نانومتر الليزر والانبعاث عرض النطاق الترددي مرشح 555nm-645nm. تم الحصول عليها من القنوات في وضع التسلسل. شبكة مترابطة للغاية تبرز حيث أعربت وصفت لNeuN الخلايا العصبية في الخلايا العصبية بعد الإنقسامية ناضجة (إشارة حمراء) وجابا (إشارة خضراء، ييلانخفاض في الدمج). كشفت جابا الأجسام المضادة والإيجابية للالخلايا العصبية المثبطة سواء في somata وneurites التي.
الشكل 4. ثلاثة أمثلة من شبكات 3D التقاطها بواسطة المجهر متحد البؤر. (A) DIC (تدخل الفرق النقيض) صورة تظهر طبقة واحدة من الخرز بالإضافة إلى السطح MEA. التخطيط المكاني للأقطاب (النقاط السوداء) يمكن ملاحظته. (B) تلطيخ المناعي للخريطة-2 (إشارة حمراء) يعرض توزيع arborizations شجيري وsomata من الخلايا العصبية في جميع أنحاء بلي يقترن مباشرة إلى الطائرة الكهربائي من شركة طيران الشرق الأوسط. ( C) إسقاط الحد الأقصى لض -stack تسلسل (187.79 ميكرون) ثقافة 3D عرض شبكة مترابطة للغاية حيث وصفت الخلايا العصبية لNeuN أعرب في الخلايا العصبية بعد الإنقسامية ناضجة (إشارة حمراء) وجابا (إشارة خضراء، صفراء في دمج ). جابا الأجسام المضادة مراجعةealed والإيجابية للالخلايا العصبية المثبطة سواء في somata وneurites التي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لفهم ما إذا كان وجود هيكل 3D ينظم ديناميات الشبكة، وتمت مقارنة النشاط الكهربية المولدة حتى إلى الشبكات العصبية 2D التقليدية نمت على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، التي تمثل النموذج المرجعي.
الرقم 5. مقارنة بين ديناميات الشبكة التي أظهرتها 3D (العمود الأيسر) و2D (العمود الأيمن) الثقافات قرن آمون في كل مقياس الوقت (A: 1200 ثانية، B: 300 ثانية؛ C: 60 ثانية؛ D: 10 ثانية).، عرض المجالس 3D مجموعة متنوعة من التوقيعات من النشاط (أي رشقات نارية شبكة القصيرة والطويلة، ارتفاعه عشوائيالنشاط، رشقات نارية تزامنها)، في حين عرض تلك 2D نشاط نمطي أكثر وضوحا مع رشقات نارية فقط عالية متزامنة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويبين الشكل 5 قطعتي النقطية من تجربتين تمثيلية يؤديها على 3D (لوحات اليسار) و2D (لوحات اليمين) ثقافة الحصين خلال الأسبوع الرابع في المختبر. تظهر هذه المؤامرات النشاط الكهربائي من الشبكة المسجلة على كل الأقطاب النشطة (أي.، الأقطاب الكهربائية مع معدل اطلاق أكبر من 0.1 السنابل / ق).
ديناميات شبكات 2D عرض النشاط شبه متزامن تتكون أساسا من رشقات نارية الشبكة. التوقيع على هذه الديناميكية هو وجود أحداث متزامنة التي تنطوي على معظم القنوات تسجيل يتخلل الفترة التي يتم فيها تسجيل النشاط تقريبا أي (انظر اللوحة اليمنى منالشكل 5D). يمكن تقدير هذا السلوك على نطاقات زمنية مختلفة، ومستويات مختلفة من التكبير التسطير.
في حالة وجود شبكة 3D، والتوقيع على ديناميات شبكة تتكون من ذخيرة واسعة من الأنشطة التي تتميز ب: (ط) التزامن أقل العالمي، (ب) النشاط ارتفاعه أكثر عشوائية، (ج) الفترات التي شبكات فرعية (أي ، مجموعة فرعية من الميكروية) تمثل النشاط أكثر متزامن مع وقوع انفجارات الشبكة. وعلاوة على ذلك، ومدة رشقات نارية الشبكة هو أكثر متغير أيضا: هناك وجود شبكة رشقات نارية مع مدة مماثلة لتلك التي لوحظت في شبكات 2D، ولكن هناك أيضا رشقات نارية الشبكة أطول. توصيف كامل والكمي لديناميات الناشئة 3D التي تم الحصول عليها باستخدام مثل هذه الأساليب يمكن العثور عليه في 16. كما كان متوقعا، و3D المعارض الشبكة العصبية أيضا 'ارتفاعه عشوائي "كبير وغير متزامن انفجار لctivity. تم تثبيتهم معقولية الديناميات التي تولدها هذه الهياكل 3D مع بعض-تجارب السيطرة (على سبيل المثال، وجود شبكة 2D إلى جانب لMEA مع كومة من بلي العارية والشبكات 3D تجميعها على بلي مع MEA العارية)، كما ذكرت في 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل، وهو تجريبية جديدة في منصة المختبر تتكون من 3D هندستها الثقافات العصبية بالإضافة إلى تم تقديمه الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لشبكة الكهربية. وقد تم استخدام بلي كما سقالة للسماح ثمرة التهاب الأعصاب على طول ض -axis مصممة لتكون متكاملة مع MEA مستو. في هذه الطريقة، والحصول على نتائج نظام الجزئي في المختبر في نموذج 3D صحيح وموثوق بها لدراسة ديناميات الكهربية الناشئة 16.
MEA تسجيل مجموعة المتابعة
تتكون أجهزة MEA من دائرة الثقافة مع مجموعة متكاملة من جزءا لا يتجزأ من الركيزة الدقيقة الأقطاب الكهربائية القادرة على قياس إشارات الخلية من الأنسجة الكهربائية النشط. وتتألف الإشارات المسجلة نموذجية من المسامير (أي واحدة فوق عتبة الجهد الاختلاف تمثل النشاط الكهربائي من واحد أو أكثر من الخلايا العصبية) ورشقات نارية (أي سلسلة من المسامير معبأة للغاية في كثير من الأحيان occurrinز في وقت واحد على عدة قنوات). تسجيلات من الخلايا العصبية النشاط الشبكات مع النظم القائمة على MEA تنتج كمية هائلة من البيانات (على سبيل المثال، تجربة 4 ساعات مع قنوات MEA 60 تنتج رقما قياسيا من حوالي 15 GB). وهذا يعني الحاجة إلى وجود أدوات فعالة لمعالجة وتحليل البيانات، وخاصة في حالة الدراسات التي تتطلب التسجيلات طويلة. بشكل عام، يتم الحصول على تسجيل الإشارات الكهربية من قبل تنبيغ خارج الخلية مباشرة مع الثقافات العصبية، واكتساب إشارة الجهد. بعد التضخيم وتصفية المرحلة، يتم أخذ عينات إشارات 10-50 كيلو هرتز وتخزينها. إشارات أولية ثم يتم الذروة-الكشف عنها بواسطة أداة برامج مخصصة المتقدمة. يتألف نظام تسجيل (1) مكبر للصوت MEA، (2) أجهزة الكمبيوتر الشخصية المزودة A / D اكتساب المجلس، (3) برنامج تسجيل، (د) نظام التدفئة وتحكم في درجة الحرارة، (4) CO2 جو-الحفاظ على والتبخر تمنع- الأنظمة.
البناء الشبكة العصبية 3D يذهب من خلال اثنين من الخطوات الحاسمة: الأول هو توزيع المبلغ الصحيح من الخرز على لوحات multiwell مع سطح إدراج الغشاء، والثاني هو نقل تعليق بلي مع الخلايا العصبية ملتصقة من multiwell لوحات مع إدراج غشاء إلى: (أ) الشبكة العصبية 2D مطلي على منطقة نشطة للMEA (الطبقة الأولى)؛ (ب) طبقات استقر بالفعل. وينبغي تكرار هذه العملية عدة مرات كما أن عدد طبقات المطلوبة. خلال الأسبوع الأول للثقافة، والنمو السريع للملحقات التهاب الأعصاب يحدث في جميع أنحاء بلي ينتمون إلى طبقات مختلفة. الارتباط الوثيق بين الخلايا العصبية وبلي استقرار العينات البيولوجية وتسمح لنقله من الحاضنة لتغيير / استبدال المتوسطة وتسجيل مع مكبر للصوت MEA النشاط الكهربائي دون الحاجة إلى القلق بشأن الإضرار بها.
منذ النشاط الكهربية من صافي كامليتم تسجيل العمل فقط من الطبقة السفلية (أي واحد إلى جانب مباشرة إلى MEA)، يجب أن تكون مشمولة منطقة نشطة عن طريق شبكة 2D التقليدية. سيتم إضافة طبقات أخرى خطوة بخطوة خلال 2D واحد، وسيتم نشر وصلات طويلة المدى بين الطبقات. عمليا، يتم إضافة طبقات أخرى في وقت لاحق 6-8 ساعة من 2D واحدا تلو يطيح خليط من الخلايا العصبية وبلي. إن اختيار هذا الإطار الزمني يسمح لتشكيل عدد قليل من الاتصالات المشبكية في طبقة 2D، ويضمن إمكانية تأسيس اتصالات إلى الطبقات العليا أيضا.
اثنين من العوامل تجعل من استخدام لوحات multiwell مع غشاء إدراج اللازمة لتحقيق أهداف الشبكات 3D: (ط) منذ الخلايا العصبية وبلي الحالية بسرعة الترسيب المختلفة، واستخدام لوحات multiwell مع إدراج غشاء يضمن توزيع موحد للخلايا العصبية في الجزء العلوي من بلي : في المتوسط، قد يكون محاطا كل microbead من نفس العدد من الخلايا العصبية. (ب) Bذ استغلال خصائص مرنة لوحات multiwell مع إدراج غشاء، والغسيل العكسي من حل بلي بالإضافة إلى الخلايا العصبية هو أسهل من استخدام الأسطح الصلبة مثل البولي متعددة الآبار.
العمل المقدم يتبع النهج الذي اقترحه Pautot وزملاء العمل 15: في هذه الدراسة على استخدام حبات السيليكا توفير سطح نمو كبيرة بما يكفي لأجسام الخلايا العصبية على الالتزام وعملياتها في النمو، ناضجة وإنتاج التخصصات ما قبل وما بعد متشابك . A بديلا صالحا للاستخدام الخرز سقالة يأتي من الهلاميات المائية المصفوفات أو النشطة بيولوجيا والخرز القابلة للتحلل المؤلفة من البوليمر الحيوي الطبيعي مثل الشيتوزان. الكيتين والمشتقات deacetylated لها، الشيتوزان، غير سامة، مضاد للجراثيم، والبوليمرات الحيوية القابلة للتحلل حيويا. ثابت الوقت لمثل هذه العملية التحلل البيولوجي متوافق مع شبكة تتفوق 20،21.
قد تشكل هذه الدراسة الع المرجعيةك للتنمية المستقبلية لنظم متقدمة نموذج الخلايا العصبية 3D لدراسة منهجية التفاعل بين الديناميات الشبكة والبنية. في وقت قصير، ونأمل أن تكون قادرة على نقل بناء شبكة 3D على جيل جديد من الأجهزة 22. تقنية تصنيع تنطوي على إنتاج أسلاك على شكل أعمدة الصغرى في مرتفعات متفاوتة ما بين 50 و 350 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب أشكر جورجيو كرليني للدعم الفني في تطوير بنية الحبس وDOTT. أورنيلا LoBrutto لمراجعة شاملة للمخطوطة. تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج بتمويل من البرنامج الإطاري ال 7 للاتحاد الأوروبي (ICT-FET FP7 / 2007-2013، FET يونغ مخطط المستكشفين) بموجب اتفاقية منحة 284772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).
