Introduction
마이크로 전극 배열 (다자간)에 결합 된 생체 외 2 차원 신경망에서 신경 역학과 기본 연결 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 채택 금 표준 실험 모델을 arethe. 개발하는 동안, 신경이 잘 표시 복잡한 네트워크를 다시 definedspatio-temporalpatternsof 활동 1, 2 (즉, 버스트, 네트워크 버스트, 임의의 급상승 활동). MEA의 네트워크 레벨에서 표현의 상세한 역학 조사를 허용 많은 위치에서 (수십 마이크로 전극으로부터 수천) 전기 생리 활성을 기록한다. 또한, 해리 배양의 사용은 설계 - 네트워크를 설계 할 possibile 만든다. 이것은 이런 식으로 이해하기 쉽게 기록 전기 생리 활성 간의 기능적 관계 및 셀 밀도 3, 4, 5의 모듈화 정도, 이종 신경 팝의 존재 등의 네트워크 조직의 파라미터등 ulations 6 그러나, 배양 된 세포에 해리 된 모든 시험 관내 시험은 2D 신경 네트워크에 기초한다. (7) 모든 방향으로 확대 할 수 평탄화되어 2D 모델 인 somata 성장 콘 (I) 및 축색 돌기 - 생장이 방법은 생체 내 (본질적으로 3 차원, 3D) 시스템에 대해 oversimplifications 리드. (II) 2D 체외 네트워크 전시는 네트워크 (8)의 신경 세포의 대부분을 포함하는 활동을 파열에 의해 지배 전기 생리 역학에 박힌.
최근, 다른 솔루션은 3D는 신경 네트워크를 해리 체외의 구성을 허용하도록 개발되었다. 일반적인 생각은 신경 세포는 3D 방식으로 성장할 수있는 발판을 만드는 구성되어 있습니다. 이러한 지지체는 고분자 겔 및 고체 다공성 매트릭스 9-13로 실현 될 수있다. 중합체의 기계적 특성을 이용함으로써, 내부 살전 세포를 포함 할 수있다neurosphere를 11의 3D 문화의 균일 한 블록을 정의하여 전자 구조. 이 방법의 주요 특징은 neurosphere를 9,12-의 강성, 기계적 특성이다. 그러나, 이들 물질은 기공률이 제한되어, 그들은 매트릭스 내부 세포 이동을 보장하지 않는다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 가능한 해결책은 '단위'모듈로 매트릭스를 슬라이스로 구성되어 있습니다. 불행히도, 입자의 크기 및 형상은 다양 정규 층상 구조로 포장을 방해 할 수있다. 7에서 컬린과 동료 생리 활성 세포 외 기질 기반의 발판 내에서 뉴런 및 / 또는 성상 세포로 이루어진 3 차원의 연결 구조를 설계했다. 이러한 설계 신경 조직은 3 차원 미세 환경 내에서 신경 생물학적 반응을 연구하고 조작하는 체외 조사에있었습니다. 이 모델은 세포 외 기질 (ECM) 및 / 또는 하이드로 겔 지지체 (500-600 μm의 두께)에 걸쳐 분산 뉴런 및 아교 세포로 구성되었다. 이 공동으로/ mm 3 5,000 세포 - ndition, 최적의 세포 생존율 (90 % 이상)은 약 3,750의 최종 밀도로 세포를 플레이 팅에 의해 발견되었다. 그러한 밀도 값은 마우스 뇌 피질의 세포 밀도는 약 90,000 세포 / 14 mm 3 인 생체 조건에서 하나보다 훨씬 낮다는 것을 주목해야한다. 이러한 제한을 극복 Pautot 15은 셀 밀도와 네트워크 연결이 네트워크의 실시간 영상을 가능하게하면서 생체 조건에서 비슷하게 제어되는 3D 관내 시스템을 실현 동료에게. 실제로,이 방법은 배양 된 신경 세포는 실리카 마이크로 비드에 성장 할 수있는 해리 개념을 기반으로합니다. 이 구슬을 준수하는 신경 세포 기관 및 성숙, 성장, 확장, 다른 뉴런 시냅스 연락처를 정의하는 그들의 arborizations만큼 큰 성장 표면을 제공한다. 이 방법은 FO하는 단 분산 비드의 자발적인 조립 성질을 이용RM 차원이 다른 구슬에 신경 세포 사이의 제한된 연결과 다른 층에 신경 세포의 고유 한 하위 집합을 포함하는 육각형 배열을 계층. 이 방법으로 달성 세포 밀도는 / mm 3 약 75,000 세포이었다.
최근에, 우리는 다자간 16 Pautot의 방법을 적응 : 얻어진 결과는 3D 전기 생리 활동이 2D 네트워크에 의해 표현 된 것보다 활동의 폭 넓은 레퍼토리를 제시 것으로 나타났다. 3D 성숙한 문화가 향상된 동적을 전시하는 네트워크 버스트 임의 스파이크 활동이 공존하는 모두. 마찬가지로, 탕-Schomer 동료 17 개월 일부 체외에서 일차 피질 배양을 유지 실크 프로테인 계 다공성 지지체를 실현하고, 텅스텐 전극에 의해 전기 생리 활성을 기록했다.
이 연구에서, 실험 절차는 MEA를 결합 3D 신경 네트워크를 구축하는 것이 설명 될 것이다.
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Protocol
실험 프로토콜은 DL 1,992분의 116에 따라와 제노바 (보호 해주는 대학의 지침에 의해 건강의 이탈리아 교육부 유럽 동물 관리 규정 (63분의 2,010 / EU)에 의해 승인되었다. N. 13130, 월 2011). 모든 노력이 프로젝트 동물의 수를 줄이기 위해 자신의 고통을 최소화 하였다.
재료 및 지지대 1. 준비
- CNC (컴퓨터 수치 제어) 밀링 머신에 의해 PDMS (폴리 디메틸 실록산) 제약 조건을 구축 할 수있는 틀을 구축합니다. 이러한 몰드는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌의 중앙 실린더 (PTFE), 폴리 카보네이트로 실현된다. PDMS가 강화되면이 물질은 마스크의 쉽게 추출 할 수 있습니다.
주 : 주형의 설계는 컴퓨터 지원 설계 (CAD)에 의해 수행하고 CNC 밀링 머신에 전달되었다. - PDMS 엘라스토머를 준비합니다. PDMS는 유기 폴리머이다. 그것은 두 가지 요소로 구성되어있다경화제 및 중합체. 1:10 부피비로 섞는다, 경화제의 일부 및 중합체의 아홉 부품. , 페트리 접시에서 두 성분을 넣어 진탕하고 기포를 제거하기 위해 10 분 동안 진공 챔버에서 믹스를 삽입한다. PDMS의 3g 하나의 제약 조건에 대한 충분하다.
- PDMS 제약을 구축합니다. 성형기에 PDMS 재료를 넣고 120 ℃에서 30 분 동안 오븐에 넣어. PDMS 제약은 각각 22.0 및 3.0 mm의 외부 및 내부 직경 650 ㎛의 높이를 갖는 원통의 이상적인 형상을 갖는다.
- 도금 하루 전에, 커플 실체 현미경 집게 의해 마이크로 전극 어레이 (다자간)의 활성 영역에 마스크 및 120 ° C의 오븐에서 PDMS 마스크 살균.
- 원추형 바이알에 2 시간 동안 70 %의 에탄올 및 EV 회전 (42.3 ± 1.1 μm의 평균 직경의 인증을 40 ± 2 ㎛의 공칭 직경) 유리 마이크로 비드를 살균ERY 30 분 모든 마이크로 비드를 노출합니다.
- 유리 병에서 에탄올 용액을 제거하고 마이크로 비드를 멸균 수로 2 회 씻어.
- 0.05 ㎍ / ㎖의에 폴리 -D- 라이신과 라미닌 혼합액 24 μL와 (직경이 3.0 mm로 동일) PDMS 마스크로 구분 MEA 영역의 중앙 부분을 컨디셔닝.
- 코트 0.05 μg의 /에서 접착 단백질, 라미닌 및 폴리 D 라이신과 마이크로 비드 용액과 안정하고 오래 지속되는 신경 네트워크를 획득하기 위해, 37 ℃ 배양기에 밤새두고 그들.
- MEA의 유리 표면으로부터 유리 마이크로 비드에서 모두 접착 인자를 제거한다. 대기음 피펫 코팅 용액의 약 95 % 및 MEA 표면에 멸균의 작은 부피 - 24μl- 적용. 대기음은 다시 95 개 이상의 물 %와 세포를 도금하기 전에 1 시간 동안 층류 후드 아래 MEA 건조를 할 수 있습니다.
주 : 대신 마이크로 비드의 경우, 코팅 대기음용액 및 뉴런 도금한다 유리 표면을 컨디셔닝하기 위해, 멸균 수와 기본 배지와 같은로서의 B27 보충제와 두 번째 세척으로 제를 만든다. 마이크로 비드가 건조하게하지 마십시오. 유리 병 내부의 배양액에 부유을 남겨주세요. - 그들이 균일 한 층을 형성하는 자기 - 조립된다 멤브레인 삽입물 (구멍 직경 0.4 μm의)와 멀티 웰 플레이트에 피펫 -200 μl-, 처리 된 마이크로 비드 현탁액 (약 32,000)을 이용하여, 배포.
- 매체의 0.5 ml의 멤브레인의 각 웰을 입력하고 인큐베이터에 넣어 (T = 37.0 O C, CO 2 = 5 %) 뉴런 (3.2) 도금 될 준비가 될 때까지.
2. 태아의 해부 및 조직의 해리
- 일반 명암 일정에 따라 일정한 온도 (22 ± 1 ℃로)과 상대 습도 (50 %)에서 하우스 성인 여성 쥐 (2백~2백50그램) (빛에 오전 7시에서 오후 7시까지)에서동물 시설. 그 음식을 확인하고 물을 자유롭게 사용할 수 있습니다.
- 3 % 이소 플루 란을 사용하여 개발 십팔일 (E18) 후 임신 여성 쥐를 마취. 그 후, 경부 탈구에 의해 동물을 희생.
- 각 쥐의 배아에서 해마를 제거하고 칼슘과 마그네슘없이 얼음 차가운 행크의 균형 염 용액 2+에 배치합니다. 하루에 개발 해마와 피질 조직 (18)는 매우 부드럽고 작은 조각으로 절단 할 필요가 없습니다. 더 자세한 사항은 18, 19을 찾을 수있다.
- 37 ℃에서 18-20 분 동안 DNase의 0.05 %를 함유하는 트립신 / 행크 용액의 0.125 %로 조직을 해리.
- 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 제거하고 5 분 동안 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 매체를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다.
- FBS로 배지를 제거하고 그 보충, 1 % L- 글루타민, 10 μg의 겐타 마이신 / ㎖와 배지로 한번 세척 하였다. 파스퇴르 핍 다시 매체를 제거두기가 보충은, 1 % L- 글루타민, 10 μg의 겐타 마이신 / ㎖와 함께 성장 배지의 소량 (500 μL)로 다시 채우고.
- 세포의 유백색 현탁액 명백한까지 좁은 파스퇴르 피펫 기계적 조직 펠렛을 해리. 이 세포 현탁액을 원심 분리 할 필요가 없다.
- 2.0 ㎖의 최종 부피를 얻기 위해 생장 배지로 세포 현탁액의 소량 희석. 혈구 챔버와 얻어진 세포의 농도를 계산합니다. / μL 600-700 세포의 원하는 세포 농도를 얻기 위해, 5 : 1에서 이러한 농도를 희석.
3. 셀 도금
- PDMS 제약 조건에 의해 정의 된 MEA의 활성 영역 상에 약 2,000 세포 / mm 2의 밀도로 접시 세포는 2D 신경 네트워크를 생성한다.
참고 : 각 해마는 약 5 × 10 5 세포를 포함, (하나의 배아에 대한 1 × 6). 6 × 10의 총량을 얻기 위해 6 배아를 해부하다6 2 ㎖ 중의 세포 및 / μL 3,000 세포의 추정 농도. 원하는 세포 농도를 구하고 약 600-700 세포 / μL 판형 위해 5 : 1에서 이러한 농도를 희석. PDMS 제약으로 구분 MEA 영역은 약 7.065 mm (2) 및 도금 된 세포의 총 수의 경우 600 세포 / μL X 24 μL = 14,400 세포 / mm 2 2,038 세포의 최종 농도. - 37 ℃에서 가습 이산화탄소 분위기 (5 %)와 인큐베이터에 MEA 장치를 놓습니다.
- 삼차원 배양 건설 예비 단계를 완료하기 위해 멀티 웰 플레이트 내부에 위치 된 마이크로 비드 단층의 표면 상 / μL 600-700 세포 (약 100,000 세포)의 세포 농도로 현탁액 160 μl를 배포한다. 37 ℃에서 가습 이산화탄소 분위기 (5 %)로 인큐베이터에서 멀티 웰 플레이트를 넣습니다.
4. 3D 신경 네트워크 구축
- 6-8 시간 도금 후, 약 30 ~ 40 μL의 볼륨 설정 피펫을 사용하여 PDMS 제약에 의해 구분 된 지역 내에서 매우 신중하게 멀티 웰 플레이트에서 서스펜션 (신경 세포와 마이크로 비드)를 전송합니다. 각 전송 후에, 육각형 컴팩트 한 구조로 자기 조립에 마이크로 비드를 허용, 절반 잠시 기다립니다.
- 모든 층들이 증착되고 자발적 조립되면, 매체의 약 300 μL PDMS 제약으로 구분 영역의 상부의 큰 방울 리필.
- 인큐베이터 (T를 = 37.0 O C, CO 2 = 5 %)을 MEA에 연결된 3 차원 구조를 넣어 48 시간 동안 그 보충하여 성장 배지 배양의 최종 부피 (약 1ml)에 추가하기 전에.
참고 : 막 삽입 (30,000) 및 MEA 장치 (6000) 상에 단일 층에 구슬의 수와 멀티 웰 플레이트에 구슬의 수를 고려한다. 생성 된 3 차원 구조는 MI의 5 층으로 구성되고crobeads 세포. 3D 신경 네트워크는 기하학적으로 완전한 아니라고 고려하여, 결과적인 3D 구조는 5~8 층으로 구성 될 수있다. - 날은 도금 후, 조심스럽게 MEA 링 내부의 중간 (약 900 μL)의 최종 부피를 추가합니다. 4~5주 동안 37 ° C에서 CO 2의 가습 분위기 (5 %)의 3 차원 배양을 유지한다. 일주일에 한 번 매체의 절반을 교체합니다.
5. 공 초점 현미경 취득
- 홀더 현미경의 단계로 생물학적 샘플을 수정합니다. 정확한 대역폭 방출 필터와 순서를 캡처 할 각 이미지에 대한 PMT의 화상, 이득 및 오프셋 (-0.3 %)을 획득하는 레이저 (아르곤 4백96에서 5백55까지 ㎚), 스캔 속도 (400 Hz에서) 설정할 포화를 방지하고 신호대 잡음비를 증가시키기 위해. 결과 섹션은도 4의 이미지를 획득하는 데 사용되는 값을보고한다.
- Z -stack 순서, 전나무의 취득ST는, 상부 및 샘플의 하부 층의 Z 위치의 값을 선택하고 획득하게 스텝 사이즈를 선택한다.
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Representative Results
.이 실험 절차에서 중요한 역할 3D 신경 네트워크의 성장을위한 기계적 지지체를 정의하는 마이크로 비즈에 의해 재생되는 1a 및 B 화면을 마이크로 비드의 배열 (40 ± 2 ㎛의 공칭 직경도]의 인증 평균 직경 평면에서 42.3 ± 1.1 μm의). 이러한 구조의 특수성은 마이크로 비드가 자발적으로 소형 육각형 형상 (그림 1B 및 C)를 정의하는 자기 조립이다. 이렇게 생성 된 지지체는 신경 돌기 및 균체의 대사 교환 충분히 큰 격자 공간을위한 일관된 성장 표면을 보장한다. 이 마이크로 비드 치수는 간질 간격 및 최종 신경 세포 밀도에 대한 합리적인 타협으로 증명한다. PDMS 구조는 "이상적인"실린더를 재현하고 컴팩트 육각형 구조의 영향 인자 (HPF) (40) 이후의 구슬의 최대 수 (직경 0.74 같다고 고려81; PDMS 제약 내에 포함 m)은 약 10 만, 각 층 당 약 6,000 마이크로 비드에 대응하는 것이다. 프로토콜 섹션에서 설명하고있는 바와 같이, 이러한 마이크로 비즈 사전 조건 접착 인자 (예, 라미닌 및 폴리 - D - 라이신)에 있습니다. 이 절차는 뉴런 마이크로 비드에 부착 것을 보장한다.도 1d는 세 뉴런이 40 ㎛의 직경을 갖는 마이크로 비드에 결합되는 예를 나타낸다.
신경 네트워크의 발판을 만드는 데 사용되는 마이크로 비드 1. 이미지를 그림. (A, B) 막 인서트 멀티 웰 플레이트의 표면에 마이크로 비드 단층의 두 가지 예. (C) 마이크로 비드는 중력 하에서 정착 자발적 차원 육방 배열로 조립. 첫번째 층은 완전히 다른 비드를 추가 충전되면, 빌드육각형 대칭을 갖는 제 2 정렬 층을 보내고. 마이크로 비드를 더 첨가 패킹 조립체의 3 차원 구조의 결과. 마이크로 비드 사이의 여유 공간을 신경 프로세스와 세포 기관에 의해 채워집니다. (D) 세 개의 신경 세포가 이전에 부착 인자 (라미닌 및 폴리 - D - 라이신)와 에어컨, 하나의 마이크로 비드의 표면에 고정되어 있습니다. 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
MEA의 활성 영역과 마이크로 비드와 뉴런의 인터페이싱은도 2A 및 B에 도시 된 몰드로 실현 엘라스토머 제약 (도 2c)에 기인한다.도 2a는 레이아웃 및 선택된 치수를 나타낸다. MEA의 활성 영역 (도 2d MEA 기판에도 2c의 PDMS 구조 결합에 의해 구분되고). 이러한 방식으로, 뉴런은 MEA의 전극 활성 면적을 준수하도록 강제된다. 이어서, 접착 성 뉴런으로 유리 마이크로 비드 스택이 먼저 층에 수용 될 것이다.도 2d는 PDMS 구조의 역할이 명확하게 이해 될 수있는 최종 구성의 단면을 도시한다. PDMS 구조에 의해 구분 된 공간은 마이크로 비드 및 신경 세포의 혼합물 (그림 2D의 하단 패널에 백색 분말)가 포함되어 있습니다. 외부 및 내부 직경 22.0 mm 및 3.0을 각각 650 ㎛, 높이 : PDMS 구조는 다음의 치수와도 2b에 도시 된 몰드에 내장 실린더의 형상을 갖는다. 금형은 각 사용 후 PDMS 감소의 끈끈한 특성 때문에, 이상적인 부드럽고 강한 소재가 mask.The PDMS 제약 짧은 수명을 표시 탄성 중합체의 추출을 용이하게 할 수 있도록 폴리 카보네이트 및 PTFE를 사용하여 구축되었다. 일반적으로 각 PDMS 구조가 성공적으로 세 번 이용 될 수있다.
그림 3D 신경 네트워크를 구축 2. 재료. 물리적 제약을 생성하는 데 사용 된 몰드의 (A)의 설계 및 (B) 이미지. 회색 3mm 직경은 실린더 (C)에 도시 된 제약. (C) 제약 PDMS 마이크로 전극 어레이 (MEA)의 활성 영역에 배치의 구멍에 대응한다. 이러한 물리적 배리어의 사용은 대상 지역 내의 마이크로 비드를 포함 (약 7mm 2) 및 3 차원 네트워크의 개발을 제한 할 수있다. (D) MEA 시스템 및 제약의 단면. (오른쪽 상단 모서리에있는 현미경으로 묘사) 마이크로 비드는 PDMS 제약 (하단 패널)에 의해 구분 된 공간으로 채워진다.080fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3의 패널에 도시 된 바와 같이, PDMS 마스크에 의한 MEA의 활성 영역의 한정 후 프로토콜은 뉴런과 마이크로 비드의 조립을 실현하는 주요 단계를 설명 계속한다.
제 1 예비 도금 공정 이전에 부착 분자 라미닌 및 폴리 D 라이신 (도 3a)으로 미리 코팅 하였다 MEA 표면 상으로 신경 세포를 해리 된 것으로 이루어진다. 그것은 2D 신경 네트워크는 MEA의 활성 영역에 직접 부착하는 것이 필수적이다 : 이들 조건 하에서, 전기 생리 신호 (즉, 스파이크 및 버스트)의 기록이 가능하다. 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 2D 뉴런 플레이트에 사용되는 표준 절차에 해당한다. 3D 시스템의 실제 구성은도 3b를 참조하면, C 및 D에 도시되는 (도 3b)와 멀티 웰 플레이트에 위치한다; 이후, / μL 600-700 세포 (약 100,000 세포)의 세포 농도를 가진 160 ㎕의 현탁액을 마이크로 비드 단층 (도 3C) 상에 분배된다. 세포가 비드 면적의 절반을 차지할 수있는 점을 감안, 총 자유 표면은 75mm 2입니다. 마이크로 비드 단층의 세포 밀도 / mm 2 내지 약 1,500 세포이다. 멤브레인 삽입물과 활용 멀티 웰 플레이트를 33.6 mm (2)의 표면과 공막을 제시한다. 공막 표면 및 40 μm의 (비드 직경)의 높이와 동일한베이스 영역 가상 원통 형상을 고려하여, 30,000 마이크로 비드로 이루어지는 균일 한 층은 막 인서트 멀티 웰 플레이트에 결합된다. 마이크로 비드 및 신경 세포의 때문에 실현 서스펜션은 막 삽입과 멀티 웰 플레이트 내부에 약 6-8 시간 동안 유지됩니다. 한 번완료된 상기 단계, 3 차원 네트워크 구조를 시작할 수있다. 이때, 뉴런과 마이크로 비드의 혼합물을 멤브레인 인서트 멀티 웰 플레이트에서 제거하고 이전에 PDMS 제약 (도 3d)에 의해 정의 된 영역에 도금 2D 신경 네트워크에 배치. 이 절차를 수행하는 동안, 신경 세포의 약 20 ~ 30 %의 손실이 발생 (I) 기계 조작 및 때문에 (II) 막 외부 전송합니다. 상기 생성 된 3D를 구속 (7.06 mm 2) 178.56 μm의 (비드 5 층)의 높이의베이스 영역을 고려하여, 비즈의 5 층으로 형성 이상적인 실린더의 부피로 세포 수를 나눔으로써 신경 네트워크 셀 밀도 / mm 3 내지 약 80,000 세포이다.
기본 단계의 그림 3. 스케치는 2D와 3D의 연결 네트워크를 만들 수 있습니다. (A) 도금 OMEA의 활성 영역에 F 뉴런. 신경 세포 현탁액을 미리 부착 인자 조절과 PDMS 제약으로 구분, MEA 표면 상에 도금된다. 이 단계는 실현 할 수 있습니다 : I) MEA에 결합 된 고전적인 2D 신경 네트워크; ⅱ) 전기 생리 활성이 기록 될로부터 3 차원 네트워크의 제 1 층. (B) 마이크로 비드 및 (C) 뉴런 6-8 시간 후에 막 인서트 멀티 웰 플레이트의 표면에 전달된다. (D) 현탁액 뉴런과 마이크로 비드 2D 네트워크 막 인서트 멀티 웰 플레이트로부터 이동된다. 이 공정의 반복 여러번. 고밀도 다층 3D 구조를 정의하는 3 차원 구조가 완료되면, 중간 방울 첨가 (E)를 허용하고, 결과적인 구조는 48 시간 동안 인큐베이터에 저장된다. (F를 ) 48 시간 후, 3 차원 배양은 완전히 매체의 최종 부피로 리필된다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
제 층이 배치 된 후에, 동일한 동작은 패킹 3D 앙상블을 얻기 위해 반복된다. 그 결과 3 차원 구조 자체는 콤팩트 한 구조의 자기 조립은 마이크로 비드와 뉴런 (그림 4)의 약 5 ~ 8 층으로 구성하는 콜로이드 결정을 정의 재구성. 모든 층이 형성되면, 3D 네트워크는 배지 300 μL (도 3e)의 강하로 리필되어야한다. 이 단계에서, MEA의 결합 3D 네트워크는 48 시간 동안 인큐베이터에 저장 될 수있다. 그 후, 배지 1 ㎖ MEA (도 3f)의 링을 채우기 위해 추가된다.
모든 층들이 조립 된 후에는 신경 돌기 / mm 3 내지 약 80,000 세포의 최종 세포 밀도에 도달 마이크로 비드 지지체 위에 성장. 그것은 notic 가치가있다얻어진 값은 92,000 세포 / mm 3, 마우스 뇌 피질 (14)의 평균 밀도로부터 멀리 신경 아니라고 보내고.
도 4 디스플레이 직립 초점 현미경에 의해 촬영 된 MEA의 결합 차원 네트워크의 세 가지 예. 도 4a에서, DIC는 (차등 간섭 콘트라스트) 이미지 MEA 표면에 결합 된 비드의 단일 층을 도시한다; 현미경은 20.0 NA 0.50 물과 결합시켜 목적 및 이미지 전송 PMT는 레이저 현미경 및 아르곤 (488nm)을 포함하여 획득 하였다. 사진은 매우 명확 전극의 공간 배치 (검은 점)과 마이크로 비드의 규칙적인 공간 구성을 보여줍니다.
그림 (b), MAP-2 (적색 신호)에 대한 면역 염색에서 직접 ME의 전극면에 결합 된 마이크로 비드 주위의 신경 세포의 수지상 arborizations의 유통 및 인 somata를 표시(블랙 접점의 존재는 관찰 할 수)있다.도 4b는 스텝 사이즈와 Z- 스택 시퀀스 (108 μm의)의 최대 투영 인 1.53 ㎛ 인 같다. 이미지는 40.0 NA 0.80 물 목적으로 취득한; 여기 아르곤 레이저 (488 ㎚), 발광 대역폭 496nm - 655 ㎚이다.
마지막으로,도 4c는 3D 해마 문화의 Z -stack 시퀀스 (187.79 μm의)의 최대 투사 표시 (스텝 크기는 2.27 μm의)입니다. Z -stack 순서는 25.0 NA 0.95 물 목적으로 인수되었다. 녹색 채널에 대해, 아르곤 레이저와 488nm 발광 필터 대역폭 499nm-551nm을 사용 하였다. 적색 채널에 대해, 543 nm의 레이저 발광 및 필터 대역폭 555nm-645nm을 사용 하였다. 채널은 시퀀스 모드에서 획득했다. NeuN 표지되는 뉴런 (적색 신호) 성숙 후 유사 분열 신경과 가바 (녹색 신호에 대한 표현 곳 매우 상호 연결된 네트워크는 YEL 나온다) 병합 낮은. 가바 항체 억제 뉴런 모두 인 somata 및 신경 돌기의 양성을 밝혔다.
도 4 초점 현미경에 의해 촬영 된 3 차원 네트워크의 세 가지 예를 도시한다. MEA 표면에 결합 된 비드 단층을 나타내는 (A) DIC (미분 간섭 대비) 화상; 전극 (검은 점)의 공간 배치는 MAP-2 (적색 신호)에 대한 (B) 면역 형광 염색법. 관측 수지상 arborizations의 분포와 직접 MEA의 전극면에 결합 된 마이크로 비드 주위의 신경 세포 인 somata를 표시합니다. ( C) 뉴런이 NeuN 표지되는 고도의 상호 연결된 네트워크를 표시하는 3D 문화의 Z -stack 시퀀스 (187.79 μm의)의 최대 투영, 녹색 신호 (적색 신호 (성숙 후 유사 분열 뉴런)과 가바에 대한 표현 병합 노란색 ). GABA 항체 REV인 somata 및 신경 돌기 모두 억제 뉴런에 대한 양성 ealed. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3 차원 구조의 존재가 네트워크 동력학을 변조 여부를 이해하기 때문에 발생 된 전기 생리 활성 참조 모델을 나타내는 MEA의 위에 성장 된 종래의 2D 신경 네트워크, 비교 하였다.
3D (왼쪽 열) 및 2D (오른쪽 열) 해마 문화에 의해 전시 된 네트워크 역학 사이 그림 5. 비교마다 규모 (1,200 초, B : 300 초, C : 60 초, D : 10 초)., 3D 어셈블리 활동의 서명의 다양한 표시 (예, 짧고 긴 네트워크 버스트, 임의 스파이크2D의 사람은 높은 동기 버스트와 더 발음에 박힌 활동을 표시하면서 활동, 동기 버스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5는 시험 관내에서 네 번째 주에 3 차원 (왼쪽 패널) 및 2D (오른쪽 패널) 해마 문화에서 수행이 대표 실험의 두 래스터 플롯을 보여줍니다. 이러한 플롯은 모든 활성 전극 상에 기록 된 네트워크의 전기 활성을 나타내는 (예., 연소율이 0.1보다 큰 스파이크 / s의 전극).
2D 네트워크의 역학은 주로 네트워크 버스트로 구성된 준 동기 활동을 표시합니다. 이 중 동적 특성이 거의 활동이 기록되어있는 기간에 의해 산재 기록 채널들의 대부분을 포함 동기화 이벤트의 존재이다 (우측 패널 참조그림 5D). 이 동작은 확대 밑줄의 서로 다른 수준으로, 서로 다른 시간 규모에서 알 수있다.
3D 네트워크의 경우, 네트워크 역학 서명 특징으로 활동 광범위한 레퍼토리로 구성 (I) 이하 글로벌 동기 성, (ⅱ) 더 랜덤 급상승 활동, (ⅲ) 기간에있는 서브 네트워크 (즉, , 미소 전극의 서브셋) 네트워크 버스트의 발생과 동기 이상의 활성을 제시한다. 2D 네트워크들에서 관찰 된 것과 유사한 지속 기간의 네트워크 버스트가 존재하지만, 더 이상 네트워크 버스트도있다 : 또한, 네트워크 버스트의 지속 기간은 더 많은 변수도이다. 이러한 방법을 사용하여 얻은 긴급 3D 역학의 완전한 특성 분석 및 정량은 16에서 찾을 수있다. 예상 된 바와 같이, 또한 3 차원 네트워크의 연결을 나타낸다 중요한 "랜덤 스파이크 '비 동기 버스트ctivity. 이러한 3 차원 구조에 의해 발생 역학 개연성 같이, 일부 제어 실험 (예를 들면, 베어 MEA와 마이크로 비드 상에 조립 베어 마이크로 비드 및 3D 네트워크 스택 MEA에 결합 2D 네트워크의 존재)와 방음되었습니다 (16)에보고했다.
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Discussion
본 연구에서는 3 차원으로 구성 체외 플랫폼에서 새로운 실험 네트워크 전기 생리학에 대한 다자간가 제시되었다 결합의 연결을 문화를 설계. Z 방향을 따라 이동시킴으로써 행한다 신경 염성 생장을 허용하는 지지체로서 마이크로 비드의 사용은 평면 MEA와 일체화되도록 맞추어왔다. 이러한 방식으로, 유효하고 신뢰성있는 시험 관내 3D 모델에서 얻어진 마이크로 시스템 결과 출사 전기 생리 16 역학을 연구.
MEA 녹화 셋업
MEA 장치는 전기 활성 조직으로부터의 세포 외 신호를 측정 할 수있는 기판 매립 마이크로 전극 배열로 통합 배양 챔버로 구성된다. 전형적인 기록 신호 (즉, 단일 문헌 임계 전압 하나 이상의 뉴런의 전기적 활성도의 변화를 나타내는) 및 버스트 (즉, 높은 충전 스파이크 시퀀스 종종 occurrin 스파이크 이루어져동시에 여러 채널에서 G). MEA 기반 시스템과의 연결을 네트워크 활동의 기록은 데이터 (예, 60 채널 MEA와 4 시간의 실험은 약 15 기가 바이트 기록을 생산)의 엄청난 금액을 생산하고 있습니다. 이는 처리하고 특히 긴 기록이 필요 연구의 경우, 데이터를 효율적으로 분석 할 수있는 도구를 가질 필요성을 암시한다. 일반적으로, 전기 생리 신호의 기록은 배양 신경 세포와 직접 전달하고, 전압 신호의 취득에 의해 얻어진다. 증폭 및 필터링 단계 후, 신호는 10 ~ 50 kHz의 샘플링 및 저장됩니다. 원시 신호는 피크 감지 사용자 정의 개발 소프트웨어 도구입니다. 기록 시스템 (1)은 MEA 증폭기로 구성, (2) A / D 수집 보드 (3)의 기록 소프트웨어, (d)의 가열 시스템 및 온도 조절기가 장착 퍼스널 컴퓨터 증발 방지 (4) CO2 분위기-유지 시스템.
3D 신경 네트워크의 구축은 두 가지 중요한 단계를 진행한다 : 첫 번째는 막 인서트 표면 멀티 웰 플레이트에 구슬의 정확한 양의 분포이며, 두 번째는 멀티 웰에서 접착 뉴런과 마이크로 비드의 현탁액의 전사는 막에 인서트와 플레이트 : (i)는 2D 신경 네트워크는 MEA (제 1 층)의 활성 영역 상에 도금; (ⅱ) 이미 침전 층. 이 조작에 필요한 층의 수만큼 반복한다. 문화의 첫 주 동안, 신경 염성 확장의 급속한 성장은 다른 계층에 속하는 마이크로 비드 주위에 발생한다. 신경과 마이크로 비드 사이의 밀접한 관계는 생물학적 시료를 안정화 및 / 변경 매체를 대체하고 손상에 대한 걱정없이 MEA 증폭기와 전기적 활동을 기록하기 위해 인큐베이터에서 이동 할 수 있습니다.
전체 네트의 전기 생리 활동 이후작업은 (즉, 직접 MEA에 결합 하나), 활성 영역이 종래의 2 차원 네트워크에 의해 커버되어야 바닥층에서 기록된다. 다른 층은 2D 하나를 통해 단계적으로 추가되며, 장거리 연결은 층 사이에 확산 될 것입니다. 실제로, 다른 층은 신경 세포와 마이크로 비드의 혼합물을 면직으로 6-8 시간 후 2D보다 추가됩니다. 이 시간 윈도우의 선택은 2 차원 층에 몇 시냅스 연결의 형성을 가능하게하고, 또한 상위 계층들로 연결을 설정하는 가능성을 보장한다.
두 가지 요인은 막과 멀티 웰 플레이트의 사용은 3 차원 네트워크를 실현하는데 필요한 삽입하게는 (i) 뉴런과 마이크로 비드 본 다른 침강 속도 사람을, 멤브레인 인서트 멀티 웰 플레이트의 사용은 마이크로 비드의 위에 뉴런의 균일 한 분포를 보장 평균적으로, 각 마이크로 비드는 뉴런의 동일한 수에 의해 포위 될 수있다. (ⅱ) BY는 멤브레인 인서트 멀티 웰 플레이트의 탄성 특성을 활용 뉴런에 연결된 마이크로 비드 용액의 역류는 폴리 카보네이트 멀티 웰 같은 고체 표면을 사용하는 것보다 더 쉽다.
제시된 작업 Pautot 제안한 방식을 따르며 15 동료 : 그 연구에서 실리카 비드의 사용이 부착하는 신경 세포체 충분히 크고 그 프로세스가 성장하기위한, 성숙 및 전후 시냅스 전문 생산 성장면을 구비 . 구슬 지지체의 사용에 유효한 대안은 하이드로 겔 매트릭스 또는 생리 활성 및 키토산 같은 천연 생체 고분자로 이루어진 생분해 구슬에서 온다. 키틴의 탈 아세틸 화 유도체, 키토산, 무독성 항균, 생체 적합성 및 생분해 성 바이오 폴리머이다. 이러한 생분해 처리의 시간 상수는 20, 21 빨리 성장 네트워크와 호환된다.
이 연구는 기준에 법과를 구성 할 수있다체계적으로 네트워크 역학과 구조 사이의 상호 작용을 연구하는 고급 3D 신경 세포 모델 시스템의 미래 발전을위한 케이. 짧은 시간에, 우리는 장치 (22)의 새로운 세대에 3 차원 네트워크 구조를 전송할 수 있도록 노력하겠습니다. 제조 기술은 50 내지 350 ㎛의 사이에 가변 높이에서 마이크로 기둥의 형태의 전극의 제조를 포함한다.
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Acknowledgments
저자는 감금 구조와 dott 개발 기술 지원 조르지오 Carlini 감사합니다. 원고의 철저한 개정 ORNELLA LoBrutto. 이러한 결과로 이어지는 연구는 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램에서 자금을받은 (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET 젊은 탐험가 계획) 보조금 협정 284772 뇌 활에서 (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
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