Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Gränssnitt 3D Engineered neuronala kulturer Micro-Elektrod arrayer: Ett innovativt Published: October 18, 2015 doi: 10.3791/53080
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 1
1Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering (DIBRIS), University of Genova, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Department of Cognitive Neuroscience, Radboud University Medical Center, 3Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia (IIT)

Introduction

In vitro tvådimensionella (2D) neurala nätverk kopplade till Micro-Elektrod matriser (MEA) arethe guldstandard experimentell modell som antagits för att studera samspelet mellan neuronala dynamik och den underliggande anslutningsmöjligheter. Under utvecklingen, neuroner åter komplexa nätverk som visar väl definedspatio-temporalpatternsof aktivitet 1,2 (dvs, skurar, nätverk skurar, slumpmässig tillsatta aktivitet). MEA registrera elektrofysiologiska aktivitet från många platser (från tiotals till tusentals mikroelektroder), vilket gör att en detaljerad undersökning av de uttryckta dynamiken på nätverksnivå. Dessutom gör possibile att konstruera manipulerade-nätverk användning av dissocierade kulturer. Det är lättare att förstå på detta sätt de funktionella sambanden mellan den inspelade elektrofysiologiska aktivitet och parametrarna för nätverksorganisationen som celldensitet 3, grad av modularitet 4,5, förekomst av heterogena neuronal populations 6, etc. Men alla in vitro-studier på dissocierade odlade celler baserade på 2D neuronala nätverk. Detta tillvägagångssätt leder till förenklingar med avseende på den (i sig tre-dimensionell, 3D) systemet in vivo: (I) i en 2D-modell, somata och tillväxtkoner är tillplattade och axoner-Dendrites utväxt inte kan spridas i alla riktningar 7. (ii) 2D in vitro nätverk uppvisar stereotypa elektrodynamik domineras av spräng verksamhet som omfattar de flesta av nervceller i nätverket 8.

Nyligen har olika lösningar har utvecklats för att möjliggöra byggandet av in vitro 3D skiljas neuronala nätverk. Den gemensamma idé består i att skapa en byggnadsställning där nervceller kan växa i en 3D-mode. En sådan byggnadsställning kan realiseras med polymergeler och fasta porösa matriser 9-13. Genom att utnyttja de mekaniska egenskaperna hos polymererna, är det möjligt att bädda in celler inuti these strukturer genom att definiera en enhetlig block av 3D-kulturer av neurospheres 11. Det viktigaste inslaget i denna strategi är den styva mekaniska egendom neurospheres 9,12. Emellertid har dessa material begränsad porositet, och de kan inte garantera cell migration inuti matrisen. För att övervinna denna nackdel, en möjlig lösning består i att skära matrisen i "enhet" moduler. Tyvärr kunde storleken och formen mångfald av partiklarna hämmar packningen till vanliga skiktade strukturer. I 7, Cullen och medarbetare utformat en 3D neuronal konstruktion består av nervceller och / eller astrocyter inom en bioaktiva extracellulär matrix-baserade schavotten. En sådan konstruerad nervvävnad tillåts in vitro undersökningar för att studera och manipulera neurobiologiska svar inom 3D mikromiljöer. Denna modell består av neuroner och glia fördelade över hela den extracellulära matrisen (ECM) och / eller hydrogel ställningar (500-600 | im tjock). I detta samarbetendition, en optimal cellviabilitet (större än 90%) erhölls genom utstrykning av celler vid en slutdensitet av cirka 3750 - 5000 celler / mm 3. Det bör noteras att en sådan densitet värde är betydligt lägre än den i in vivo tillstånd, där celldensiteten av musen hjärnbarken är cirka 90000 celler / mm3 14. För att övervinna denna begränsning Pautot och medarbetare 15 realiseras en 3D in vitro-system där celltäthet och nätverksanslutning styrs för att likna in vivo förhållanden samtidigt som realtidsavbildning av nätet. I praktiken är denna metod bygger på konceptet att dissocierade odlade nervceller kan växa på kiselmikropärlor. Dessa pärlor ger en tillväxtytan tillräckligt stor för neuronala cellkroppar att ansluta sig och för deras arborizations att växa, mogen, sträcker sig, och definierar synaptiska kontakter med andra nervceller. Denna metod utnyttjar spontana monteringsegenskaperna hos monodispergerade pärlor att form 3D lager hexagonala matriser som innehåller olika undergrupper av nervceller på olika lager med ansträngd anslutning mellan nervceller på olika pärlor. Den uppnådda celldensiteten med denna metod var ca 75.000 celler / mm3.

Nyligen har vi anpassat Pautot metod för att MEA 16: de erhållna resultaten visar att 3D elektrofysiologiska aktivitet ger en bredare repertoar av aktiviteter än den som uttrycks av 2D-nätverk. 3D mogna kulturer uppvisar en ökad dynamik där både nätverks brast och slump spik aktivitet samexistera. På samma sätt, Tang-Schomer och medarbetare 17 insåg en silkesproteinbaserad porösa byggnadsställning som upprätthåller en primär kortikal kultur in vitro för några månader, och spelade in elektrofysiologiska aktivitet med hjälp av en volframelektrod.

I detta arbete, de experimentella procedurer bygga 3D neuronala nätverk kopplade till MEA kommer att beskrivas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den experimentella protokollet N. 13130, maj godkändes av Europeiska Animal Care Lagstiftning (2010/63 / EU), av det italienska hälsoministeriet i enlighet med DL 116/1992 och av riktlinjerna vid universitetet i Genua (Prot. 2011). Alla ansträngningar gjordes för att minska antalet djur för projektet och för att minimera deras lidande.

1. Framställning av material och stöder

  1. Konstruera formen för att bygga PDMS (poly-dimetyl-siloxan) tvångs medelst en CNC (Computer Numerical Control) fräsmaskin. En sådan form är realiserad i polykarbonat med den centrala cylindern i polytetrafluoreten (PTFE). Detta material tillåter en lättare extraktion av masken när PDMS har hårdnat.
    OBS: Utformningen av formen har utförts av datorstödd design (CAD) och levereras sedan till CNC-fräsmaskin.
  2. Förbered PDMS elastomeren. PDMS är en organisk polymer. Den består av två delar, Ett härdningsmedel och en polymer. Blanda dem genom ett volymförhållande av 01:10, en del av härdningsmedlet och nio delar polymer. Sätt de två komponenterna i en petriskål, skaka och sätt blandningen i vakuumkammaren för 10 min för att eliminera luftbubblor. 3 g av PDMS är tillräckliga för en begränsning.
  3. Konstruera PDMS begränsning. Sätt PDMS materialet i molder och lägg den i ugnen i 30 minuter vid 120 ° C. PDMS begränsning har formen av en ideal cylinder med en yttre och inre diameter på 22,0 och 3,0 mm, respektive och en höjd av 650 pm.
  4. Dagen före plätering, koppla masken till den aktiva ytan av Micro-Elektrod matriser (MEA) med hjälp av en pincett under ett stereomikroskop och sterilisera PDMS mask i ugnen vid 120 ° C.
  5. Sterilisera glasmikropärlor (nominell diameter på 40 ± 2 ^ m; certifierad medeldiameter av 42,3 ± 1,1 | j, m) i 70% etanol under 2 h i en konisk flaska och rotera evsen 30 min för att exponera alla mikropärlor.
  6. Avlägsna etanolen lösningen ur flaskan och skölj mikropärlorna två gånger med steriliserat vatten.
  7. Konditionera den centrala delen av MEA område som avgränsas av PDMS mask (diameter är lika med 3,0 mm) med 24 il blandad lösning av Poly-D-lysin och laminin på 0.05 mikrogram / ml.
  8. Coat mikropärlorna med vidhäftningsproteiner, laminin och poly-D-lysin vid 0,05 | ig / ml och lämna dem över natt i inkubatorn vid 37 ° C för att erhålla en stabil och långvarig neuronala nätverket.
  9. Avlägsna de adhesionsfaktorer både från glasytan av MEA och från mikrokulor av glas. Aspirera ungefär 95% av beläggningslösningen med en pipett och applicera en liten volym 24μl- sterilt vatten på MEA ytan. Aspirera igen mer än 95% av vattnet och låt MEA torka under laminärt huven för ett h före utstrykning av cellerna.
    OBS: När det gäller mikrokulor istället, aspirera beläggningenlösning och gör en första tvätten med steriliserat vatten och en andra en med det basala mediet och dess tillägg såsom B27, för att konditionera glasytan där nervceller kommer att pläteras. Låt inte mikropärlorna torka. Lämna dem i suspension i odlingsmediet inne i flaskan.
  10. Distribuera, med hjälp av en pipett -200 μl-, suspensionen av behandlade mikropärlor (cirka 32 tusen) på en flerkällsplatta med membraninsats (pordiameter 0,4 um) där de kommer att själv montera bildning av ett likformigt skikt.
  11. Fyll varje brunn av membranet med 0,5 ml medium och placera den i inkubatorn (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) tills nervceller är redo att vara klädd (3,2).

2. Dissekering av embryon och Dissociation av Tissue

  1. Hus vuxna honråttor (200-250 g) vid en konstant temperatur (22 ± 1 ° C) och relativ fuktighet (50%) under en vanlig ljus-mörker schema (ljus på 7:00 till 7:00) idjuranläggning. Se till att mat och vatten är fritt tillgängliga.
  2. Söva en gravid kvinna råtta efter 18 dagars utveckling (E18) med 3% isofluran. Därefter offra djuret genom cervikal dislokation.
  3. Avlägsna hippocampi från varje råtta embryot och placera dem i iskall Hanks balanserade saltlösning utan Ca2 + och Mg2 +. Vid dag 18 av utvecklings hippocampus och cortex vävnader är mycket mjuka och behöver inte skäras i små bitar. Mer information kan hittas 18,19.
  4. Dissociera vävnad i 0,125% trypsin / Hanks lösning innehållande 0,05% av DNAs för 18-20 minuter vid 37 ° C.
  5. Avlägsna supernatanten lösningen med en Pasteurpipett och stoppa enzymatisk spjälkning genom att tillsätta medium med 10% fetalt bovint serum (FBS) under 5 minuter.
  6. Avlägsna medium med FBS och tvätta en gång med mediet med dess tillägg, 1% L-glutamin, gentamicin 10 | ig / ml. Avlägsna åter mediet med en Pasteur-pipette och fylla på den igen med en liten mängd (500 | j, l) av tillväxtmedium med dess tillägg, 1% L-glutamin, gentamicin 10 | ig / ml.
  7. Dissociera vävnaden pelleten mekaniskt med en smal pasteurpipett tills en mjölkaktig suspension av celler är uppenbar. Det är inte nödvändigt att centrifugera cellsuspensionen.
  8. Späd den lilla volymen av cellsuspension med tillväxtmediet för erhållande av en slutvolym av 2,0 ml. Räkna erhållna cellulära koncentrationen med en hemocytometer kammaren. Späd denna koncentration vid ett: 5 för att erhålla den önskade cellkoncentration av 600-700 celler / | il.

3. Cell Plätering

  1. Plate celler vid en densitet av ca 2000 celler / mm 2 på det aktiva området av MEA, som definieras av PDMS tvång att skapa en 2D neuronala nätverket.
    OBS: Varje hippocampus innehåller cirka 5 x 10 5 celler, (1 x 10 6 för en enda embryo). Dissekera 6 embryon för att få ett sammanlagt belopp av 6 x 106-celler i 2 ml och en beräknad koncentration på 3000 celler / ul. Späd denna koncentration vid ett: 5 för att erhålla den önskade cellkoncentrationen och plattan ca 600-700 celler / | il. Om MEA yta som anges av PDMS begränsning är omkring 7,065 mm 2, och det totala antalet strukna cellerna 600 celler / mikroliter x 24 pl = 14.400 celler, den slutliga densiteten av 2,038 celler / mm 2.
  2. Placera MEA enheter i inkubator med fuktad CO2 atmosfär (5%) vid 37 ° C.
  3. Fördela 160 ^ il av suspensionen med en cellkoncentration av 600-700 celler / | il (cirka 100 tusen celler) på ytan av den mikropärlor monoskiktet placerad innanför multibrunnplattor för att slutföra det preliminära steget för konstruktionen av tre-dimensionell odling. Sätt de multibrunnplattor i inkubator med fuktad CO2 atmosfär (5%) vid 37 ° C.

4. 3D neuronal Network Construction

  1. 6-8 timmar efter plätering, överför suspensionen (mikrokulor med neuroner) från flerbrunnsplattor mycket noga inom ett område som avgränsas av PDMS begränsning genom att använda en pipett som fastställts för en volym av ca 30-40 l. Efter varje överföring, vänta i ungefär en halv minut, för att låta mikropärlorna att själv samlas i en hexagonal kompakt konstruktion.
  2. När alla skikten är avsatta och spontant hopsatt, fyll på med en stor droppe av ca 300 | il av mediet början av yta som anges av PDMS begränsning.
  3. Sätt 3D-strukturen är kopplad till MEA i inkubator (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) för 48 h före tillsats av en slutlig volym (ca 1 ml) av tillväxtmedium kultur med dess komplement.
    OBS: Betrakta det totala antalet kulor på multibrunnplattor med membraninsatsen (30 tusen) och antalet pärlor på ett enda skikt på MEA anordningen (6000). Den resulterande 3D-struktur består av 5 skikt av microbeads och celler. Med hänsyn till att den 3D neuronala nätverket inte är geometriskt perfekt, skulle den resulterande 3D-strukturen bestå av 5-8 skikt.
  4. Dagen efter utstrykning, tillsätt försiktigt den slutliga volymen av mediet (omkring 900 | il) inuti MEA ringen. Bibehåll 3D kulturer i en fuktad CO2-atmosfär (5%) vid 37 ° C under 4-5 veckor. Ersätt halv av mediet en gång i veckan.

5. konfokalmikroskopi Acquisition

  1. Fäst biologiska prover till scenen av mikroskopet i en hållare. Ställ lasern (Argon, 496-555 nm), skanningshastighet (400 Hz) vid för att hämta bilden, förstärkning och offset (-0,3%) av PMT för varje bild för att fånga rätt emissionsbandbreddsfilter och för för att undvika mättning och för att öka signalbrusförhållandet. Resultat avsnitt rapporterar de värden som används för att förvärva bilder av figur 4.
  2. För förvärvet av z -stack sekvensen, granst väljer värdet på Z-position på den övre och undre skiktet av provet, och välj sedan steglängd för att göra förvärv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

. I denna experimentella förfarande är en relevant roll som mikropärlor som definierar den mekaniska klätterställning för tillväxten i 3D neuronala nätverket Figurerna 1A och B visning arrangemanget av mikropärlorna (nominell diameter på 40 ± 2 m; certifierad medeldiameter av 42.3 ± 1,1 | j, m) i planet. Den egenheten att sådana strukturer är att mikropärlor spontant själv montera definierar en kompakt sexkantiga geometri (Figur 1B och C). Den så genererade ställningen garanterar en stabil tillväxt yta för neuriter och en tillräckligt stor mellanrum för metaboliska utbytet av cellkropparna. Denna mikrokorn dimension visar sig vara en rimlig kompromiss för interstitiell mellanrum och slut neuronal densitet. Med tanke på att PDMS struktur återskapar en "ideal" cylinder, och eftersom den kompakta hexagonala strukturen impact factor (HPF) är lika med 0,74, det maximala antalet kulor (diameter 4081, m) som finns i PDMS begränsning är ca 100 tusen, vilket motsvarar ca 6000 mikropärlor per varje skikt. Som förklaras i protokollenheten, dessa mikrokulor är redan rade med vidhäftningsfaktorer (dvs Laminin och Poly-D-lysin). Detta förfarande garanterar att neuroner vidhäftar till mikrokornen. Figur 1D visar ett exempel där tre neuroner är kopplade till en mikropärla med en diameter på 40 | j, m.

Figur 1
Figur 1. Bilder av mikropärlorna används för att skapa byggnadsställningen för det neuronala nätverket. (A, B) Två exempel på monoskikt av mikropärlor på ytan av en flerkällsplatta med membraninsats. (C) mikropärlor avgörande enligt gravitationskraft och spontant samman till 2D hexagonala matriser. När det första skiktet är helt packat, andra pärlor tillsättes, byggaing en andra beordrade skikt med samma hexagonal symmetri. Ytterligare tillsats av mikropärlor resulterade i konstruktionen av en packad 3D montering. Det fria utrymmet mellan mikropärlorna fylls av neuronala processer och cellkroppar. (D) Tre neuroner är förankrade på ytan av en enda mikrokorn, tidigare konditionerade med vidhäftningsfaktorer (laminin och Poly-D-lysin). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Gränssnittet av mikropärlorna och neuroner med den aktiva delen av en MEA beror på en elastomer begränsning (fig 2C), realiseras med formen som visas i figurerna 2A och B. Figur 2A visar layouten och de utvalda dimensioner. Den aktiva arean hos MEA avgränsas genom koppling PDMS strukturen i fig 2C till MEA substratet (figur 2D). På detta sätt är neuroner tvingas att ansluta sig till den aktiva elektrodarean av MEA. Därefter kommer de glasmikrokorn stackar med vidhäftande neuroner rymmas på detta första skikt. Figur 2D visar ett tvärsnitt av den slutliga konfigurationen, där rollen av PDMS strukturen kan tydligt inses. Utrymmet avgränsas av PDMS strukturen innehåller blandningen av mikropärlor och neuroner (vitt pulver i den nedre panelen i figur 2D). PDMS struktur har formen av en cylinder byggd med formen som visas i figur 2B med följande dimensioner: yttre och inre diameter på 22,0 och 3,0 mm respektive och höjd på 650 | im. Formen byggdes med hjälp av polykarbonat och PTFE som göra en idealisk slät och motståndskraftigt material för att underlätta extraktionen av det elastomera mask.The PDMS begränsningar visas en kortare livslängd, eftersom de klibbiga egenskaperna hos PDMS minskningen efter varje användning. Typiskt , Varje PDMS struktur kan med framgång användas tre gånger.

Figur 2
Figur 2. Material för att bygga 3D-neuronala nätverket. (A) Konstruktion och (B) bild av formen som används för att skapa den fysiska begränsningen. Grå 3 mm cylinder diameter motsvarar hålet i begränsning visas i (C). (C) PDMS begränsning placeras på den aktiva delen av en Micro-elektrod Array (MEA). Användningen av en sådan fysisk barriär tillåter att innehålla mikropärlorna i ett målområde (ca 7 mm 2) och begränsa utvecklingen av 3D-nätverket. (D) Tvärsnitt av MEA-systemet och tvång. Mikropärlor (avbildas av mikroskopet i det övre högra hörnet) fylls i det avgränsade av PDMS tvång (nedre panelen) utrymme.080fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter inneslutning av den aktiva delen av MEA med hjälp av PDMS masken fortsätter protokollet som visas i panelerna i figur 3, som beskriver de viktigaste stegen för att förverkliga montering av nervceller och mikropärlor.

Det första preliminära steget består i plätering dissocierade neuroner på MEA ytan som tidigare förbelagd med adhesionsmolekylerna Laminin och poly-D-lysin (figur 3A). Det är viktigt att 2D neuronala nätverket fäster direkt till den aktiva delen av MEA: endast under dessa förhållanden är möjligt att registrering av elektrofysiologiska signaler (dvs, spikar och skurar). Denna första del av protokollet motsvarar standardförfarandet som används till platta 2D nervceller. Den faktiska konstruktionen av 3D-systemet visas i fig 3B, C och D (Figur 3B); efteråt, är en 160 pl suspension med en cellkoncentration av 600-700 celler / il (cirka 100000 celler) fördelade på mikropärlor monolager (Figur 3C). Med tanke på att celler kan uppta halv av vulstområdet, är den totala fria ytan 75 mm 2. Celltätheten på mikropärlor monoskiktet är cirka 1500 celler / mm 2. De utnyttjade flerbrunnsplattor med membraninsatsen fram ett poröst membran med en yta av 33,6 mm 2. Genom att beakta en virtuell cylindrisk form med en bas område lika med den porösa membranytan och en höjd av 40 um (pärldiameter), är ett enhetligt skikt som består av 30.000 mikropärlor kopplade till multibrunnplattor med membraninsatsen. Den så insåg suspension av mikropärlor och neuroner stannar ca 6-8 timmar inne i flerbrunnsplattor med membraninsatsen. En gångovannämnda åtgärder genomförda, kan byggandet av 3D-nätet börjar. Vid denna tidpunkt, är blandningen av nervceller och mikrokorn bort från flerbrunnsplattor med membraninsats och placeras på 2D neuronala nätverket tidigare ströks ut det område som definieras av PDMS tvång (Figur 3D). Under denna procedur, sker en förlust på cirka 20-30% av nervceller grund av (i) mekaniska manipulationer och (ii) överlåtelse utanför membranet. Genom att beakta den basområde begränsningen (7,06 mm 2) och en höjd av 178.56 ^ m (5 skikt av pärlor), och att dividera antalet celler med volymen av den ideala cylindern som bildas av de 5 skikt av pärlor, den resulterande 3D neuronala nätverket celldensiteten är ca 80 tusen celler / mm 3.

Figur 3
Figur 3. Skiss över de grundläggande stegen för att skapa 2D och 3D neuronala nätverk. (A) Plätering of neuroner på den aktiva delen av en MEA. Upphävandet av nervceller pläterade på MEA ytan, tidigare konditionerade med vidhäftningsfaktorer och avgränsas av PDMS tvång. Detta steg gör det möjligt att inse: i) en klassisk 2D neuronala nätverket kopplat till MEA; ii) den första lagret av ett 3D-nät från vilket elektrofysiologiska aktivitet spelas in. (B) mikrokulor och (C) nervceller levereras till ytan av flerbrunnsplattor med membraninsatsen efter 6-8 timmar. (D) Upphävandet av neuroner och mikropärlor flyttas från de multibrunnplattor, med membran insatsen till 2D-nät. En upprepning av detta steg flera gånger gör det möjligt att definiera ett tätt flerskiktig 3D-struktur. (E) När 3D-strukturen är fullbordad, en droppe av mediet tillsattes och den resulterande strukturen lagras i inkubatorn under 48 h. (F ) Efter 48 timmar, är 3D-kulturen helt fyllas med den slutliga volymen av mediet.Klicka här för att se en större version av denna siffra.

När väl det första skiktet har positionerats, är samma operation upprepas för att erhålla en packad 3D ensemble. Den resulterande 3D-struktur omorganiserar sig definierar en kolloidal kristall som själv monterar i en kompakt struktur som består av ca 5-8 lager av mikropärlor och nervceller (Figur 4). När alla lager bildas, har 3D-nätverket för att fyllas på med en droppe av 300 pl medium (figur 3E). I detta skede kan 3D nät kopplade till MEA lagras i inkubator under 48 timmar. Efter det är 1 ml medium tillsätts för att fylla ringen av MEA (Figur 3F).

När alla lagren har satts samman, neurites växer över microbead schavotten att nå en slutlig celltäthet av omkring 80.000 celler / mm3. Det är värt att noticing att det erhållna värdet är inte långt från 92.000 celler / mm3, den genomsnittliga neuronal densitet i musen hjärnbarken 14.

Figur 4 visar tre exempel på 3D-nätverk kopplade till MEA fångas med hjälp av konfokalmikroskopi upprätt. I fig 4A, DIC (differentiell interferenskontrast) bilden består av en enda lager av pärlor kopplade till MEA ytan; mikroskopet kopplades med 20,0 NA 0,50 vatten mål och bilderna förvärvades med Transmitted PMT ingår till mikroskop och en laser Argon (488 nm). Bilderna visar mycket tydligt den rumsliga utformningen av elektroderna (svarta prickar) och regelbunden fysisk planering av mikropärlorna.

I figur 4B, en immunofluorescensfärgning för Map-2 (röd signal) visar fördelningen av dendritiska arborizations och somata av neuronerna i närheten av mikropärlor direkt kopplade till elektrodplanet av ME(Kan observeras närvaron av svarta kontakter) A. Fig 4B är en maximal projektion av ett z-stack sekvens (108 pm) med stegstorleken är lika med 1,53 um. Bilder förvärvades med 40,0 NA 0,80 vatten mål; excitation är Argon Laser (488 nm), emissionsbandbredden 496nm-655 nm.

Slutligen visar figur 4C den största projektionen av en z -stack sekvens (187,79 pm) i en 3D hippocampus kultur (steglängd är 2,27 um). Z -stack sekvensen förvärvades med 25,0 NA 0,95 vatten mål. För grön kanal, var en Argon laser 488 nm och en emissionsfilterbandbredd 499nm-551nm användas. För röda kanalen, var en 543 nm laser och en emissionsfilterbandbredd 555nm-645nm användas. Kanalerna förvärvades i sekvensläge. En mycket sammankopplade nät framträder där nervceller märkta för Neun uttryckt i mogna efter mitotiska neuroner (röd signal) och GABA (grön signal, yellåg merge). Gaba antikropp avslöjade en positivitet för hämmande nervceller både i somata och neuriter.

Figur 4
Figur 4. Tre exempel på 3D-nät fångas upp av konfokalmikroskopi. (A) DIC (differentiell interferenskontrast) bild som visar ett enda skikt av pärlor kopplade till MEA ytan; den rumsliga utformningen av elektroderna (svarta prickar) kan observeras. (B) Immunofluorescens färgning för Map-2 (röd signal) visar fördelningen av dendritiska arborizations och somata av nervceller runt mikropärlorna direkt kopplade till elektrodplan MEA. ( C) Högsta projektion av en z -stack sekvens (187,79 pm) i en 3D-kultur visar en tätt sammanlänkad nätverk där nervceller är märkta för Neun uttryckt i mogna efter mitotiska neuroner (röd signal) och GABA (grön signal, gult i merge ). Gaba antikropp revealed en positivitet för hämmande nervceller både i somata och neurites. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att förstå om närvaron av en 3D-struktur modulerar nätverksdynamik, var så genererade elektrofysiologiska aktivitet jämfört med konventionella 2D neuronala nätverk ökat under MEA, som utgör referensmodellen.

Figur 5
Figur 5. Jämförelse mellan nätverks dynamik som uppvisas av 3D (vänstra kolumnen) och 2D (högra kolumnen) hippocampus kulturer Vid varje tidsskalan (A: 1.200 sek, B: 300 sek; C: 60 sek; D: 10 sek)., 3D församlingar visar en mängd olika underskrifter aktivitet (dvs. korta och långa nätverks skurar, slumpmässig spikingaktivitet, synkroniserade skurar), medan 2D som visar en mer uttalad stereotyp aktivitet med hög synkroniserade skurar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 visar två raster tomter av två representativa experiment utförda på en 3D (vänster paneler) och 2D (höger sida) hippocampus kulturen under den fjärde veckan in vitro. Dessa kurvor visar den elektriska aktiviteten i nätverket registreras på alla aktiva elektroder (dvs.., Elektroder med en avfyrningshastighet större än 0,1 spikar / s).

Dynamiken i 2D nätverk visar en kvasi-synkron aktivitet består huvudsakligen av nätverks skurar. Undertecknandet av denna dynamiska är närvaron av synkroniserade händelser som involverar de flesta av de inspelningskanaler med mellanliggande period då nästan ingen aktivitet registreras (se den högra panelen avFigur 5D). Detta beteende kan inses vid olika tidsskalor, eftersom de olika nivåer av förstoring strykning.

I fallet med en 3D-nätverk, undertecknandet av nätverks dynamik består av en bredare repertoar av aktiviteter som kännetecknas av: (i) mindre global synkroni, (ii) mer slumpmässig tillsatta aktivitet, (iii) perioder då under nät (dvs. , en delmängd av mikroelektroder) presenterar en mer synkron aktivitet med förekomsten av nätverks skurar. Dessutom är varaktigheten av nätverks skurar mer variabel samt: det är förekomsten av nätverks skurar med en löptid som liknar den som observerades i 2D nätverk, men det finns också längre nätverks skurar. En komplett och kvantitativ karakterisering av framväxande 3D ​​dynamik som erhållits genom att använda en sådan metoder kan hittas i 16. Som väntat, 3D neuronala nätverket uppvisar också en betydande "slumpmässig spetsning" och icke-synkron spräng activity. Rimligheten i dynamiken som genereras av dessa 3D-strukturer har preparerat med vissa kontroll-experiment (t.ex. närvaron av en 2D-nätverk kopplat till en MEA med en bunt kala mikropärlor och 3D-nätverk monterade på mikropärlorna med en naken MEA), som rapporterats i 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete, ett nytt experimentellt in vitro plattform består av 3D konstruerade neuronala kulturer kopplade till MEA för nätverkselektro har presenterats. Användningen av mikropärlor som klätterställning för att tillåta neuritic utväxt längs z-axeln har skräddarsytts för att integreras med den plana MEA. På detta sätt, att de erhållna mikro-system resulterar i en giltig och tillförlitlig in vitro 3D-modell studera framväxande elektrodynamiken 16.

MEA inspelning set-up

MEA enheter består av en odlingskammare med en integrerad uppsättning av substratinbäddad mikroelektroder kan mäta extracellulära signaler från elektroaktiva vävnader. De typiska inspelade signalerna består av spikar (dvs., enkel övertröskelspänningsvariation representerar den elektriska aktiviteten i en eller flera neuroner) och skurar (dvs sekvensen av höggradigt packade spikar ofta Occurring samtidigt på flera kanaler). Inspelningarna av neuronala nätverk aktivitet med MEA-baserade system producerar stora mängder data (t.ex. en 4 timmar experiment med en 60 kanaler MEA producerar ett register över ca 15 GB). Detta medför ett behov att ha effektiva verktyg för att behandla och analysera data, speciellt i fallet med studier som kräver långa inspelningar. I allmänhet är registrering av elektrofysiologiska signaler som erhålls genom en direkt extracellulärt transduktion med neuronala kulturer, och förvärvet av en spänningssignal. Efter en förstärkning och filtrering skede signaler samplas 10-50 kHz och lagras. Rå signalerna är sedan topp detekteras av en anpassad utvecklat verktyg. Registreringssystemet bestod av (1) MEA förstärkare, (2) persondator utrustad med A / D-upptagningskortet, (3) inspelningsprogram, (d) värmesystem och temperaturregulator, (4) CO2 atmosfär-underhålla och indunstning förhindrande system.

Denbyggandet av 3D neuronala nätverket går genom två viktiga steg: den första är fördelningen av den korrekta mängden av pärlor på multibrunnplattor med membranskärytan, är den andra överföring av suspensionen av mikrokulor med vidhäftande neuroner från flerkälls plattor med membraninsatsen till: (i) 2D neuronala nätverket ströks ut på det aktiva området av MEA (första skiktet); (ii) De som redan slagit sig skikten. Denna operation bör upprepas så många gånger som antalet nödvändiga lager. Under den första veckan av kultur, en snabb tillväxt av neuritiska förlängningar sker runt mikropärlorna som hör till de olika lagren. Den nära kopplingen mellan nervceller och mikrokorn stabiliserar biologiska prover och låt flytta den från inkubatorn att ändra / ersätta mediet och att spela med MEA förstärkaren den elektriska aktiviteten utan att oroa dig att skada den.

Eftersom den elektrofysiologiska aktiviteten av hela nätetArbetet redovisas endast från bottenskiktet (dvs. en direkt kopplad till MEA), det aktiva området måste täckas med en konventionell 2D nätverk. De andra skikten kommer att läggas stegvis under 2D en, och långdistans anslutningar kommer att spridas bland skikten. I praktiken är de andra skikten sattes 6-8 h senare än 2D en genom att avsätta blandning av neuroner och mikropärlor. Valet av denna tidsfönstret möjliggör bildandet av ett fåtal synapsförbindelser i 2D skiktet, och garanterar möjligheten att upprätta förbindelser till de övre skikten också.

Två faktorer gör användningen av flerbrunnsplattor med membran infoga nödvändigt att realisera de 3D-nät: (i) eftersom neuroner och mikropärlor har olika sedimenteringshastigheter, användning av flerbrunnsplattor med membraninsats garanterar en likformig fördelning av neuroner på toppen av mikropärlorna : i genomsnitt, kan varje mikrokorn vara omgiven av samma antal neuroner. (ii) By utnyttja de elastiska egenskaperna hos de multibrunnplattor med membraninsatsen, är enklare än att använda fasta ytor såsom polykarbonat multibrunnar svall av lösningen av mikropärlor kopplade till neuroner.

De presenterade arbete följer den strategi som föreslagits av Pautot och medarbetare 15: i denna studie användningen av kiseldioxidpärlor gav en tillväxtytan tillräckligt stor för neuronala cellkroppar att ansluta sig och för sina processer för att växa, mogna och producera pre- och postsynaptiska inriktningar . Ett giltigt alternativ till användningen av pärlor ställningen kommer från hydrogeler matriser eller bioaktiva och biologiskt nedbrytbara pärlor består av naturliga biopolymer som kitosan. Kitin och dess deacetylerade derivat, kitosan, är icke-toxiska, antibakteriell, biokompatibla och bionedbrytbara biopolymerer. Tidskonstanten för en sådan nedbrytningsprocessen är kompatibel med nätet VÄXA OM 20,21.

Denna studie kan utgöra ett referenssystem work för den framtida utvecklingen av avancerade 3D-neuronal modellsystem för att systematiskt studera samspelet mellan nätverksdynamik och struktur. På kort tid, hoppas vi kunna överföra 3D-nätverket konstruktionen på en ny generation av produkter 22. Tillverkningstekniken innebär produktion av elektroder i form av mikropelare i en variabel höjder mellan 50 och 350 | im.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna tackar Giorgio Carlini för tekniskt stöd för att utveckla begränsningsstrukturen och dott. Ornella LoBrutto för grundlig översyn av manuskriptet. Den forskning som lett fram till dessa resultat har erhållit finansiering från EU: s 7: e ramprogram (IKT-FET FP7 / 2007-2013 FET Young Explorers system) under bidragsavtal 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminin Sigma-Aldrich L2020 0.05 µg/ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 0.05 µg/ml
Trypsin Gibco 25050-014 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase Sigma-Aldrich D5025 0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal Gibco Invitrogen 21103049 culture medium
B27 Gibco Invitrogen 17504044 2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-2442 10%
Glutamax-I  Gibco 35050038 0.5 mM
gentamicin Sigma-Aldrich G.1272 5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) Corning Sigma 481939 curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays Multi Channel Systems (MCS) 60MEA200/30-Ti-pr MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead Distrilab-Duke Scientific 9040  1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
Transwell Costar Sigma CLS 3413 multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++  Gibco Invitrogen 14175-052
Hanks Buffer Solution  Sigma  H8264
Teflon Sigma 430935-5G polytetrafluoroethylene
Rat Sprague Dawley Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright Leica TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
40.0x0.80 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
25.0x0.95 WATER objective Leica HCX IRAPO L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
  2. Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
  3. Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
  4. Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
  5. Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
  6. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
  7. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
  8. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
  9. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
  10. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
  11. Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
  12. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
  13. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
  14. Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
  15. Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
  16. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
  17. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
  18. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
  19. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
  20. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
  21. Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
  22. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).

Tags

Neurovetenskap 3D-nät manipulerade nätverk neuronala kulturer Micro-Elektrod matriser (MEA) nätverksdynamik elektrofysiologiska signaler
Gränssnitt 3D Engineered neuronala kulturer Micro-Elektrod arrayer: Ett innovativt<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimentellt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tedesco, M., Frega, M., Martinoia,… More

Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model. J. Vis. Exp. (104), e53080, doi:10.3791/53080 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter