Introduction
Mikro-Elektrot Diziler (ÇÇA) bağlanmış in vitro iki boyutlu (2D) sinir ağları nöronal dinamikleri ve temel bağlantı arasındaki etkileşimi incelemek için benimsenen altın standart deneysel bir model arethe. Gelişimi sırasında, nöronlar iyi görüntüler karmaşık ağların yeniden definedspatio-temporalpatternsof aktivite 1,2 (yani patlamaları, ağ patlamaları, rastgele spike aktivitesi). ÇÇA ağ düzeyinde ifade dinamiklerin ayrıntılı bir soruşturma izin birçok sitelerden (onlarca Mikroelektronlar binlerce) elektrofizyolojik etkinliğini kaydedebilirsiniz. Buna ek olarak, ayrışmış kültürlerin kullanılması mühendislik-ağları tasarım possibile yapar. Bu şekilde anlamak kolaydır kaydedilen elektrofizyolojik aktivite arasındaki fonksiyonel ilişkiler ve hücre yoğunluğu 3, modülerlik 4,5 derecesi, heterojen nöronal pop varlığı gibi ağ organizasyonu parametrelerivb ulations 6 Ancak, ayrışmış kültürlenmiş hücreler üzerindeki in vitro çalışmalar, 2D nöronal ağlar dayanmaktadır. Her yönde 7 yayılmış düzleştirilmiş olan 2 boyutlu modeli, somata ve büyüme konilerinin (i) ve akson-dentritler büyümesinin: Bu yaklaşım, in vivo (doğal olarak 3 boyutlu, 3D) sisteme göre basitleştirmeler yol açar. (ii) 2D in vitro ağlar sergi ağının 8 nöronların çoğu içeren aktivitesini patlama hakim elektrofizyolojik dinamikleri kalıplaşmış.
Son zamanlarda, farklı çözüm 3D nöronal ağlar ayrışmış in vitro yapımına izin vermek için geliştirilmiştir. Ortak fikir, nöronlar 3D moda yetişebilen bir iskele oluştururken oluşur. Bu tür bir yapı iskelesi polimer jeller ve katı gözenekli matrisler 9-13 ile gerçekleştirilebilir. Polimerlerin mekanik özelliklerini istismar ederek, bu thes içinde hücrelerin gömmek mümkünneurospheres 11 3D kültürleri üniform bir blok tanımlayarak e yapıları. Bu yaklaşımın temel özelliği neurospheres 9,12 katı mekanik özelliğidir. Ancak, bu malzemelerin gözeneklilik sınırlı ve onlar matrisi içinde hücre göçü garanti etmemektedir. Bu dezavantajı aşmak için, olası bir çözüm 'birim' modülleri matrisi dilimleme ibarettir. Ne yazık ki, parçacıkların büyüklüğü ve şekli çeşitliliği düzenli katmanlı yapılara ambalaj engel olabilir. 7'de, Cullen ve arkadaşları, biyoaktif bir hücre dışı matris bazlı iskele içinde nöronlar ve / veya astrositlerin oluşan bir 3D nöronal yapı olarak tasarlanmıştır. Böyle bir mühendislik nöral doku 3D mikro-ortamlar içinde nörobiyolojik yanıtları incelemek ve işlemek için in vitro araştırmalarda izin verdi. Bu model ekstrasellüler matriks (ECM) ve / veya hidrojel iskeleleri (500-600 mikron kalınlığında) boyunca dağıtılan nöron ve glia oluşuyordu. Bu co/ mm3 5000 hücreleri - ndition, optimum hücre canlılığı (% 90'dan fazla) 3.750 nihai yoğunlukta hücreler kaplanarak bulunmuştur. Böyle bir yoğunluk değeri fare beyin korteks hücre yoğunluğu yaklaşık 90,000 hücre / mm3 14, in vivo bir durumda bir, çok daha düşük olduğunu belirtmek gerekir. Bu sınırlama Pautot üstesinden gelmek ve 15 hücre yoğunluğu ve ağ bağlantı ağının gerçek zamanlı görüntüleme sağlarken in vivo koşullarında benzer şekilde kontrol edilmektedir 3B, in vitro bir sistem hayata coworkers için. Pratikte, bu yöntem kültürlü nöronlar silis mikro büyümeye edebiliyoruz ayrışmış kavramına dayanmaktadır. Bu boncuklar uyması nöronal hücre gövdeleri ve olgun büyümek uzatmak ve diğer nöronlara sinaptik kişileri tanımlamak için kendi arborizations için yeterince büyük bir büyüme yüzey sağlar. Bu yöntem, fo mono-disperse boncuk kendiliğinden düzeneği özelliklerini kullananrm 3D farklı boncuklar üzerinde nöronlar arasındaki kısıtlı bağlantısı ile farklı katmanlarda nöronların farklı alt kümelerini içeren altıgen diziler katmanlı. Bu yöntemle elde edilen hücre yoğunluğu / mm3 yaklaşık 75,000 hücre idi.
Son zamanlarda, biz ÇÇA'lar 16 Pautot yöntemi adapte olması: Elde edilen sonuçlar 3D elektrofizyolojik aktivite 2D ağlar tarafından ifade olandan faaliyetlerinin geniş bir repertuara sunan olduğunu göstermektedir. 3D olgun kültürler gelişmiş bir dinamik sergiler hangi ağ patlaması ve rastgele başak aktivite bir arada hem. Benzer şekilde, Tang ve arkadaşları, 17 Schomer birkaç ay in vitro primer kortikal kültür muhafaza eden bir ipek proteini bazlı gozeneklı iskeleyi fark ve tungsten elektrot ile elektrofizyolojik aktivite göstermiştir.
Bu çalışmada, deneysel prosedürleri ÇÇA bağlanmış 3D nöron ağları kurmak için tarif edilecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel protokol DL 116/1992 uyarınca ve Genova (Prot Üniversitesi kurallar tarafından İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından Avrupa Hayvan Bakım Mevzuatı (2010/63 / EU), tarafından kabul edildi. N. 13130, Mayıs 2011). Tüm çabalar proje için hayvanların sayısını azaltmak ve onların acılarını en aza indirmek için yapılmıştır.
Malzeme ve Destekler 1. Hazırlık
- CNC (Computer Numerical Control) freze makinesi vasıtasıyla PDMS (Poly-Dimetil-Siloxane) kısıtlama oluşturmak için kalıp Construct. Bu tür bir kalıp politetrafloroetilen merkezi silindir (PTFE), polikarbonat gerçekleştirilmektedir. PDMS sertleştikten sonra bu malzeme maske daha kolay bir çıkarma verir.
NOT: kalıp tasarımı Bilgisayar Destekli-Tasarım (CAD) tarafından gerçekleştirilen ve daha sonra CNC Freze makinesine teslim edilmiştir. - PDMS elastomer hazırlayın. PDMS bir organik polimerdir. Bu iki eleman oluşmaktadır, Bir kürleme maddesi ve bir polimer içerir. 1:10 hacim oranında karıştırın, sertleştirici madde bir kısmı ve polimerin dokuz kısım. Bir Petri kabındaki iki bileşen koymak sallamak ve hava kabarcıklarını yok etmek için 10 dakika süreyle vakum odasında karışımı yerleştirin. PDMS 3 g bir kısıtlama için yeterlidir.
- PDMS kısıtlamayı Construct. Kalıpçı içine PDMS malzemeyi yerleştirin ve 120 ° C'de 30 dakika süreyle fırına koyun. PDMS kısıtlama, sırasıyla 22,0 ve 3,0 mm'lik bir dış ve iç çapa ve 650 mm yüksekliğe sahip ideal bir silindir şekline sahiptir.
- Kaplama bir gün önce, çiftin bir stereo mikroskop altında bir cımbız yardımıyla Mikro Elektrot Diziler (ÇÇA) aktif alana maske ve 120 ° C'de fırında PDMS maskesi sterilize edin.
- Konik bir cam şişede 2 saat boyunca% 70 etanol içinde ve EV döndürme (42,3 ± 1,1 um onaylı ortalama çapı 40 ± 2 um nominal çap), cam mikro-boncuklar sterilizeery 30 dakika tüm mikroboncukları ortaya çıkarmak.
- Tüpten etanol çözüm çıkarın ve mikroboncukları steril su ile iki kez yıkayın.
- 0,05 ug / ml poli-D-Lisin, Laminin karışık çözeltisi 24 ul (çap 3.0 mm eşittir) PDMS maske tarafından sınırlanan MEA alanının orta kısmını hale getirin.
- Coat 0,05 ug / ml'de yapışma proteinleri, önceden laminin ve poli-D-lisin ile mikro-mi ve stabil ve uzun süreli bir nöronal ağ elde etmek için, 37 ° C 'de gece boyunca inkübatör içinde bırakın.
- MEA cam yüzeyinden ve cam mikro hem yapışma faktörleri çıkarın. Aspire bir pipet ile kaplama çözeltisinin yaklaşık olarak% 95 ve MEA yüzeyi üzerinde, steril su, küçük bir hacimlerinde 24μl- uygulanır. Aspire yine 95'den fazla su ve% hücreleri kaplama önce 1 saat boyunca laminer kaputun altında MEA kurumaya bırakın.
Not: yerine mikro-boncuk halinde, kaplama aspireçözüm ve nöronlar kaplama olacak cam yüzeyi kondisyon için, sterilize su ve bazal orta ve B27 olarak ek ikinci bir biriyle ilk yıkama yapın. Mikro-kuru izin vermeyin. Şişe içine kültür ortamı içinde süspansiyon halinde bırak. - Bunlar tek biçimli bir tabakasını oluşturan kendi kendini monte edecek ve membran deliğinden (gözenek çapı 0,4 um) olan, çok oyuklu bir plaka üzerine bir pipet -200 μl-, tedavi edilen mikro-boncuk süspansiyonu (yaklaşık 32000) aracılığıyla, dağıtın.
- Orta 0.5 ml membran Her çukurun doldurun ve inkübatör koydum (T = 37.0 o C, CO 2 =% 5) nöronlar (3.2) kaplama için hazır olana kadar.
2. Embriyolar diseksiyonu ve Doku Ayrılma
- Normal bir ışık-karanlık program dahilinde sabit bir sıcaklıkta (22 ± 1 ° C) ve nem (% 50) Ev yetişkin dişi sıçanlar (200-250 g) (ışık-07:00-7 pm) 'dehayvan tesisi. Bu yiyecek sağlanması ve su serbestçe kullanılabilir.
- % 3 izofluran kullanarak geliştirme 18 gün (E18) sonra hamile kadın sıçan anestezisi. Ardından, servikal dislokasyon ile hayvan kurban.
- Her sıçan embriyo hippocampi çıkarın ve Ca 2+ ve Mg olmadan buz Hank dengeli tuz çözeltisi 2+ içine koyun. Günde gelişim hipokampus ve korteks dokuları 18 Çok yumuşak ve küçük parçalar halinde kesmek için gerek yoktur. Daha fazla detay 18,19 bulunabilir.
- 37 ° C'de 18-20 dakika boyunca DNAz% 0.05 ihtiva eden tripsin / Hank çözeltisi 0.125% olarak doku ayırmak.
- Pasteur pipeti ile süpernatan çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile orta eklenerek enzimatik sindirim durdurun.
- FBS ile Ortamı çıkarın ve eki,% 1 L-glutamin, gentamisin 10 ug / ml ortam maddesi ile bir kez yıkanır. Pasteur pip ile tekrar orta kaldırmakette eki,% 1 L-glutamin, gentamisin 10 ug / ml ile bir yetiştirme ortamı küçük bir miktarı (500 ul) ile yeniden dolum ve.
- Hücre süt rengi süspansiyon görünceye kadar dar bir Pasteur pipeti ile mekanik olarak doku topağı ayrıştırmaları. Bu hücre süspansiyonu santrifüj gerekli değildir.
- 2,0 ml'lik bir son hacim elde etmek için büyüme ortamı hücre süspansiyonuna küçük hacimli seyreltilir. Bir hemositometre odası ile elde edilen hücresel konsantrasyon güvenin. / Ml 600-700 hücreleri istenen hücre konsantrasyonunu elde etmek üzere 5: 1 ile, bu konsantrasyon seyreltilir.
3. Hücre Kaplama
- PDMS kısıtlaması ile tanımlanır MEA aktif alan üzerine yaklaşık 2000 hücre / mm2 yoğunluğunda plakası hücreleri, 2B nöronal ağ oluşturmak için.
NOT: Her hipokampus yaklaşık 5 x 10 5 hücreler içeren, (tek bir embriyo için 1 x 10 6). 6 x 10 toplam miktar almak için 6 embriyolar teşrih6 2 ml hücre ve / ml 3000 hücre tahmini konsantrasyonu. İstenilen hücre konsantrasyonunu elde etmek ve yaklaşık 600-700 hücre / ul plaka için 5: 1 bu konsantrasyon sulandırmak. PDMS kısıtlaması tarafından sınırlanan MEA alanı yaklaşık 7,065 mm 2 ve kaplama toplam hücre sayısı ise 600 hücre / ml x 24 ul = 14.400 hücre / mm 2 '2038 hücrelerin nihai yoğunluğu. - 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO2 atmosferi (% 5) ile inkübatör içine MEA cihazları yerleştirin.
- Üç boyutlu kültür yapımı için ön hazırlık aşamasını tamamlamak için yuvalı plakalarda içine yerleştirilen mikro-mono-katman yüzeyi üzerine / ml 600-700 hücreleri (yaklaşık 100,000 hücre) hücre konsantrasyonuna sahip süspansiyon 160 ul dağıtın. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO2 atmosferi (% 5) ile, çok kuyucuklu bir inkübatör plakaları koyun.
4. 3D Nöronal Şebeke İnşaatı
- 6-8 saat sonra kaplama, yaklaşık 30-40 ul'lik bir hacim için ayarlanmış bir pipet kullanılarak PDMS kısıtlaması tarafından sınırlanan bölgenin içine tamamen çok dikkatli bir şekilde, çok oyuklu plakalar ile süspansiyonu (nöronlar ile mikro-) aktarın. Her aktarımdan sonra, bir altıgen kompakt yapıda kendine monte mikroboncukları izin, yaklaşık yarım dakika bekleyin.
- Tüm katmanlar yatırılır ve kendiliğinden monte edildikten sonra, ortam yaklaşık 300 ul PDMS kısıtlaması tarafından sınırlanan alanın üst büyük bir düşüş ile doldurun.
- Inkübatör (T = 37,0 o C, CO 2 =% 5) MEA bağlanmış 3 boyutlu yapının koyun 48 saat için takviyesi ile büyüme ortamı kültürünün bir son hacim (yaklaşık 1 mi) ilave edilmeden önce.
NOT: Membran parçası (30.000) ve MEA cihazı (6000) üzerine tek bir tabaka üzerinde tanelerin sayısı ile yuvalı plakalarda boncuk sayısı göz önünde bulundurun. Elde edilen 3D yapı mi 5 tabakadan oluşurcrobeads ve hücreler. 3D nöronal ağ geometrik mükemmel olmadığı dikkate alındığında, ortaya çıkan 3D yapı 5-8 tabakadan oluşur olabilir. - Günlük kuluçkadan sonra dikkatli bir şekilde MEA halka içinde ortam (yaklaşık 900 ul) son hacim ekleyin. 4-5 hafta boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO2 atmosferi (5%) 3D kültürleri koruyun. Haftada bir kez orta yarısı değiştirin.
5. Konfokal Mikroskopi Toplama
- Bir tutucu içinde mikroskop sahneye biyolojik örnekler sabitleyin. Doğru bant emisyon filtresi ve sırayla yakalamak için her resim için PMT imajı, kazanç ve ofset (-0.3%) elde etmek için hangi lazer (Argon, 496-555 nm), tarama hızı (400 Hz) olarak ayarlayın doymasını önlemek için ve sinyal gürültü oranını geliştirmek için. Sonuçlar Bölüm Şekil 4 görüntüler elde etmek için kullanılan değerler bildirir.
- Z -stack dizisi, köknar edinimi içinst, üst ve numunenin alt tabakanın z pozisyonuna değerini seçin ve sonra satın alma yapmak için adım boyutunu seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. Bu deneysel prosedürde, ilgili bir rol 3D nöronal ağın büyüme için mekanik iskele tanımlayan mikro-oynanır Şekil 1A ve B Ekran mikro-boncuk düzenlemesi (40 ± 2 um nominal çap diyagramlarıdır; sertifikalı ortalama çapı düzlemde 42.3 ± 1.1 mikron). Bu tür yapıların özelliği mikroboncukları kendiliğinden kompakt altıgen geometri (Şekil 1B ve C) tanımlayan kendine monte olmasıdır. Böylece oluşturulan iskele nörit ve hücre gövdeleri metabolik değişimi için yeterince büyük bir ara boşluk için istikrarlı büyüme yüzeyi garanti eder. Bu microbead boyut interstisyel aralık ve son nöronal yoğunluğu için makul bir uzlaşma olduğunu kanıtlamaktadır. PDMS yapısı "ideal" bir silindir yeniden ve kompakt yapısı altıgen etki faktörü (HPF) itibaren 40 boncuk sayısı (çap, 0.74 eşit olduğu göz önüne alındığında81; PDMS kısıtlaması bulunan m) yaklaşık 100,000 arasında, her bir katman yaklaşık 6000 mikro-tekabül eden bir. Protokol Bölüm açıklandığı üzere, bu mikroboncuklar öncesi klimalı yapışma faktörleri (yani, laminin ve Poly-D-Lizin) ile vardır. Bu prosedür, nöronlar mikro-bağlı olduğunu garanti eder. Şekil 1D, üç nöron 40 um'lik bir çapa sahip bir mikroboncuk birleştirilmiştir bir örneği göstermektedir.
Nöronal ağ için iskelesi oluşturmak için kullanılan mikro 1. Görüntüleri Şekil. (A, B) membran parçası ile çok oyuklu bir plaka yüzeyi üzerinde mikro-tek katmanlı iki örneği. (C), mikro-boncuklar çekim kuvveti altında yerleşmiş ve kendiliğinden 2D altıgen diziler içine yerleştirilebilir. Birinci tabaka, tam diğer boncukları ilave edilir paketlendi kez inşaAynı altıgen simetriye sahip ikinci bir sipariş katmanı ing. Mikro-Ayrıntılı ilaveli dolu bir 3D tertibatının yapımında sonuçlandı. Mikro arasındaki boş alan nöronal süreçleri ve hücre organları tarafından doldurulur. (D) Üç nöronlar önceden yapışma faktörleri (Laminin ve Poly-D-Lizin) ile klimalı, tek bir mikroboncuk yüzeyinde demirlemiş. Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.
Bir MEA aktif alana sahip mikro-ve nöron arabirim Şekil 2A ve B de gösterilen kalıp ile gerçekleştirilen bir elastomerik kısıtlaması (Şekil 2C), kaynaklanmaktadır. Şekil 2A, düzeni ve seçilen boyutları gösterilmektedir. MEA aktif alan (Şekil 2B MEA substrata Şekil 2C PDMS yapısı birleştirilmesi ile sınırlandırılır). Bu şekilde, nöronlar MEA aktif elektrot alanına uymak için zorlanır. Daha sonra, yapışkan nöronlarla cam mikro yığınlar, bu birinci tabakanın üzerine yerleştirilir edilecektir. Şekil 2B PDMS yapısının rolü net bir şekilde görülmektedir son yapılandırma, bir enine kesitini göstermektedir. PDMS yapı ile sınırlanmış alan mikro boncuklar ve nöron karışımı (Şekil 2B alt panelinde beyaz toz) içerir. Iç ve dış çapı ve 22.0 3,0 mm çaplı ve 650 um yüksekliği: PDMS yapısı aşağıdaki boyutlara sahip Şekil 2B'de gösterilen kalıp inşa edilmiş bir silindir şekline sahiptir. Kalıp, her kullanımdan sonra PDMS azalma yapışkan özellikleri beri, ideal bir pürüzsüz ve dayanıklı bir malzeme mask.The PDMS kısıtlamaları daha kısa bir ömür boyu görüntüler elastomerik çıkarılmasını kolaylaştırmak için yapmak polikarbonat ve PTFE kullanılarak inşa edilmiştir. Tipik Her bir PDMS yapısı başarılı bir şekilde üç kez kullanılabilir.
Şekil 3D nöronal ağ oluşturmak için 2. Malzemeler. Fiziksel kısıtlama oluşturmak için kullanılan kalıp (A) Tasarım ve (B) görüntü. Gri 3 mm çaplı silindir (C) 'de gösterilen kısıtlama. (C) PDMS kısıtlama bir Micro-Elektrot Array (MEA) aktif alana yerleştirilen deliğine tekabül eder. Bu tür fiziksel bir engel kullanılması hedef alanı içinde, mikro-boncuklar içeren (yaklaşık 7 mm2) ve 3 boyutlu bir ağ gelişimini sınırlamak için izin verir. (D) MEA sistemi ve kısıtlama kesit görüntüsü. (Sağ üst köşedeki mikroskop tarafından tasvir) mikroboncuk PDMS kısıtlaması (alt panel) tarafından sınırlanan uzaya doldurulur.080fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3'ün panellerinde gösterildiği gibi PDMS maske aracılığıyla MEA aktif alanının sınırlandırılması sonra, protokol nöronlar ve mikro-boncuk düzeneği gerçekleştirmek için ana adımları tarif devam eder.
İlk adım, ön kaplama, daha önce yapışma moleküllerinin önceden laminin ve poli-D-Lisin (Şekil 3A) ile önceden kaplandı MEA yüzeyi üzerine nöronların ayrışmış oluşur. 2D nöronal ağ MEA aktif alana doğrudan bağlıdır esastır: sadece bu koşullar altında, elektrofizyolojik sinyalleri (örneğin, ani ve patlama) kaydı mümkündür. Protokolün bu birinci bölüm 2D nöronlar plaka için kullanılan standart bir prosedür karşılık gelir. 3B sistemin gerçek inşaat Şekil 3B, C ve D'de gösterilmiştir (Şekil 3B) ile, çok kuyucuklu bir tabak içine konumlandırılır; Daha sonra, / | il 600-700 hücreleri (yaklaşık 100,000 hücre) hücre konsantrasyonu olan bir 160 ul süspansiyon mikro-mono-katman (Şekil 3C) üzerinde dağıtılır. Hücreler boncuk alanının yarısını işgal olduğunu göz önüne alındığında, toplam serbest yüzey 75 mm 2 'dir. Mikroboncuklarının tek tabakalı hücre yoğunluğu / mm2 yaklaşık 1.500 hücreleri. Membran girişi ile kullanılan çok çukurlu tablalar 33,6 mm 2 bir yüzeye sahip gözenekli bir membran sunmaktadır. Gözenekli membran yüzeyi ve 40 um (tane çapı) içindeki bir yüksekliğine eşit bir taban alanına sahip sanal silindir şeklinde göz önüne alınarak, 30.000 mikroboncuk oluşan tek biçimli tabakası membran girişi ile, çok kuyucuklu bir plakalara bağlanmıştır. Mikroboncuk ve nöronların böylece gerçekleştirilen süspansiyon zar parçası ile multiwell plakalar içinde yaklaşık 6-8 saat kalır. bir Zamanlartamamlandıktan Anılan adımlar 3D ağı inşaatı başlayabilirsiniz. Şu anda, nöronlar ve mikro-karışımı membran inserti ile yuvalı plakalarda çıkarılır ve daha önce PDMS kısıtlaması (Şekil 3D) tarafından belirlenen alana üzerine kaplama 2D nöronal ağ üzerine yerleştirilir. Bu işlem sırasında, nöronların yaklaşık% 20-30 arasında bir kayıp meydana gelir: (i) mekanik manipülasyonlar ile bağlı (ii) zarın dış transferi. Elde edilen 3D kısıtlaması (7.06 mm 2) ve 178,56 um (boncuklar 5 kat) bir yükseklikte taban alanı göz önünde bulundurarak, ve boncuk 5 katlar tarafından oluşturulan doğru silindirin hacmi ile hücrelerin sayısını bölerek nöronal ağ hücre yoğunluğu / aa 3 yaklaşık 80.000 hücredir.
Temel adımların Şekil 3. Sketch 2D ve 3D nöron ağları oluşturmak için. (A) Kaplama oBir MEA aktif alanda f nöronlar. Nöronların süspansiyon önce yapışma faktörleri ile klimalı ve PDMS kısıtlama ile sınırlanmış, MEA yüzeyine kaplanır. Bu adım gerçekleştirmek için izin verir: i) MEA bağlanmış bir klasik 2D nöronal ağ; ii) elektrofizyolojik aktivite kaydedilecektir olan 3D ağının birinci tabaka. (B), mikro-boncuklar ve (C) nöronları 6-8 saat sonra membran girişi ile, çok kuyucuklu bir levha yüzeyine dağıtılır. (D) süspansiyonu nöronlar ve mikro-2B ağ, zar parçası ile yuvalı plakalarda taşınır. Bu aşamanın tekrar birkaç kez. Yoğun bir çok-katmanlı 3D yapısını tanımlamak için 3 boyutlu yapısı tamamlandığında, orta damla ilave edildi (E) sağlar ve elde edilen yapı, 48 saat boyunca kuluçka makinesi içinde depolanır. (F ) 48 saat sonra, 3D kültür tamamen ortamının son hacmi ile doldurulur.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Birinci tabaka konumlandırıldıktan sonra, aynı işlem, paketlenmiş 3D topluluğu elde etmek üzere tekrar edilir. Elde edilen 3D yapısının kendisi kompakt bir yapıda öz-montaj mikro-ve nöronlar (Şekil 4), yaklaşık 5-8 katmandan yapılan kolloidal kristal oluşturan yeniden yapılandırmaktadır. Tüm katmanlar oluşturulduktan sonra, 3B ağ ortamında 300 ul (Şekil 3E) bir damla doldurulmuş olmalıdır. Bu aşamada, ÇÇA birleştirilmiş 3D ağlar 48 saat inkübatörde saklanabilir. Bundan sonra, ortam 1 ml MEA (Şekil 3F) arasında halka dolgu ilave edilir.
Tüm tabakalar monte edildikten sonra, nevritler / mm3 yaklaşık 80,000 hücrelik nihai hücre yoğunluğu ulaşan microbead yapı iskelesi uzerine büyür. Bu Notik değerElde edilen değer 92.000 hücre / mm 3, fare beyin korteksinde 14 ortalama nöronal yoğunluktan uzak olmadığını ing.
Şekil 4, dik konfokal mikroskobu ile çekilen ÇÇA bağlanmış 3D ağların üç örnek. Şekil 4A içinde DIC (diferansiyel-interferans-kontrast) görüntü MEA yüzeyine bağlanmış boncuklar tek tabakasını göstermektedir; mikroskop 20.0 NA 0.50 su amacı ile birleştirildi ve görüntüleri Bulaşan PMT mikroskop ve Lazer Argon (488nm) dahil ile elde edilmiştir. Resimler çok net bir şekilde elektrotların mekansal düzenini (siyah noktalar) ve mikro düzenli mekansal organizasyonu gösterir.
Şekil 4B, Harita-2 (kırmızı sinyal) bir immünofloresan boyama doğrudan ME elektrot düzlemine bağlanmış mikro çevresinde nöronların dendritik arborizations dağılımını ve somata görüntülerA (siyah temas varlığı gözlenebilir). Şekil 4B, adım büyüklüğü ile z yığın dizisi (108 um) bir maksimum projeksiyon olan 1.53 um kadardır. Görüntüler 40.0 NA 0.80 su amacı ile elde edildi; uyarma Argon Lazer (488 nm), emisyon bant genişliği 496nm-655nm olduğunu.
Son olarak, Şekil 4C 3D hipokampal kültürünün z -stack dizisi (187,79 um) maksimum projeksiyon görüntüler (adım büyüklüğü 2.27 mikron). Z -stack dizisi 25.0 NA 0.95 su amacı ile satın alınmıştır. Yeşil kanal, bir argon lazer 488nm ve emisyon filtresi bant genişliği 499nm-551nm kullanıldı. Kırmızı kanal için, 543 nm lazer ve bir emisyon filtresi bant genişliği 555nm-645nm kullanıldı. Kanallar dizi modunda elde edildi. Neun için etiketlenmiş nöronlar (kırmızı sinyal) olgun post-mitotik nöronlarda ve Gaba (yeşil sinyali için ifade nereye şiddetle birbirine ağ yel ortaya) birleştirmede düşük. Gaba antikor inhibitör nöronlar için hem somata ve neurites bir pozitiflik saptandı.
Şekil 4. konfokal mikroskobu ile yakalanan 3 boyutlu ağların üç örnek. MEA yüzeyine bağlanmış boncuklar tek tabakasını gösteren, (A) DIC (diferansiyel-interferans-kontrast) görüntü; elektrotlar (siyah noktalar) mekansal düzenini Haritası-2 (kırmızı sinyal) (B) İmmünfloresan boyama. gözlemlenebilir dendritik arborizations dağılımını doğrudan MEA elektrot düzlemine bağlanmış mikro çevresinde nöronların somata görüntüler. ( C) nöronlar neun için etiketli son derece birbirine ağı gösteren bir 3D kültürünün z -stack dizisi (187,79 um) maksimum projeksiyon, yeşil sinyal (kırmızı sinyal (olgun post-mitotik nöronlar) ve Gaba için ifade birleştirme sarı ). Gaba antikor revsomata ve neurites hem inhibitör nöronlar için bir pozitiflik ealed. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3D yapının varlığı ağ dinamiklerini modüle olmadığını anlamak için, bu yüzden üretilen elektrofizyolojik aktivite referans modeli temsil eden ÇÇA üzerinde yetiştirilen geleneksel 2D nöron ağları, karşılaştırılmıştır.
3D (sol sütun) ve 2D (sağ sütun) hipokampal kültürler tarafından sergilenen ağ dinamikleri arasındaki Şekil 5. karşılaştırılması her zaman ölçeğinde (A: 1200 sn, B: 300 sn; C: 60 saniye; D: 10 sn)., 3D meclisleri faaliyet imzaları çeşitli görüntüler (yani, kısa ve uzun ağ patlamaları, rastgele bir spike2B olanlar sadece yüksek senkronize patlamaları ile daha belirgin kalıplaşmış faaliyet göstermek ise etkinlik, senkronize patlamaları). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5 in vitro dördüncü haftasında bir 3D (sol panel) ve 2D (sağ paneller) hipokampal kültürü üzerinde yapılan iki temsilci deneyler iki raster grafiklerini göstermektedir. Bu araziler tüm aktif elektrotlar üzerinde kayıtlı ağın elektriksel aktivitesini gösteren (yani., Bir ateşleme oranı 0,1'in sivri / s ile elektrotlar).
2B ağların dinamikleri esas ağ patlamaları oluşan bir yarı-senkron aktivite gösterirler. Bu dinamiğin imzası neredeyse hiçbir etkinlik kaydedildiği döneme göre serpiştirilmiş kayıt kanallarının çoğu dahil senkronize olayların varlığıdır (sağ paneli bakınŞekil 5D). Bu davranış, büyütme alt çizgi farklı seviyeleri, farklı zaman ölçeklerinde takdir edilebilir.
3B ağ durumunda, ağ dinamikleri imzası ile karakterize edilen faaliyetleri geniş bir repertuar oluşur: (i) daha az küresel eşzamanlı, (ii) rastgele spike aktivitesi, (iii) süreler için, alt-ağlar (yani, , mikroelektrot bir alt kümesi), ağ patlamaları ortaya çıkması ile daha uyumlu faaliyetler göstermişlerdir. 2B ağlarda gözlenen benzer bir süresi ağ patlamaları varlığı var, ama daha uzun ağ patlamaları da vardır: Ayrıca, ağ patlamaları süresi daha fazla değişken olarak iyi. Böyle bir yöntem kullanılarak elde edilen ortaya çıkan 3D dinamiklerinin tam ve kantitatif karakterizasyonu 16 bulunabilir. Beklendiği gibi, aynı zamanda 3D nöronal ağ sergiler önemli 'rastgele spike' ve olmayan eşzamanlı patlama activity. Bu 3D yapılar tarafından üretilen dinamiklerin olasılık gibi bazı kontrol deneyleri (örneğin, bir çıplak MEA ile mikro üzerine monte çıplak mikro ve 3D ağların yığını olan bir MEA bağlanmış bir 2B ağının varlığı) ile yalıtımına edilmiştir 16 bildirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, 3D oluşan in vitro platformda yeni bir deneysel ağ elektrofizyoloji için ÇÇA sunulmuştur bağlanmış nöronal kültürleri mühendislik. Z -Axis boyunca nöritik büyümesine izin iskele olarak mikro kullanımı düzlemsel MEA ile entegre edilmek üzere özel olmuştur. Bu şekilde, geçerli ve güvenilir bir in vitro 3D model elde mikro sistem sonuçları ortaya çıkan elektrofizyolojik dinamiklerini 16 incelemek için.
MEA kayıt set-up
MEA cihazları elektro-aktif dokulardan hücre dışı sinyalleri ölçebilen substrat gömülü mikro elektrotlar entegre dizi ile bir kültür odasının oluşur. Tipik kaydedilen sinyalleri (örneğin, tek üstü eşik gerilimi bir veya daha fazla nöronların elektriksel aktivitesini gösteren varyasyon) ve patlamaları (yani, son derece dolu başak dizisi genellikle occurrin ani oluşurAynı anda birkaç kanal g). MEA-tabanlı sistemlerle nöronal ağlar faaliyet kayıtları veri (örneğin, 60 kanal MEA ile 4 saat deneyi yaklaşık 15 GB kaydını üretir) büyük miktarda üretir. Bu süreç ve özellikle uzun kayıtları gerektiren çalışmaların durumunda, verileri analiz etmek için etkili araçlar için gerektiği anlamına gelmektedir. Genel olarak, elektrofizyolojik sinyallerin kaydı nöronal kültürler ile doğrudan bir hücre dışı iletimi ve bir voltaj sinyalinin elde elde edilir. Bir amplifikasyon ve filtreleme aşamasından sonra, sinyaller, 10-50 kHz örneklenmiş ve depolanır. Ham sinyaller daha sonra tepe algılanan özel geliştirilen yazılım aracı tarafından bulunmaktadır. Kayıt sistemi (1) MEA amplifikatör oluşuyordu (2) A / D toplama kartı, (3) kayıt yazılımı, (d) ısıtma sistemi ve sıcaklık kontrolörü ile donatılmış kişisel bilgisayar buharlaşma önleyici (4) CO2 atmosferi sürdürmek ve sistemleri.
3D nöronal ağ yapı iki kritik adımlar geçer: Birincisi membran ekleme yüzeyi ile multiwell plakalar üzerinde boncuk doğru miktarda dağıtım, diğeri multiwell gelen yapışık nöronlar ile mikroboncuk süspansiyon transferi zar parçası ile plakaları: (i) 2 boyutlu nöronal ağ MEA (birinci tabaka) aktif alanı üzerine kaplama; (ii) zaten yerleşmiş katmanları. Bu işlem, gerekli katmanların sayısı kadar çok kez tekrarlanmalıdır. Kültürün ilk haftasında, nevrotik uzantıları hızlı bir büyüme farklı katmanlarda ait mikro çevresinde yer alır. Nöronlar ve mikro arasındaki yakın bağlantı, biyolojik örnekler stabilize ve / değiştirmek için orta yerine ve zarar endişesi olmadan MEA amplifikatörü ile elektriksel aktivite kayıt için inkübatör onu hareket etmesine izin.
Tüm Filenin elektrofizyolojik faaliyeti yanaçalışmaları sadece (yani doğrudan MEA bağlanmış bir), aktif alan geleneksel 2D ağı ile kaplı olmalıdır alt tabakadan kaydedilir. Diğer katmanları 2D biri üzerinde adım adım eklenecektir ve uzun menzilli bağlantıları katmanları arasında yayılacak. Pratikte, diğer katmanlar nöronlar ve mikro karışımını deposing tarafından 6-8 saat sonra 2D birden eklenir. Bu zamansal pencere seçim 2B tabakasında sinaptik bağlantıların oluşumu için sağlar ve çok üst katmanlara bağlantıları kurmak için imkanı sağlamaktadır.
Iki faktör membran ile yuvalı plakalarda kullanımı 3D ağları gerçekleştirilmesi için gerekli ekleme yapmak: (i) nöronları ve mikro-mevcut olan farklı çöktürme hızları, çünkü membran girişi ile, çok kuyucuklu bir levha kullanılması mikro boncuklar üzerine nöronların muntazam bir dağıtımını garanti altına : ortalama her microbead nöronların aynı sayıda çevrili olabilir. (ii) By membran ekleme ile multiwell plakaların elastik özelliklerini istismar, nöronlar bağlanmış mikro çözümü geri yıkama polikarbonat çoklu kuyular gibi katı yüzeyler kullanmaktan daha kolaydır.
Sunulan iş Pautot tarafından önerilen yaklaşım takip eder ve 15 coworkers: Bu çalışmada silis boncuk kullanımı uymak nöronal hücre gövdeleri için yeterince büyük ve süreçleri büyümek için, olgun öncesi ve post-sinaptik uzmanlık üreten bir büyüme yüzeyi temin . Boncuklar, skafoldun kullanım için geçerli bir alternatif hidrojeller matrisleri veya biyoaktif ve çitosan biyopolimeri gibi doğal oluşan biyo-bozunabilir taneler gelir. Kitin ve deasetile türevleri, kitosan, toksik olmayan bir anti-bakteriyel, biyouyumlu ve biyobozunur biyopolimerler bulunmaktadır. Bu tür biyolojik parçalanma işlemi zaman sabiti 20,21 büyümesinde ağ ile uyumludur.
Bu çalışma, bir referans teşkil edebilir worsistematik ağ dinamikleri ve yapısı arasındaki etkileşimi incelemek için gelişmiş 3D nöronal model sistemler gelecekteki gelişimi için k. Kısa sürede, biz cihazların 22 yeni nesil 3D ağ yapısını aktarabilmek umuyoruz. Imalat tekniği 50 ile 350 um arasında değişken yüksekliklere mikro sütunlar şeklinde elektrotlar imal etmekle ilgilidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar lohusalık yapısı ve dott gelişmekte teknik destek Giorgio Carlini teşekkür ederiz. Yazının kapsamlı revizyon için Ornella LoBrutto. Bu sonuçlara önde gelen araştırma Avrupa Birliği'nin 7. Çerçeve Programı'ndan fon aldı (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET Genç Kaşifler düzeni) hibe anlaşması 284.772 BEYİN BOW altında (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).
