Introduction
微小電極アレイ（MEAの）に結合された試験管 2次元（2D）のニューラルネットワークではニューロンのダイナミクスと基礎接続の間の相互作用を研究するために採用した金標準実験モデルをarethe。開発中に、ニューロンは、よくdefinedspatio-temporalpatternsof活性を示す複雑なネットワーク1,2（ すなわち 、バースト、ネットワークバースト、ランダムスパイク活動を）再作成します。 MEAがネットワークレベルで発現ダイナミクスの詳細な調査を可能にする、多くのサイトから（数十から数千の微小電極に）電気生理学的活動を記録。また、解離文化の使用は、設計、ネットワークを設計することが可能ですになります。これは、異種の神経ポップの存在、このように記録された電気生理学的活性および細胞密度3、モジュール4,5度のようなネットワーク組織のパラメータとの間の機能の関係を理解することは容易ですulations 6などがしかし、解離培養細胞上のすべてのin vitroでの研究は、2D神経回路網に基づいています。このアプローチは 、in vivo（本質的に3次元、3D）システムに関してoversimplificationsにつながる：2Dモデル、細胞体と成長円錐（I）における平坦化され、軸索、樹状突起の伸長は、全方向7に拡散することはできません。 （ii）の2D インビトロネットワークの展示は、ネットワーク8のニューロンの大部分を伴う活動を破裂によって支配電気生理学的ダイナミクスをステレオタイプ。
最近、 インビトロの3次元構造を可能にするために開発されてきた別の解決法は、神経ネットワークを解離しました。一般的な考え方は、ニューロンが、3Dの方式で成長することができます足場を作ることにあります。そのような足場は、高分子ゲル、固体多孔質マトリックス9-13で実現することができます。ポリマーの機械的性質を利用することにより、THES細胞内を埋め込むことが可能ですニューロスフェア11の3次元培養の均一なブロックを定義することにより、電子構造。このアプローチの主な特徴は、神経球9,12の剛性機械的性質です。しかしながら、これらの材料は、多孔性が制限されており、それらは、マトリックス内部の細胞移動を保証しません。この欠点を克服するために、可能な解決策は、「ユニット」モジュールにマトリクスをスライスすることからなります。残念ながら、粒子のサイズおよび形状の多様性は、通常、層状構造への充填を妨げる可能性があります。 7では 、カレンと共同研究者は、生物活性、細胞外マトリックスベースの足場内のニューロンおよび/ またはアストロサイトで構成された3D神経構造物を設計しました。このような操作された神経組織は、3Dマイクロ環境内の神経生物学的応答を研究し、操作するためにインビトロの研究では許可 。このモデルでは、細胞外マトリックス（ECM）および/またはヒドロゲル足場（500-600ミクロン厚）全体に分散ニューロンおよびグリア細胞から成っていました。この共同で5,000細胞/ mm 3 - ndition、最適な細胞生存率（90％より大きい）が約3750の最終密度で細胞をプレーティングすることによって発見されました。そのような濃度値がマウスの脳皮質の細胞密度が90,000細胞/ mm 3 14でのin vivo条件でのものよりもはるかに低いことに留意しなければなりません。この制限を克服し、Pautot 15は、細胞密度とのネットワーク接続は、ネットワークのリアルタイムイメージングを可能にしながら、インビボ条件に似ているように制御される三次元インビトロシステムを実現するために、同僚。実際に、この方法は、培養神経細胞は、 シリカマイクロビーズ上で増殖することができる解離概念に基づいています。これらのビーズは付着する神経細胞体のためと、成熟した、成長し拡張し、他のニューロンへのシナプスの連絡先を定義するために、彼らのarborizationsための十分な大きさの成長表面を提供します。この方法は、FOする単分散ビーズの自発的な組立特性を利用RM 3Dは、異なるビーズ上のニューロンの間で拘束された接続性を有する異なる層のニューロンの明確なサブセットを含む六角形の配列をレイヤード。この方法で達成された細胞密度は約75,000細胞/ mm 3でした 。
最近、我々は、MEAを16にPautotの方法を適応している。得られた結果は、3D電気生理学的活性は、2Dネットワークによって発現される1以上の活動の広いレパートリーを提示することを示しています。 3D成熟した文化がネットワークバーストと、ランダムなスパイク活動の共存の両方強化ダイナミックを示します。同様に、唐-Schomerと同僚17は、数ヶ月のために、in vitroでの一次皮質培養を維持シルクプロテイン系の多孔質足場を実現し、タングステン電極を用いて電気生理学的活性を記録しました。
この作品では、多国間環境協定に結合された3次元神経回路網を構築するための実験手順を説明します。
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Protocol
実験プロトコルは、DL 1992分の116とし、ジェノバ大学（Protののガイドラインにより応じた保健のイタリア語省によって、ヨーロッパの動物保護法制（63分の2010 / EU）によって承認された。N. 13130、月を2011）。すべての努力は、プロジェクトのための動物の数を減少させ、その苦痛を最小限にするために行われました。
材料と支持体の作製
- CNC（コンピュータ数値制御）フライス盤を用いて、PDMS（ポリジメチルシロキサン）の制約を構築するための金型を作成します。このような金型は、ポリテトラフルオロエチレンで中心筒（PTFE）とポリカーボネートで実現されます。この材料は、PDMSが硬化した後にマスクを容易に抽出することができます。
注：金型の設計は、コンピュータ支援設計（CAD）によって行われ、その後、CNCフライス盤に配信されています。 - PDMSエラストマーを準備します。 PDMSは、有機ポリマーです。これは、二つの要素から構成されています、硬化剤及びポリマー。 1：10の体積比で混合して、硬化剤の一部とポリマー9部。ペトリ皿に二つの成分を入れ、気泡を除去するために10分間真空チャンバ内で混合を振るとインサート。 PDMSの3グラムは、つの制約のために十分です。
- PDMS制約を構築します。成形機にPDMS材料を挿入し、120℃で30分間オーブンに入れて。 PDMS制約はそれぞれ22.0と3.0ミリメートルの外部および内部直径650ミクロンの高さの理想的な円筒の形状を有しています。
- メッキ前日、カップル実体顕微鏡下でピンセットを用いた微小電極アレイ（MEAの）の活性領域にマスクと120℃のオーブンで、PDMSマスクを滅菌します。
- 円錐バイアル中で2時間、70％エタノールおよびEVを回転させ、ガラスビーズ（42.3±1.1ミクロンの認定平均直径40±2μmの呼び径）滅菌すべてのマイクロビーズを公開するERY 30分。
- バイアルからのエタノール溶液を除去し、滅菌水でマイクロビーズを2回すすいでください。
- 0.05μgの/ mlのポリ-D-リジンおよびラミニンの混合溶液の24μlの（直径3.0ミリメートルに等しい）PDMSマスクによって画定MEA領域の中央部を条件付けます。
- コートは0.05μg/で接着タンパク質、ラミニンおよびポリ-D-リジンとのマイクロビーズはmlであり、安定的かつ長期的な神経ネットワークを得るために、37℃のインキュベーター内で一晩置いておきます。
- MEAのガラス表面からガラスマイクロビーズの両方から接着因子を削除します。吸引するピペットでコーティング溶液の約95％とは、MEAの表面に滅菌水の小さなVOLUME-24μl-を適用します。吸引し、再び水の95％以上と細胞をプレーティングする前に1時間層状フードの下で、MEAの乾燥をしてみましょう。
注：マイクロビーズの場合は代わりに、コーティングを吸引ニューロンはメッキされたガラス表面を調整するために、滅菌水や、B27などの基礎培地とサプリメント第1と第一の洗浄を、ソリューションとなります。マイクロビーズを乾燥させないでください。バイアル内部の培養液中の懸濁液のままにしておきます。 - 彼らは均一な層を形成する自己集合する膜インサート（細孔直径0.4ミクロン）とのマルチウェルプレートにピペット-200μl-、処理されたマイクロビーズの懸濁液（約32,000）を用いて、配布します。
- 培地0.5mlを有する膜の各ウェルを記入し、インキュベーターに入れて（T = 37.0°Cの 、CO 2 = 5％）ニューロンは（3.2）メッキすることの準備が整うまで。
2.胚の解剖と組織の解離
- 中（点灯午前7時 - 午後7時）、通常の明暗スケジュールの下で一定温度（22±1℃）および相対湿度（50％）でハウス大人雌ラット（200〜250グラム）動物施設。食料と水は自由に利用可能であることを確認してください。
- 3％のイソフルランを使用して、開発の18日（E18）の後に妊娠したメスのラットを麻酔。その後、頸椎脱臼により動物を生け贄に捧げます。
- 各ラットの胚から海馬を削除およびCa 2+およびMgのない氷冷ハンクス液2+に入れます。日目に開発海馬および皮質組織の18は非常に柔らかく、小片に切断する必要はありません。さらなる詳細は18,19を見ることができます。
- 37℃で18〜20分間のDNAse 0.05％を含むトリプシン/ハンク溶液の0.125％で組織を解離します。
- パスツールピペットを用いて上澄み液を除去し、5分間、10％ウシ胎児血清（FBS）を含む培地を加えることによって、酵素消化を停止します。
- FBSで培地を除去し、そのサプリメント、1％L-グルタミン、ゲンタマイシンを10μg/ mlの培地で1回洗浄します。パスツールピップで再びメディアを削除しますETTEおよび10μg/ mlのゲンタマイシン、そのサプリメント、1％L-グルタミンを有する成長培地の少量（500μL）で再度補充。
- 細胞の乳白色の懸濁液が明らかになるまで、狭いパスツールピペットで機械的に組織ペレットを解離します。これは、細胞懸濁液を遠心分離する必要はありません。
- 2.0 mlの最終容積を得るために、増殖培地で細胞懸濁液の少量を希釈します。血球計数器室で得られた細胞濃度を数えます。 /μL600-700細胞の所望の細胞濃度を得るためには5：1で、この濃度を希釈します。
3.セルメッキ
- PDMSの制約によって定義され、MEAの活性領域上に約2,000細胞/ mm 2の密度でプレートの細胞は、2次元神経回路網を作成します。
注：各海馬は約5×10 5細胞を含む、（単一胚のための1×10 6）。 6×10の合計量を取得するために6胚を解剖6 2ml中の細胞、および/μlの3000細胞の推定濃度。 /μlの所望の細胞濃度およびプレート約600-700の細胞を得るために、5：1で、この濃度を希釈します。 PDMSの制約によって区切られたMEAの面積は約7.065ミリメートル2、播種した細胞600個/μL×24μL= 14,400細胞/ mm 2で2038細胞の最終濃度の合計数である場合。 - 37℃の加湿CO 2雰囲気下（5％）でインキュベーターにMEAデバイスを配置します。
- 三次元培養の構築のための予備的なステップを完了するために、マルチウェルプレートの内側に位置するマイクロビーズ単層の表面に600〜700個/μlの（約100,000細胞）の細胞濃度で懸濁液の160μlのを配布します。 37℃の加湿CO 2雰囲気下（5％）でインキュベーターでマルチウェルプレートを置きます。
4. 3D神経ネットワークの構築
- 6-8時間、めっき後、約30〜40マイクロリットルの容量に設定されたピペットを用いて、PDMSの制約によって区切られた領域の内側に非常に慎重に、マルチウェルプレートからサスペンション（ニューロンとマイクロビーズ）を転送します。各転送後、自己集合六角形のコンパクトな構造にするマイクロビーズを可能にするために、約半分の分を待ちます。
- すべての層が堆積され、自然に組み立てられると、媒体の約300μlのPDMS制約で区切られた領域の上部の大滴で補充します。
- インキュベーター内（T = 37.0をO℃、CO 2 = 5％）をMEAに結合された三次元構造を入れ48時間のサプリメントで成長培地培養物の最終体積（約1ml）を添加する前に。
注：メンブレンインサート（3万）とMEAデバイス（6000）上に単層のビーズの数をマルチウェルプレート上のビーズの総数を考えてみましょう。得られた三次元構造は、MIの5 層から構成されていますcrobeads細胞。 3D神経ネットワークが幾何学的に完全ではないことを考慮すると、結果として得られる3次元構造は、5-8の層で構成することができます。 - メッキ後の日は、慎重に、MEAのリングの内側に培地（約900μL）の最終容量を追加します。 4-5週間、37℃の加湿CO 2雰囲気下（5％）での3次元培養を維持します。週に一度培地の半分を交換してください。
5.共焦点顕微鏡の取得
- ホルダーに顕微鏡のステージに、生物学的サンプルを修正。正しい帯域幅発光フィルターをキャプチャするイメージごとに、順番にPMTの（-0.3％）画像を取得することで、レーザー（アルゴン、496から555 nm）で、スキャン速度（400 Hz）を設定し、ゲインとオフセット飽和を回避し、信号対雑音比を増加させます。結果セクションは 、図4の画像を取得するために使用される値を報告します。
- Z -stackシーケンスの取得については、モミSTは、上部とサンプルの底層のz位置の値を選択し、取得を行うためのステップサイズを選択します。
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Representative Results
この実験手順では、関連する役割が3Dニューロンネットワークの成長のための機械的な足場を定義するマイクロビーズで再生され、図1A及びBは、マイクロビーズの配置を表示する（40±2μmの公称直径;の認定平均直径平面で42.3±1.1ミクロン）。このような構造の特殊性は、マイクロビーズが自発的にコンパクト六角形の幾何学（ 図1BおよびC）を定義する自己集合するということです。そのように生成足場は、神経突起と細胞体の代謝交換のための十分な大きさの隙間空間のための一貫性のある成長表面を保証します。このマイクロビーズ寸法は、間質間隔と最後の神経密度のための合理的な妥協点であることが判明しています。 PDMS構造体が「理想的な」シリンダを再現し、かつコンパクトな六方晶構造の影響因子（HPF）が0.74に等しいので、ビーズの最大数（40の直径ことを考慮81; PDMS制約内に含まれるm）は、約100,000、各層あたり約6,000マイクロビーズに対応するです。プロトコルの項で説明したように、これらのマイクロビーズは、接着因子（例えば、ラミニン及びポリ-D-リジン）で前処理されています。この手順では、ニューロンはマイクロビーズに付着することが保証されます。 図1Dは、3ニューロンが40ミクロンの直径を有するマイクロビーズに結合されている例を示しています。
神経回路網のための足場を作成するために使用されるマイクロビーズの1イメージ図。 （A、B）は、膜の挿入物を有するマルチウェルプレートの表面にマイクロビーズの単層の2つの例。（C）マイクロビーズは、重力下で沈降し、自発的に2D六角形のアレイに組み立てます。第1層は完全に、他のビーズが添加されているパックされると、ビルド同じ六角形の対称性を有する第二の注文した層をる。マイクロビーズのさらなる添加は、パックされた3次元アセンブリの構築をもたらしました。マイクロビーズ間の自由空間が神経突起と細胞体によって満たされている。（D）三ニューロンは以前に接着因子（ラミニンおよびポリ-D-リジン）で調整し、単一マイクロビーズの表面に固定されている。 表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
MEAの活性領域を持つマイクロビーズとニューロンのインタフェースは、 図2AおよびBに示されている金型を用いて実現エラストマー制約（ 図2C）、に起因するものである。 図2Aは、レイアウト 、選択した寸法を示します。 MEAの活性領域は、MEA基板（ 図2Dに、図2CのPDMS構造を結合させることによって区切られています）。このように、ニューロンは、MEAの活性電極領域に付着することを余儀なくされています。その後、付着したニューロンを有するガラスマイクロビーズのスタックは、この第一層上に収容される。 図2Dは 、PDMS構造の役割を明確に理解することができる最終的な構成の断面図を示します。 PDMS構造で区切られた空間は、マイクロビーズと神経細胞（ 図2Dの下部パネルで白色粉末）の混合物が含まれています。外部と内部のそれぞれ22.0と3.0ミリメートルの直径650ミクロンの高さ：PDMS構造は、以下の寸法と図2Bに示されている金型で構築された円筒の形状を有しています。金型はmask.The PDMS制約は、各使用後のPDMS減少の粘着性の性質以来、短い寿命を表示するエラストマーの抽出を容易にするための理想的な滑らかで抵抗材料を行いポリカーボネートとPTFEを使用して構築されました。通常、各PDMS構造は正常に三回使用することができます。
図3D神経回路網を構築するための2.材料。 （A）設計と物理的な制約を作成するために使用される金型の（B）の画像。グレー直径3mmシリンダ（C）に示される制約の穴に対応する。微小電極アレイ（MEA）の活性領域上に配置された（C）PDMS制約。このような物理的なバリアを使用することは、標的領域（約7mm 2）内のマイクロビーズを含み、3次元ネットワークの開発を制限することができる。（D）MEAシステムと制約の断面図。 （右上の顕微鏡によって示されている）マイクロビーズは、PDMS制約（下のパネル）で区切られた空間に充填されています。080fig2large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PDMSマスクを用いて、MEAの活性領域の閉じ込めた後、プロトコルは、ニューロンおよびマイクロビーズのアセンブリを実現するための主要なステップを説明する、 図3のパネルに描かれているように続けます。
最初の予備的ステップは、めっきが予め接着分子ラミニン及びポリ-D-リジン（ 図3A）で予め被覆したMEA表面にニューロンを解離することからなります。これは、2次元神経回路網は、MEAの活性領域に直接接着することが不可欠です：のみこれらの条件の下で、電気生理学的信号（ すなわち 、スパイクやバースト）の記録が可能です。プロトコルのこの最初の部分は、2Dニューロンをめっきするために使用される標準的な手順に対応します。 3Dシステムの実際の構成は、 図3B、C、およびDに示されています図3B）とのマルチウェルプレートに配置されています。その後、/μL600-700細胞（約100,000細胞）の細胞濃度を有する160μlの懸濁液を、マイクロビーズの単層（ 図3C）に分配されます。細胞がビード領域の半分を占めることができることを考えると、全体の自由表面は、75ミリメートル2です。マイクロビーズの単層上の細胞密度は、約1,500細胞/ mm 2です。膜と利用マルチウェルプレート33.6ミリメートル2の表面に多孔質膜を提示挿入します。多孔質膜の表面に等しいベース領域と40ミクロン（ビーズ径）の高さを有する仮想円筒の形状を考慮して30,000マイクロビーズからなる均一な層を膜挿入とマルチウェルプレートに接続されています。マイクロビーズおよびニューロンのように実現懸濁液をメンブレンインサートを有するマルチウェルプレート内部の約6〜8時間のままです。一度上記のステップが完了し、3次元ネットワークの構築を開始することができます。この時点で、ニューロンおよびマイクロビーズの混合物は、膜インサートを有するマルチウェルプレートから除去され、以前にPDMS制約（ 図3D）で定義された領域上にめっき2D神経ネットワーク上に置きました。この手順の間、ニューロンの約20〜30％の損失が膜外移転に起因する（I）、機械的な操作と、（ii）に発生します。制約（7.06ミリメートル2）、178.56ミクロン（ビーズの5層）の高さの底面積を考慮して、ビーズの5層で形成された理想的な円筒の体積の細胞の数を割ることによって、結果として得られる3D神経回路網の細胞密度は約80,000細胞/ mm 3です。
基本的な手順の図3.スケッチは、2Dと3Dの神経回路網を作成します。 （A）めっき OMEAの活性領域上のFニューロン。神経細胞の懸濁液は、以前に接着因子で調整し、PDMSの制約によって区切られ、MEAの表面にめっきされます。このステップでは実現することができます：ⅰ）MEAに結合された古典的な2D神経ネットワーク。 ⅱ）電気生理学的活性が記録されるから3次元ネットワークの第1層（B）マイクロビーズおよび（C）ニューロンは6-8時間後にメンブレンインサートを備えたマルチウェルプレートの表面に供給されている。（D）サスペンションニューロンおよびマイクロビーズの2次元ネットワークにメンブレンインサートを備えたマルチウェルプレートから移動されます。このステップの繰り返し数回、3次元構造が完了すると、緻密多層3D構造（E）を定義することを可能にする培地の液滴を加え、得られた構造は48時間インキュベーターに保存されている。（F ）48時間後、三次元培養は、完全培地の最終容量で再充填されます。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
第一の層が配置された後、同様の操作を充填した3次元集合を得るために繰り返されます。得られた三次元構造は、それ自体がコンパクトな構造で自己集合がマイクロビーズとニューロン（ 図4）の約5-8層からなることをコロイド結晶を規定する再編成します。全ての層が形成されると、3次元ネットワークは、媒体の300μlの（ 図3E）の低下を補充する必要があります。この段階では、膜電極アッセンブリに結合された三次元ネットワークが48時間インキュベーターに格納することができます。その後、1mlの培地は、MEA（ 図3F）のリングを充填するために添加されます。
全ての層が組み立てられた後、神経突起は、約80,000細胞/ mm 3の最終細胞密度に到達するマイクロビーズの足場上に成長します。それはnotic価値があります得られた値は、92,000細胞/ mm 3、マウス脳皮質ニューロン14の平均密度から遠くではないことる。
図4のディスプレイ直立共焦点顕微鏡を用いて捕獲さのMEAに結合された3次元ネットワークの三つの例。 図4Aに 、DIC（微分干渉コントラスト）画像は、MEAの表面に結合されたビーズの単層を示します。顕微鏡は透過PMTを取得した20.0 NA 0.50水目的と画像とカップリングさせ、顕微鏡とレーザーアルゴン（488nmの）に含まれています。写真は非常に明確に、電極の空間配置（黒点）とマイクロビーズの定期的な空間的構成を示しています。
図4Bでは、MAP-2のための免疫蛍光染色（赤信号）は、直接私の電極面に結合されたマイクロビーズの周りの樹状arborizationsとニューロンの細胞体の分布を表示します（黒コンタクトの有無を観察することができる）。 図4Bは、ステップサイズで 、Z-スタックシーケンス（108ミクロン）の最大投影は1.53ミクロンに等しいです。画像は40.0 NA 0.80水の目的で取得しました。励起は、アルゴンレーザー（488 nm）で、放射帯域幅の496nm-655nmです。
最後に、図4Cは、3D海馬文化の Z -stackシーケンス（187.79ミクロン）の最大投影を表示する（ステップサイズは2.27μmで す）。 Z -stackシーケンスは25.0 NA 0.95水の目的で取得されました。緑チャネルは、アルゴンレーザーの488nmおよび発光フィルタ帯域499nm-551nmを使用しました。赤チャネルは、543 nmのレーザー発光フィルタ帯域555nm-645nmを使用しました。チャンネルは、シーケンスモードで取得しました。成熟した有糸分裂後のニューロン（赤信号）およびGABA（緑信号、YELために発現ニューロンがNeuNのために標識されている場合、高度に相互接続されたネットワークが出てきます）マージが低いです。ギャバ抗体は、細胞体および神経突起の両方で抑制性ニューロンのための陽性を明らかにしました。
図4共焦点顕微鏡で撮像した3Dネットワークの3つの例。 MEA表面に結合されたビーズの単層を示す（A）DIC（微分干渉コントラスト）画像。電極（黒ドット）の空間レイアウトが観測可能である。地図-2（B）免疫蛍光染色（赤信号）は、樹状arborizationsと直接MEAの電極面に結合されたマイクロビーズの周りの神経細胞の細胞体の分布を表示します。（ C）のNeuNは、成熟した有糸分裂後のニューロン（赤信号）にマージ黄色GABA（緑信号、ために発現のための神経細胞が標識されている高度に相互接続ネットワークを表示する3D培養の Z -stackシーケンス（187.79ミクロン）の最大投影）。ギャバ抗体REV細胞体と神経突起の両方の抑制性ニューロンのための陽性ealed。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
三次元構造の存在は、ネットワークのダイナミクスを調節するかどうかを理解するために、そのように生成された電気生理学的活性は、参照モデルを表すMEAの上に成長させた従来の2D神経ネットワークと比較しました。
3D（左列）と2次元（右列）海馬培養によって示されるネットワークのダイナミクスとの間に、図5の比較それぞれの時間スケールでは（A：1200秒、B：300秒; C：60秒; D：10秒）。、 3Dアセンブリは、活動の署名の様々な表示（ すなわち 、短期および長期のネットワークバースト、ランダムスパイク活動、同期バースト）、2Dのものが高いだけ同期バーストでより顕著定型的活性を示すしている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5 は 、in vitroでの第四週に3次元（左パネル）と2次元（右パネル）海馬の文化に行われ、2つの代表的な実験の2ラスタプロットを示します。これらのプロットは、すべてのアクティブな電極上に記録されたネットワークの電気的活動を示す（すなわち、燃焼速度よりも大きく0.1スパイク/秒を有する電極）。
2Dネットワークのダイナミクスは、主にネットワークのバーストで構成準同期活性を示します。このダイナミックの署名はほとんど活動が記録されている期間が散在する記録チャンネルのほとんどを伴う同期イベントの存在である（右パネルを参照してください図5D）。この動作は、倍率下線の異なるレベルとして、異なる時間スケールで理解することができます。
3Dネットワークの場合、ネットワークダイナミクスの署名がすることを特徴と活動の広いレパートリーで構成されています：（I）より少ないグローバル同期、（ⅱ）よりランダムスパイク活動、（iii）の期間のサブネットワーク（ すなわち中、微小電極のサブセット）は、ネットワークバーストの発生により同期活動を提示します。 2Dのネットワークで観測されたものと同様の期間を持つネットワークバーストの存在があるが、より長いネットワークバーストもあります。また、ネットワークのバーストの持続時間は、より多くの変数も同様です。このような方法を用いて得られた緊急3D力学の完全なおよび定量的な特徴付けは、16に見出すことができます。また、予想されたように、3次元神経回路網を呈する重要な「ランダムスパイク 'と非同期バーストActivity。これらの3D構造によって生成されるダイナミックスの妥当性は、以下のように、いくつかの制御実験（例えば、裸のMEAとマイクロビーズ上に組み立て裸のマイクロビーズと3DネットワークのスタックとMEAに結合された2次元ネットワークの存在）で防音されています16で報告されました。
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Discussion
この作品では、3Dで構成された試験管プラ ットフォームにおける新規の実験では、ネットワークの電気生理学のためのMEAに結合された神経細胞培養は、提示された設計しました。 Z -軸に沿って神経突起伸長を可能にするための足場としてのマイクロビーズの使用は、平面MEAと統合するように調整されています。このように、有効かつ信頼性の高いin vitroでの3Dモデルで得られたマイクロシステムの結果は、緊急電気力学16を研究します。
MEA記録セットアップ
MEAデバイスは、電気活性組織から細胞外シグナルを測定することができる基板に埋め込まれた微小電極の統合アレイで培養室で構成されています。典型的な記録された信号は、（ すなわち、単一の超閾値電圧一つ以上の神経細胞の電気的活動を表す変動）及びバースト（すなわち、高度に充填されたスパイクのシーケンスは、多くの場合、occurrinスパイクから成り同時に複数のチャネルでグラム）。 MEAベースのシステムとの神経回路網の活動の記録は、（例えば、60チャンネルのMEAとの4時間の実験は、約15ギガバイトの記録を生成する）大量のデータを生成します。これは、特に長い記録を必要とする研究の場合には、データを処理し、分析するための効率的なツールを持っている必要性を暗示します。一般に、電気生理学的信号の記録は、ニューロンの培養物に直接外形質導入、及び電圧信号を取得することによって得られます。増幅およびフィルタリング段階の後、信号は10〜50 kHzでサンプリングされ、保存されます。生の信号は、ピーク検出、カスタム開発されたソフトウェアツールです。記録システムは、（1）MEA増幅器から成って、（2）A / D収集ボード、（3）記録用ソフトウェア、（d）の加熱システム及び温度制御装置を備えたパーソナルコンピュータは、蒸発防止（4）CO2雰囲気維持及びシステム。
ザ・3D神経回路網の建物は2つの重要な段階を経る：最初の1が膜挿入面とマルチウェルプレート上のビーズの正確な量の分布である、もう一つは、マルチウェルからの接着性ニューロンとマイクロビーズの懸濁液の転送であります膜とプレートに挿入します（I）2D神経回路網は、MEA（第1層）の活性領域上にプレーティング。 （ⅱ）既に定住層。この操作は、必要な層の数と同じ回数繰り返されるべきです。培養の最初の週の間に、神経突起の拡張機能の急速な成長は、異なる層に属するマイクロビーズを中心に行われます。ニューロンおよびマイクロビーズの間に密接な関係は、生物学的サンプルを安定化し、変更/メディアを交換し、それを損傷することを心配することなく、MEAアンプと電気的活動を記録するためにインキュベーターからそれを移動することができます。
ネット全体の電気生理学的活性ので、作業は、底層（ すなわち 、直接MEAに結合された1つ）から記録され、活性領域が従来の2Dネットワークによってカバーされなければなりません。他の層は、2Dの1つの上に段階的に追加され、長距離接続は、層の間で分散されます。実際には、他の層は、ニューロンおよびマイクロビーズの混合物をdeposingによって6-8時間後、2Dよりも追加されます。この時間窓の選択は、2次元層のいくつかのシナプス結合の形成を可能にし、あまりにも上位層への接続を確立する可能性を保証します。
二つの要因は、膜とのマルチウェルプレートの使用は、3Dネットワークを実現するために必要な挿入行います。（ⅰ）ニューロン及びマイクロビーズ存在する異なる沈降速度以来の、メンブレンインサートを有するマルチウェルプレートの使用は、マイクロビーズの上に神経細胞の均一な分布を保証します：平均して、各マイクロビーズは、ニューロンの同じ数によって囲まれていてもよいです。 （ⅱ）Byはメンブレンインサートを備えたマルチウェルプレートの弾性特性を利用し、神経細胞に結合されたマイクロビーズの溶液の逆流は、ポリカーボネート、マルチウェルのような固体表面を使用するよりも簡単です。
提示仕事はPautotによって提案されたアプローチに続き、15の共同研究者：その研究ではシリカビーズの使用が付着する神経細胞体のための十分な大きさの成長表面を提供し、そのプロセスは、成長し成熟し、シナプス前および後の専門分野を製造するために。ビーズの足場の使用に有効な代替案は、ハイドロゲルマトリックスまたは生物活性及びキトサンのような天然の生体高分子で構成された生分解性ビーズから来ています。キチンとその脱アセチル化誘導体は、キトサンは、非毒性、抗菌、生体適合性および生分解性生体高分子です。このような生分解プロセスの時定数は20,21 OUTGROWネットワークと互換性があります。
この研究では、参照WORを構成してもよいです体系的ネットワークのダイナミクスと構造の間の相互作用を研究するために、高度な3D神経モデル系の将来の発展のためにKです。短い時間では、デバイス22の新世代に3Dネットワーク構造を転送することができるように願っています。製造技術は50と350μmの間の可変高さのマイクロピラーの形で電極の製造を伴います。
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Acknowledgments
著者らは、閉じ込め構造とdottの開発に技術的なサポートのためにジョルジオCarliniに感謝します。原稿の徹底した見直しのためのオルネラLoBrutto。これらの結果につながる研究は、欧州連合（EU）の7 番目のフレームワークプログラムから資金提供を受けた（ICT-FET FP7 / 2007年から2013年、FETヤング探検方式）付与契約284772脳弓下（www.brainbowproject.eu）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
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