Introduction
Em bidimensionais redes neurais (2D) vitro acoplados a Micro-Arrays eletrodo (AMA) arethe modelo experimental padrão-ouro adotada para estudar a interação entre a dinâmica neuronal e a conectividade subjacente. Durante o desenvolvimento, os neurônios recriar redes complexas que mostrar bem actividade definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (ou seja, explosões, rajadas de rede, atividade spiking aleatório). AAM registrar a atividade eletrofisiológica de muitos sites (de dezenas a milhares de microeletrodos), permitindo uma investigação detalhada da dinâmica expressos no nível da rede. Além disso, a utilização de culturas dissociadas faz possibile para conceber-redes modificadas. É mais fácil de entender, desta forma as relações funcionais entre a atividade eletrofisiológica registradas e os parâmetros da organização em rede como densidade de células 3, grau de modularidade 4,5, presença de pop neuronal heterogêneoulations 6, etc. No entanto, todos os estudos in vitro em células cultivadas dissociados são baseados em redes neuronais 2D. Esta abordagem conduz a simplificações em relação à (, intrinsecamente 3-dimensional 3D) Sistema in vivo: (I) num modelo em 2D, somata e cones de crescimento se encontram achatados e a excrescência axónios-dendrites não pode propagar em todas as direcções 7. (ii) 2D in vitro redes exposição estereotipada dinâmica eletrofisiológicos dominadas por atividade envolvendo a maior parte dos neurônios da rede 8 estourando.
Recentemente, soluções diferentes têm sido desenvolvidos para permitir que a construção in vitro de 3D redes neuronais dissociadas. A idéia comum consiste na criação de um andaime onde os neurônios pode crescer de uma forma 3D. Um tal andaime pode ser realizada com géis de polímeros e matrizes sólidas porosas 9-13. Ao explorar as propriedades mecânicas dos polímeros, é possível incorporar no interior das células Tse estruturas através da definição de um bloco uniforme de culturas 3D de neurospheres 11. A principal característica dessa abordagem é a propriedade mecânica rígida das neuroesferas 9,12. No entanto, estes materiais têm porosidade limitada, e eles não garantem a migração de células no interior da matriz. Para superar esta desvantagem, uma possível solução consiste em cortar a matriz em módulos «unidade». Infelizmente, o tamanho e forma das partículas de diversidade pode dificultar a embalagem em estruturas em camadas regulares. Em 7 de Cullen e colaboradores projetou uma construção neuronal 3D feito de neurônios e / ou astrócitos dentro de um extracelular andaime bioativo à base de matriz. Um tecido neural, tais engenharia permitida em investigações in vitro para estudar e manipular as respostas neurobiológicas dentro de micro-ambientes 3D. Este modelo consistiu em neurónios e glia distribuídas por toda a matriz extracelular (ECM) e / ou andaimes de hidrogel (500-600 mm de espessura). Neste condition, uma viabilidade celular óptima (maior do que 90%) foi encontrado por plaqueamento de células, a uma densidade de cerca de 3,750 definitiva - 5000 células / mm3. Deve-se notar que um tal valor de densidade é muito menor do que a da condição in vivo, onde a densidade das células do córtex cerebral do rato é de cerca de 90.000 células / mm 3 14. Para superar esta limitação Pautot e colaboradores 15 realizado um sistema 3D in vitro em que a densidade celular e a conectividade de rede são controladas para se assemelhar a condições in vivo, permitindo simultaneamente imagens em tempo real da rede. Na prática, este método baseia-se no conceito de que os neurónios dissociados em cultura são capazes de crescer em microesferas de sílica. Estas contas fornecem uma superfície de crescimento grande o suficiente para os corpos celulares neuronais para aderir e para as suas arborizações para crescer, amadurecer, se estendem, e definem contatos sinápticos para outros neurônios. Este método explora as propriedades espontâneas de montagem de contas monodispersas para form 3D em camadas matrizes hexagonais contendo subconjuntos distintos de neurônios em diferentes camadas com conectividade restrita entre os neurônios em diferentes esferas. A densidade celular obtida com este método foi de cerca de 75.000 células / mm3.
Recentemente, nós adaptamos o método de Pautot aos MEA 16: os resultados obtidos mostram que a atividade eletrofisiológica 3D apresenta um repertório mais vasto de actividades do que aquela expressa por redes 2D. Culturas maduras 3D exibem uma dinâmica reforçada em que ambos estouro de rede e aleatória coexistem pico de atividade. Da mesma forma, Tang-Schomer e colaboradores 17 realizado um andaime poroso à base de proteína de seda que mantém uma cultura primária cortical in vitro para alguns meses, e registada a actividade electrofisiológica por meio de um eléctrodo de tungsténio.
Neste trabalho, os procedimentos experimentais para construir redes neuronais 3D acoplados aos MEA será descrito.
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Protocol
O protocolo experimental foi aprovado pelo Animal Care Legislação Europeia (2010/63 / UE), pelo Ministério da Saúde italiano, de acordo com o DL 116/1992 e pelas diretrizes da Universidade de Genova (Prot. N. 13.130, de maio 2011). Foram feitos todos os esforços para reduzir o número de animais para o projeto e para minimizar o seu sofrimento.
1. Preparação de Materiais e Suportes
- Construir o molde para construir as PDMS (Poly-dimetil-siloxano) de restrição por meio de um CNC (Controle Numérico Computadorizado) fresadora. Tal molde realiza-se em policarbonato com o cilindro central de politetrafluoroetileno (PTFE). Este material permite uma extracção fácil da máscara uma vez que o PDMS tem endurecido.
NOTA: O projeto do molde foi realizada por Computer-Aided-Design (CAD) e, em seguida, entregue ao fresadora CNC. - Prepara-se o elastómero PDMS. PDMS é um polímero orgânico. Ele é constituído por dois elementos, Um agente de cura e um polímero. Misture-os por uma relação de volume de 1:10, uma parte do agente de cura e nove partes de polímero. Colocar os dois componentes em uma placa de Petri, e inserir agitar a mistura na câmara de vácuo durante 10 minutos para eliminar as bolhas de ar. 3 g de PDMS são suficientes para uma restrição.
- Construa a restrição PDMS. Inserir o material PDMS no moldador e colocá-la no forno durante 30 minutos a 120 ° C. A restrição de PDMS tem a forma de um cilindro ideal, com um diâmetro interior e exterior de 22,0 e 3,0 mm, respectivamente, e uma altura de 650 microns.
- Um dia antes do chapeamento, casal a máscara para a área ativa das matrizes Micro-Eletrodo (AMA) por meio de uma pinça sob microscópio estereoscópico e esterilizar a máscara PDMS no forno a 120 ° C.
- Esterilizar a microesferas de vidro (diâmetro nominal de 40 ± 2 uM; diâmetro médio certificado de 42,3 ± 1,1 uM) em etanol a 70% durante 2 horas num frasco cónico e girar every 30 min para expor todas as micropérolas.
- Remover a solução de etanol a partir do frasco e lavar as micro-esferas duas vezes com água esterilizada.
- Condiciona-se a parte central da área de MEA delimitada pela máscara de PDMS (diâmetro igual a 3,0 mm) com 24 ul de solução de mistura de poli-D-lisina e laminina em 0,05 ug / ml.
- Revestir as micropérolas com proteínas de adesão, a laminina e poli-D-lisina na 0,05 ug / ml e deixá-los durante a noite na incubadora a 37 ° C, para se obter uma rede neuronal estável e de longa duração.
- Remover os factores de adesão, tanto a partir da superfície de vidro da MEA e para as microesferas de vidro. Aspirar aproximadamente 95% da solução de revestimento com uma pipeta e aplicar uma pequena volume- 24μl- de água estéril sobre a superfície do MEA. Aspirar novamente mais do que 95% da água e deixar secar o MEA sob o capô laminar durante 1 h antes do plaqueamento das células.
NOTA: No caso de micro-esferas em vez disso, o revestimento aspirarsolução e fazer uma primeira lavagem com água esterilizada e um segundo com o meio basal e seu complemento, tais como B27, a fim de condicionar a superfície do vidro, onde os neurónios vai ser revestida. Não deixe que as microesferas de seca. Deixar-los em suspensão no meio de cultura no interior do frasco. - Distribuir, por meio de uma pipeta -200 μl-, a suspensão de micro-esferas tratadas (cerca de 32.000) numa placa com múltiplas cavidades com pastilha de membrana (diâmetro de poro de 0,4 um), onde eles se auto-montam formando uma camada uniforme.
- Encher cada poço da membrana com 0,5 ml de meio e colocá-lo na incubadora (T = 37,0 ° C, CO2 = 5%) até que os neurónios estão prontos a ser revestida (3,2).
2. Dissecção de Embriões e dissociação de Tissue
- Ratas adultas Casa (200-250 g) a uma temperatura constante (22 ± 1 ° C) e humidade relativa (50%), sob um horário de luz-escuro normal (em 7 de luz-AM-7 PM) nabiotério. Certifique-se de que os alimentos e água estão disponíveis gratuitamente.
- Anestesiar um rato fêmea grávida após 18 dias de desenvolvimento (E18), utilizando 3% de isoflurano. Então, sacrificar o animal por deslocamento cervical.
- Remover hipocampos de cada embrião de rato e colocá-los em solução salina equilibrada de Hank gelada sem Ca2 + e Mg2 +. No dia 18 de desenvolvimento do hipocampo e do córtex tecidos são muito suaves e não precisa de ser cortado em pequenos pedaços. Mais detalhes podem ser encontrados 18,19.
- Dissociar o tecido em solução de 0,125% de tripsina / de Hank contendo 0,05% de DNAse, durante 18-20 min a 37 ° C.
- Remover a solução de sobrenadante com uma pipeta Pasteur e parar a digestão enzimática pela adição de meio com 10% de soro fetal de bovino (FBS) durante 5 min.
- Remover o meio com FBS e lavar uma vez com o meio com suplemento a, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml. Retirar novamente o meio com um pip Pasteurette e encher de novo com uma pequena quantidade (500 uL) de meio de crescimento com o seu complemento, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml.
- Dissociar o sedimento tecido mecanicamente com uma pipeta Pasteur estreita até uma suspensão leitosa de células é aparente. Não é necessário centrifugar a suspensão de células.
- Dilui-se a pequeno volume de suspensão de células com o meio de crescimento para se obter um volume final de 2,0 ml. Contagem celular a concentração obtida com uma câmara de hemocitómetro. Dilui-se esta concentração de 1: 5 a fim de se obter a concentração desejada de células de 600-700 células / mL.
3. celular Galvanização
- As células em placas a uma densidade de cerca de 2.000 células / mm 2 sobre a área activa do MEA, definidos pela restrição PDMS para criar uma rede neuronal 2D.
Nota: Cada hipocampo contém cerca de 5 x 10 5 células, (1 x 10 6 para um único embrião). Dissecar 6 embriões para obter um montante total de 6 x 106 células em 2 ml e uma concentração estimada de 3.000 células / mL. Dilui-se esta concentração de 1: 5 a fim de se obter a concentração de células desejada e placa cerca de 600-700 células / mL. Se a área de MEA delimitado pela restrição PDMS é de cerca de 7.065 mm 2, e o número total de células plaqueadas 600 células / mL x 24 mL = 14.400 células, a densidade final de 2.038 células / mm 2. - Colocar os dispositivos de MEA na incubadora humidificada com CO 2 ambiente (5%) a 37 ° C.
- Distribuir 160 ul da suspensão com uma concentração de células de 600-700 células / ul (cerca de 100.000 células) sobre a superfície da monocamada micropérolas posicionado no interior das placas com múltiplas cavidades para completar o passo preliminar para a construção de cultura tri-dimensional. Colocar as placas com múltiplas cavidades na incubadora humidificada com CO 2 ambiente (5%) a 37 ° C.
4. Construção 3D Rede Neuronal
- 6-8 horas após o plaqueamento, transferir a suspensão (micropérolas com neurónios) a partir das placas com múltiplas cavidades com muito cuidado dentro da área delimitada pela restrição PDMS usando uma pipeta para definir um volume de cerca de 30-40 ul. Depois de cada transferência, espere por cerca de meio minuto, para permitir que as microesferas para se juntam em uma estrutura compacta hexagonal.
- Uma vez que todas as camadas são depositadas e espontaneamente montado, encher com uma grande gota de cerca de 300 ul de meio do topo da área delimitada pela restrição de PDMS.
- Coloque a estrutura 3D acoplado a MEA na incubadora (T = 37,0 ° C, CO2 = 5%) durante 48 horas antes da adição de um volume final (cerca de 1 ml) de meio de cultura de crescimento com o seu complemento.
NOTA: Considere o número total de grânulos sobre as placas com múltiplas cavidades com pastilha de membrana (30,000) e o número de pérolas numa única camada sobre o dispositivo MEA (6000). A estrutura 3D resultante é composto por 5 camadas de microbeads e células. Levando-se em conta que a rede neuronal 3D não é geometricamente perfeita, a estrutura em 3D resultante pode ser composta de 5-8 camadas. - No dia após o plaqueamento, adicionar cuidadosamente o volume final do meio (cerca de 900 uL) no interior do anel de MEA. Manter as culturas 3D em uma atmosfera humidificada de CO 2 (5%) a 37 ° C durante 4-5 semanas. Substituir metade do meio de uma vez por semana.
5. Microscopia Confocal Aquisição
- Fixar as amostras biológicas para a fase de microscópio de um suporte. Defina a laser (argônio, 496-555 nm), a velocidade de verificação (400 Hz) em que adquirir a imagem, o ganho e offset (-0,3%), da PMT para cada imagem para capturar o filtro de emissão de banda correta e em ordem para evitar a saturação e para aumentar a relação sinal-ruído. A seção de resultados informa os valores utilizados para adquirir as imagens da Figura 4.
- Para a aquisição da sequência Z -stack, abetost selecionar, o valor da posição z da parte superior e a camada inferior da amostra, e em seguida, selecione o tamanho do passo para fazer a aquisição.
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Representative Results
. Neste procedimento experimental, um papel relevante é reproduzida pelas microesferas que definem o andaime mecânica para o crescimento da rede neuronal 3D Figuras visor 1A e B, o arranjo das microesferas (diâmetro nominal de 40 ± 2 uM; diâmetro médio autenticada 42,3 ± 1,1 uM) no plano. A particularidade deste tipo de estruturas é que micropérolas espontaneamente auto-montar definindo uma geometria hexagonal compacto (Figura 1B e C). O andaime assim gerado garante uma superfície de crescimento coerente para as neurites e um grande espaço intersticial suficiente para a troca metabólica dos corpos celulares. Esta dimensão micropérola revela-se um compromisso razoável para o espaçamento intersticial e densidade neuronal final. Considerando que a estrutura PDMS recria um cilindro "ideal", e uma vez que o factor de impacto estrutura hexagonal compacta (HPF) é igual a 0,74, o número máximo de grânulos (diâmetro de 4081; m) contido dentro do constrangimento PDMS é de cerca de 100.000, o que corresponde a cerca de 6000 micro-esferas por cada camada. Conforme explicado na Secção protocolo, estas microesferas são pré-condicionadas com os factores de adesão (por exemplo, a laminina e poli-D-lisina). Este procedimento garante que os neurónios aderir às micropérolas. A Figura 1D mostra um exemplo onde três neurónios são acoplados a uma micropérola com um diâmetro de 40 um.
Figura 1. Imagens das microesferas utilizadas para criar o andaime para a rede neuronal. (A, B) Dois exemplos de monocamadas de microesferas na superfície de uma placa com múltiplas cavidades com pastilha de membrana. (C) Microbeads resolvido de acordo com a força gravitacional e espontaneamente montados em matrizes hexagonais 2D. Uma vez que a primeira camada está totalmente embalada, outros grânulos são adicionados, construiring uma segunda camada ordenados com a mesma simetria hexagonal. Além disso a adição de micropérolas resultou na construção de um conjunto de 3D embalado. O espaço livre entre as micropérolas é preenchido por meio de processos neuronais e corpos celulares. (D) Três neurónios são ancoradas na superfície de uma única micropérola, previamente condicionado com factores de adesão (A laminina e Poli-D-Lisina). Por favor clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
O interface das micropérolas e neurónios com a área activa de um MEA é devido a uma restrição elastomérico (Figura 2C), realizado com o molde representado nas Figuras 2A e B. A Figura 2A mostra a disposição e as dimensões seleccionadas. A área activa do MEA é delimitado por acoplamento da estrutura da Figura 2C PDMS ao substrato MEA (Figura 2D). Desta forma, os neurónios são forçados a aderir à área do eléctrodo activo do MEA. Subsequentemente, as pilhas de vidro com microbead neurónios aderentes serão acomodados nesta primeira camada. A Figura 2D mostra uma secção transversal da configuração final, onde o papel da estrutura de PDMS pode ser claramente apreciada. O espaço delimitado pela estrutura PDMS contém a mistura de microesferas e neurónios (pó branco no painel inferior da Figura 2D). A estrutura PDMS tem a forma de um cilindro construído com o molde representado na Figura 2B com as seguintes dimensões: diâmetro externo e interno de 22,0 e 3,0 mm, respectivamente e altura de 650 microns. O molde foi construído usando policarbonato e PTFE que tornam um material suave e resistente ideal para facilitar a extracção da elastomérico restrições mask.The PDMS apresentar um tempo de vida mais curto, uma vez que as propriedades adesivas da diminuição PDMS após cada utilização. Tipicamente , Cada estrutura de PDMS pode ser utilizado com sucesso três vezes.
Figura 2. Materiais para construção da rede neuronal 3D. (A) Concepção e (B) imagem do molde usado para criar a restrição física. O cilindro de diâmetro 3 mm cinzento corresponde ao orifício de restrição representado em (C). (C) PDMS restrição colocado sobre a área activa de uma rede de micro-eléctrodo (MEA). O uso de uma barreira física tal permite a conter as microesferas dentro de uma área alvo (cerca de 7 mm 2) e limitar o desenvolvimento da rede 3D. (D) Secção transversal do sistema de MEA e restrição. Micropérolas (representadas pelo microscópio, no canto superior direito) são cheios para dentro do espaço delimitado pela restrição de PDMS (painel inferior)."Target =" _ blank 080fig2large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Após o confinamento de uma área activa da MEA através da máscara de PDMS, o protocolo continua como descrito nos painéis da Figura 3, que descreve os passos principais para realizar a montagem de neurónios e microesferas.
O primeiro passo consiste em preliminar chapeamento neurónios dissociados na superfície MEA que foi pré-revestido previamente com as moléculas de adesão laminina e poli-D-lisina (Figura 3A). É essencial que a rede neuronal 2D adere directamente para a área activa do MEA: somente sob essas condições, a gravação dos sinais electrofisiológicos (isto é, pontos e rajadas) é viável. Esta primeira parte do protocolo corresponde ao procedimento padrão utilizado para a chapa neurónios 2D. A construção do sistema 3D está representado nas figuras 3B, C, e D (Figura 3B); depois, uma suspensão de 160 ul com uma concentração de células de 600-700 células / ul (cerca de 100.000 células) é distribuído para o micropérolas monocamada (Figura 3C). Considerando-se que as células podem ocupar metade da zona do talão, a superfície livre total é de 75 mm 2. A densidade de células na monocamada de microsferas é de cerca de 1.500 células / mm 2. As placas com múltiplas cavidades utilizadas com inserção membrana apresentar uma membrana porosa com uma superfície de 33,6 mm 2. Ao considerar uma forma cilíndrica virtual com uma superfície de base igual à superfície da membrana porosa e uma altura de 40 um (diâmetro de pérola), uma camada uniforme, composto de 30.000 micro-esferas está acoplada às placas com múltiplas cavidades com pastilha de membrana. A suspensão assim que percebeu de microesferas e neurônios permanece por cerca de 6-8 horas no interior das placas com múltiplas cavidades com inserção da membrana. Uma vezos passos acima mencionados são concluídos, a construção da rede 3D pode começar. Neste momento, a mistura de neurónios e de micropérolas é removido das placas com múltiplas cavidades com pastilha de membrana e colocada na rede neuronal 2D previamente plaqueadas sobre a área definida pela restrição PDMS (Figura 3D). Durante este procedimento, uma perda de cerca de 20-30% dos neurónios ocorre devido a (i) manipulações mecânicas e (ii) para a transferência do lado de fora da membrana. Ao considerar a área da base da restrição (7,06 mm2) e uma altura de 178.56 uM (5 camadas de grânulos), e dividindo-se o número de células, o volume do cilindro ideal formado pelos 5 camadas de grânulos, o 3D resultante densidade celular rede neuronal é de cerca de 80.000 células / mm 3.
Figura 3. Esboço das etapas fundamentais para criar redes neuronais em 2D e 3D. (A) o chapeamentoneurônios F na área ativa de um MEA. A suspensão de neurónios é revestida sobre a superfície da MEA, previamente condicionado com factores de adesão e delimitado pela restrição de PDMS. Este passo permite realizar: i) uma rede neuronal 2D clássica acoplado a MEA; ii) a primeira camada de uma rede a partir da qual o 3D actividade electrofisiológica será gravado. (B) microesferas e (c) os neurónios são entregues à superfície das placas com múltiplas cavidades com pastilha membrana após 6-8 h. (D) A suspensão microesferas de neurónios e é movida a partir das placas com múltiplas cavidades com pastilha de membrana para a rede 2D. A repetição deste passo várias vezes permite definir um multi-camada de estrutura 3D densa. (E) Quando a estrutura em 3D é completado, uma gota de meio é adicionado, e a estrutura resultante é armazenada na incubadora durante 48 h. (F ) Após 48 horas, a cultura 3D é completamente cheio com o volume final do meio.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Uma vez que a primeira camada ter sido posicionada, a mesma operação é repetida para se obter um conjunto de 3D embalado. A estrutura 3D resultante se reorganiza a definição de um cristal coloidal que auto-monta em uma estrutura compacta composta de cerca de 5-8 camadas de microesferas e neurônios (Figura 4). Uma vez que todas as camadas são formadas, a rede 3D tem que ser recarregado com uma gota de 300 mL de meio (Figura 3E). Nesta fase, as redes 3D acoplados aos MEA pode ser armazenado na incubadora durante 48 horas. Depois disso, 1 ml de meio é adicionada para preencher o anel do MEA (Figura 3F).
Uma vez que todas as camadas terem sido montados, neurites crescer ao longo do andaime micropérola atingir uma densidade celular final de cerca de 80000 células / mm3. Vale a pena noticing que o valor obtido não está longe de 92.000 células / mm 3, a densidade neuronal média no rato córtex cerebral 14.
Figura 4 mostra três exemplos de redes 3D acoplados a AAM capturados por meio de microscopia confocal vertical. Na Figura 4A, a DIC (contraste de interferência diferencial) imagem mostra uma única camada de esferas acopladas à superfície da MEA; o microscópio foi acoplado com 20,0 NA 0,50 objectivo água e as imagens foram adquiridas com Transmissíveis PMT incluído ao microscópio e uma Argon Laser (488 nm). As imagens mostram muito claramente a disposição espacial dos eletrodos (pontos pretos) e da organização espacial regular das microesferas.
Na Figura 4B, uma coloração de imunofluorescência para Map-2 (sinal vermelho) mostra a distribuição de arborizações dendríticas e somata dos neurónios ao redor de micropérolas directamente acoplados ao plano do eléctrodo de MEUm (a presença dos contactos preto pode ser observado). A Figura 4B é uma projecção máxima de uma pilha sequência Z- (108 uM) com a dimensão do passo é igual a 1,53 uM. As imagens foram adquiridas com objetivo 40,0 NA 0,80 água; a excitação é Argon laser (488 nm), a largura de banda de emissão 496nm-655nm.
Finalmente, a Figura 4C mostra a projecção máxima de uma sequência -stack z (187,79 mm) de uma cultura do hipocampo 3D (tamanho do passo é de 2,27 uM). O -stack sequência z foi adquirida com objetivo 25,0 NA 0,95 água. Para o canal verde, foram utilizados um 488nm laser de argônio e uma emissão de banda filtro de 499nm-551nm. Para o canal vermelho, foram utilizados um laser nm 543 e uma emissão de banda filtro de 555nm-645nm. Os canais foram adquiridos em modo de sequência. A rede altamente interconectada emerge onde os neurônios são rotulados para NeuN expressa em neurônios pós-mitóticas maduros (sinal vermelho) e para Gaba (sinal verde, yelbaixo em merge). Anticorpo Gaba revelaram uma positividade para neurônios inibitórios tanto no somata e neurites.
Figura 4. Três exemplos de redes 3D capturados por microscopia confocal. (A), DIC (contraste de interferência diferencial) imagem que mostra uma única camada de esferas acopladas à superfície da MEA; a disposição espacial dos eléctrodos (pontos pretos) é observável. (B) A coloração por imunofluorescência para Map-2 (sinal vermelho) mostra a distribuição de arborizações dendríticas e somata dos neurónios ao redor de micropérolas directamente acoplados ao plano de eléctrodo do CME. ( C) a projeção máxima de um -stack sequência z (187,79 mm) de uma cultura 3D exibindo uma rede altamente interconectada onde os neurônios são rotulados para NeuN expressa em neurônios pós-mitóticas maduros (sinal vermelho) e para Gaba (sinal verde, amarelo em merge ). Gaba anticorpo revealed uma positividade para os neurônios inibitórios tanto no somata e neurites. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para compreender se a presença de uma estrutura 3D modula a dinâmica do sistema, a actividade electrofisiológica assim gerado foi comparado com redes neuronais 2D convencionais cultivadas sobre AAM, que representam o modelo de referência.
Figura 5. Comparação entre a dinâmica da rede exibidos pelo 3D (coluna da esquerda) e 2D (coluna da direita) culturas do hipocampo Em cada escala de tempo (A: 1.200 sec, B: 300 segundos; C: 60 s; D: 10 seg)., montagens em 3D exibir uma variedade de assinaturas de atividade (ie, rajadas de rede de curto e longo, spiking aleatóriaatividade, explosões sincronizadas), enquanto os 2D exibir uma atividade estereotipada mais pronunciada com rajadas só alta sincronizados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 5 mostra duas parcelas raster de duas experiências representativas realizadas em 3D (painéis da esquerda) e 2D (painéis da direita) cultura do hipocampo durante a quarta semana, in vitro. Estes gráficos mostram a actividade eléctrica da rede registada em todos os eléctrodos activos (isto é., Os eléctrodos com uma taxa de disparo superior a 0,1 espigas / s).
A dinâmica das redes 2D exibir uma actividade quase-síncrono composto principalmente por rajadas na rede. A assinatura dessa dinâmica é a presença de eventos sincronizados que envolvem a maioria dos canais de gravação, intercalados por períodos em que quase nenhuma atividade é gravadas (ver painel direito doA Figura 5D). Este comportamento pode ser apreciada em diferentes escalas de tempo, como os diferentes níveis de ampliação sublinhado.
No caso de uma rede em 3D, a assinatura da dinâmica de rede consiste de um repertório mais amplo de actividades caracterizado por: (i) sincronia menos global, (ii) a actividade de cravação mais aleatório, (iii) os períodos nos quais sub-redes (ou seja , um subconjunto de microeléctrodos) apresentar uma actividade mais síncrona com a ocorrência de rajadas de rede. Além disso, a duração das rajadas de rede é mais variável, bem como: há a presença de rajadas de rede com uma duração semelhante à observada nas redes 2D, mas também há rajadas de rede mais longos. Uma caracterização completa e quantitativa da dinâmica emergente 3D obtidos usando um destes métodos pode ser encontrado em 16. Como previsto, as exposições de rede neuronal 3D também um 'spiking aleatória "significativo e não síncronas Estourando umctivity. A plausibilidade da dinâmica gerados por essas estruturas 3D foram impermeabilizados com algum controle-experimentos (por exemplo, a presença de uma rede 2D acoplado a um MEA com uma pilha de micropérolas descalços e redes 3D montados para as microesferas com um MEA bare), como relatado em 16.
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Discussion
Neste trabalho, um romance experimental em plataforma vitro composta de 3D engenharia culturas neuronais acoplados a AAM para eletrofisiologia rede foi apresentada. A utilização de micropérolas como andaime para permitir que o crescimento neurítico ao longo da -axis Z foi adaptado para ser integrado com o MEA planar. Desta forma, os resultados obtidos micro-sistema em um modelo in vitro 3D válido e confiável para estudar a dinâmica eletrofisiológicos emergentes 16.
MEA gravação set-up
MEA dispositivos consistem numa câmara de cultura com uma disposição integrada de micro-eléctrodos incorporado-substrato capaz de medir sinais extracelulares de tecidos electroactivas. Os sinais gravados típicas consistem em picos (isto é, a variação de tensão único supra-limiar representando a actividade eléctrica de um ou mais neurónios) e rajadas (isto é, sequência de picos muito frequentemente embalados Occurring simultaneamente em vários canais). As gravações de atividade neuronal redes com sistemas baseados em MEA produzir grande quantidade de dados (por exemplo, um experimento de 4 horas com uma de 60 canais MEA produz um registro de cerca de 15 GB). Isto implica a necessidade de ter ferramentas eficientes para processar e analisar os dados, especialmente no caso de estudos que exigem gravações longas. Em geral, a gravação dos sinais electrofisiológicos é obtida por uma transdução extracelular directa com as culturas neuronais, e a aquisição de um sinal de tensão. Após uma etapa de amplificação e filtragem, os sinais são amostrados e armazenados 10-50 kHz. Os sinais brutos são então pico detectado por uma ferramenta de software personalizado desenvolvido. O sistema de registo consistiu em (1) do amplificador MEA, (2) do computador pessoal equipado com A / D de placa de aquisição, (3) o software de gravação, (d) o sistema de aquecimento e controlador de temperatura, (4) o CO2 atmosfera manutenção e evaporação de prevenção sistemas.
oconstrução da rede neuronal 3D passa através de dois passos críticos: a primeira é a distribuição da quantidade correcta de grânulos nas placas com múltiplas cavidades com superfície de inserção da membrana, a segunda é a transferência da suspensão de microesferas com neurónios aderentes da de poços múltiplos placas com inserção de membrana para: (i) a rede neuronal 2D banhado na área ativa do MEA (primeira camada); (ii) as camadas já assentadas. Esta operação deve ser repetida tantas vezes quanto o número de camadas necessárias. Durante a primeira semana de cultura, um rápido crescimento de extensões neuriticas tem lugar em torno das micropérolas pertencentes às diferentes camadas. A estreita conexão entre neurônios e microbeads estabiliza as amostras biológicas e permitir para movê-lo da incubadora para mudar / substituir o médio e para gravar com o amplificador de MEA a atividade elétrica sem se preocupar com a danificar.
Uma vez que a atividade eletrofisiológica de toda a redetrabalho só é registado a partir da camada inferior (isto é, a que está directamente acoplado ao MEA), a área activa deve ser coberta por uma rede 2D convencional. As outras camadas serão adicionados passo a passo sobre o 2D um, e conexões de longo alcance serão distribuídos entre as camadas. Praticamente, as outras camadas são adicionados 6-8 horas mais tarde do que o 2D um por depor a mistura de neurónios e microesferas. A escolha desta janela temporal, permite a formação de algumas conexões sinápticas na camada 2D, e garante a possibilidade de estabelecer ligações para as camadas superiores também.
Dois factores tornam a utilização de placas com múltiplas cavidades com membrana inserir necessário para realizar as redes 3D: (i) desde neurónios e microesferas apresentam velocidades de sedimentação diferentes, a utilização de placas com múltiplas cavidades com pastilha membrana garante uma distribuição uniforme dos neurónios no topo das micropérolas : em média, cada microesferas pode ser rodeado por o mesmo número de neurónios. (ii) By explorando as propriedades elásticas das placas com múltiplas cavidades com pastilha de membrana, a lavagem da solução de microesferas acopladas aos neurónios é mais fácil do que utilizando superfícies sólidas como policarbonato multi-poços.
O trabalho apresentado segue a abordagem proposta pela Pautot e colegas de trabalho 15: nesse estudo o uso de grânulos de sílica proporcionou uma superfície de crescimento grande o suficiente para os corpos celulares neuronais para aderir e para os seus processos para crescer, amadurecer e produzir especializações pré e pós-sinápticos . Uma alternativa válida para a utilização de contas de andaime vem de hidrogéis matrizes ou bioativo e contas biodegradáveis feitos de biopolímero natural, como a quitosana. A quitina e o seu derivado desacetilado, quitosano, são não-tóxicos, antibacteriana, biocompatíveis e biodegradáveis, biopolímeros. A constante de tempo de tal processo de biodegradação é compatível com a rede outgrow 20,21.
Este estudo pode constituir uma referência worK para o futuro desenvolvimento de sistemas avançados de modelo neuronal 3D para estudar sistematicamente a interação entre a dinâmica e estrutura de rede. Em um curto espaço de tempo, esperamos ser capazes de transferir a construção de rede 3D em uma nova geração de dispositivos 22. A técnica de fabricação envolve a produção de eléctrodos em forma de micro-pilares, numa alturas variáveis entre 50 e 350 um.
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Acknowledgments
Os autores agradecem Giorgio Carlini pelo apoio técnico no desenvolvimento da estrutura de confinamento e dott. Ornella LoBrutto para a revisão completa do manuscrito. A investigação conducente a estes resultados beneficiaram de financiamento do 7º Programa-Quadro da União Europeia (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET jovens exploradores esquema), sob acordo de subvenção 284.772 CÉREBRO BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
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