Introduction
In vitro todimensionale (2D) neurale netværk koblet til Micro-elektrode Arrays (MEA) arethe guld-standard forsøgsmodel vedtaget for at studere samspillet mellem neuronale dynamik og den underliggende tilslutningsmuligheder. Under udviklingen, neuroner genskabe komplekse netværk, der viser godt definedspatio-temporalpatternsof aktivitet 1,2 (dvs. brister, netværk brister, tilfældig spiking aktivitet). MEA registrere elektrofysiologiske aktivitet fra mange steder (fra ti til flere tusinde mikroelektroder), så en detaljeret undersøgelse af de udtrykte dynamik på nettet niveau. Hertil kommer, at anvendelsen af dissocierede kulturer gør possibile at designe manipuleret-netværk. Det er lettere at forstå på denne måde de funktionelle relationer mellem den indspillede elektrofysiologisk aktivitet og parametrene for netværket organisation som celledensitet 3, grad af modularitet 4,5, tilstedeværelsen af heterogene neuronal popgørelser 6, osv Men alle in vitro-undersøgelser af dissocierede dyrkede celler baseret på 2D neuronale netværk. Denne metode fører til overforenklinger med hensyn til (3D uløseligt 3-dimensional) systemet in vivo: (I) i en 2D model, somata og vækstkegler er fladtrykte og axoner-dendritter udvækst kan ikke spredes i alle retninger 7. (ii) 2D in vitro netværk udviser stereotype elektrofysiologiske dynamik domineret af sprængning aktivitet, der involverer de fleste af neuronerne i netværket 8.
For nylig er forskellige løsninger blevet udviklet for at muliggøre konstruktionen af in vitro 3D dissocierede neuronale netværk. Den almindelige opfattelse består i at skabe et stillads, hvor neuroner kan vokse i et 3D mode. En sådan et stillads kan realiseres med polymergeler og faste porøse matrixer 9-13. Ved at udnytte de mekaniske egenskaber af polymererne, er det muligt at indlejre celler inde THESe strukturer ved at definere en ensartet blok af 3D-kulturer af neurosfærer 11. Det vigtigste træk ved denne tilgang er den stive mekaniske ejendom neurosfærer 9,12. Imidlertid har disse materialer begrænset porøsitet, og de garanterer ikke cellemigration inde i matrixen. For at overvinde denne ulempe, en mulig løsning består i at skære matricen i »enhed« moduler. Desværre kunne størrelsen og formen mangfoldighed af partiklerne hæmmer pakning i regelmæssige lagdelte strukturer. I 7, Cullen et al designet en 3D neuronal konstruktion består af neuroner og / eller astrocytter inden for en bioaktiv ekstracellulær matrix-baseret stilladset. En sådan konstrueret neuralt væv tilladt i vitro undersøgelser for at studere og manipulere neurobiologiske reaktioner inden 3D mikro-miljøer. Denne model bestod af neuroner og glia fordelt i den ekstracellulære matrix (ECM) og / eller hydrogel stilladser (500-600 um). I denne condition, en optimal cellelevedygtighed (større end 90%) blev fundet ved udpladning celler ved en endelig tæthed på ca. 3.750 - 5.000 celler / mm3. Det skal bemærkes, at en sådan densitet værdi er langt lavere end den i in vivo-tilstand, hvor celledensiteten af musen hjernecortex er omkring 90.000 celler / mm3 14. For at overvinde denne begrænsning Pautot og medarbejdere 15 realiseret en 3D in vitro system, hvor celledensiteten og netværksforbindelse styres til at ligne in vivo betingelser samtidig med at imaging i realtid af nettet. I praksis er denne metode baseret på det koncept, at dissocierede dyrkede neuroner er i stand til at vokse på silica mikrokugler. Disse perler giver en vækst overflade stor nok til neuronale celle organer til at overholde og for deres arborizations at vokse, modne, udvide, og definerer synaptiske kontakter til andre neuroner. Denne metode udnytter spontane forsamling egenskaber af mono-spredte perler til at foRM 3D lagdelte sekskantede arrays indeholder særskilte undergrupper af neuroner på forskellige lag med indsnævret tilslutning blandt neuroner på forskellige perler. Den opnåede celledensitet med denne metode var omkring 75.000 celler / mm3.
Vi har for nylig tilpasset Pautot metode til MEA 16: de opnåede resultater viser, at 3D elektrofysiologiske aktivitet viser et bredere repertoire af aktiviteter end den udtrykkes af 2D netværk. 3D modne kulturer udviser en forbedret dynamik, hvor både netværk burst og tilfældige spike aktivitet sameksistere. Tilsvarende Tang-Schomer og medarbejdere 17 realiseret en silke proteinbaseret stillads porøst, som opretholder en primær kortikal kultur in vitro i nogle måneder og registreres den elektrofysiologiske aktivitet ved hjælp af en wolfram elektrode.
I dette arbejde, at de eksperimentelle procedurer opbygge 3D neuronale netværk koblet til MEA vil blive beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den eksperimentelle protokol blev godkendt af Europa-Animal Care Lovgivning (2010/63 / EU), af den italienske sundhedsministerium i henhold til DL 116/1992 og i retningslinjerne for universitetet i Genova (Prot. N. 13130, maj 2011). Blev gjort alt for at nedbringe antallet af dyr til projektet og for at minimere deres lidelser.
1. Fremstilling af materialer og støtter
- Konstruere formen at bygge PDMS (Poly-dimethyl-siloxan) constraint ved hjælp af en CNC (Computer Numerical Control) fræsemaskine. En sådan form er realiseret i polycarbonat med den centrale cylinder i polytetrafluorethylen (PTFE). Dette materiale giver en lettere udvinding af masken, når PDMS er hærdet.
BEMÆRK: Udformningen af støbeformen er blevet udført ved computerstøttet design (CAD) og derefter leveres til CNC fræsemaskine. - Forbered PDMS elastomer. PDMS er en organisk polymer. Det består af to elementer, En hærder og en polymer. Bland dem ved et volumenforhold på 1:10, en del af hærdningsmiddel og ni dele polymer. Sæt de to komponenter i en petriskål, ryste og indsætte blandingen i vakuumkammeret for 10 min for at fjerne luftbobler. 3 g PDMS er tilstrækkeligt, at en begrænsning.
- Konstruere PDMS tvang. Sæt PDMS materiale i molder og sætte det i ovnen i 30 minutter ved 120 ° C. PDMS begrænsning har form af en ideel cylinder med en ydre og en indre diameter på 22,0 og 3,0 mm, henholdsvis og en højde på 650 um.
- Dagen før udpladning par masken for det aktive område af mikroelektrode-arrays (MEA) ved hjælp af en pincet under et stereomikroskop, og der steriliseres PDMS maske i ovnen ved 120 ° C.
- Sterilisere mikrokugler i glas (nominel diameter på 40 ± 2 um; certificeret middeldiameter på 42,3 ± 1,1 um) i 70% ethanol i 2 timer i en konisk hætteglas og rotere every 30 min til at afsløre alle mikroperlerne.
- Fjerne ethanolen opløsningen fra hætteglasset og skyl mikroperler to gange med steriliseret vand.
- Betingende for centrale del af MEA område afgrænset af PDMS maske (diameter lig med 3,0 mm) med 24 pi blandet opløsning af poly-D-lysin og laminin 0.05 ug / ml.
- Coat mikroperlerne med adhæsionsproteiner, laminin og poly-D-lysin ved 0,05 ug / ml og efterlade dem natten over i inkubator ved 37 ° C, for at opnå en stabil og langvarig neuronal netværk.
- Fjern adhæsionsfaktorer både fra glasoverflade MEA og fra mikrokugler i glas. Aspirer ca. 95% af coatingopløsningen med en pipette og anvende en lille rumfang 24μl- sterilt vand på MEA overflade. Aspirer igen mere end 95% af vandet og lade MEA tør under laminar hood i 1 time før udpladning af cellerne.
BEMÆRK: I tilfælde af mikroperler stedet, aspireres belægningenopløsning og gøre en første vask med steriliseret vand og en anden med det basale medium og tillægget såsom B27, med henblik på at konditionere glasoverfladen, hvor neuroner vil blive belagt. Lad ikke mikroperlerne tørre. Lad dem i suspension i dyrkningsmediet inde i hætteglasset. - Distribuere, ved hjælp af en pipette -200 μl-, suspensionen af behandlede mikroperler (ca. 32.000) på en flerbrøndsplade med membran insert (porediameter 0,4 um), hvor de vil selvorganisere dannelse af et ensartet lag.
- Fyld hver brønd af membranen med 0,5 ml medium og sætte det i inkubatoren (T = 37,0 ° C, CO2 = 5%), indtil neuronerne er klar til at blive belagt (3.2).
2. Dissektion af embryoner og Dissociation af væv
- House voksne hunrotter (200-250 g) ved en konstant temperatur (22 ± 1 ° C) og relativ fugtighed (50%) under en almindelig lys-mørke skema (lys-on fra 07:00 til 19:00) idyreanlæg. Sørg for, at mad og vand er frit tilgængelige.
- Bedøver en gravid kvindelig rotte efter 18 dages udvikling (E18) ved hjælp af 3% isofluran. Derefter ofre dyret ved cervikal dislokation.
- Fjern hippocampi fra hver rotte embryo og placere dem i iskold Hanks balancerede saltopløsning uden Ca 2+ og Mg 2+. På dag 18 af udviklingsprojekter hippocampus og cortex væv er meget bløde og behøver ikke at blive skåret i små stykker. Yderligere oplysninger kan findes 18,19.
- Dissocierer vævet i 0,125% trypsin / Hanks opløsning indeholdende 0,05% DNAse for 18-20 minutter ved 37 ° C.
- Fjern supernatanten med en Pasteur-pipette og stoppe enzymatisk fordøjelse ved tilsætning af medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 5 minutter.
- Fjern mediet med FBS og vask en gang med medium med tillægget hertil 1% L-glutamin, gentamicin 10 ug / ml. Fjern mediet igen med en Pasteur pipette og fyld den igen med en lille mængde (500 pi) vækstmedium med supplement, 1% L-glutamin, gentamicin 10 ug / ml.
- Dissociere vævspellet mekanisk med en smal Pasteur-pipette, indtil en mælkeagtig suspension af celler er tydelig. Det er ikke nødvendigt at centrifugere cellesuspensionen.
- Fortynd lille volumen af cellesuspension med vækstmedium til opnåelse af et slutvolumen på 2,0 ml. Tæl opnåede cellulære koncentration med et hæmocytometer kammer. Fortynd denne koncentration på 1: 5 med henblik på at opnå den ønskede koncentration af 600-700 celler / ul celle.
3. Celleudpladning
- Plate celler ved en densitet på ca. 2.000 celler / mm 2 på det aktive område af MEA, defineret af PDMS begrænsning at skabe en 2D neuronal netværk.
BEMÆRK: Hver hippocampus indeholder omkring 5 x 10 5 celler (1 x 10 6 for en enkelt embryo). Dissekere 6 fostre for at få et samlet beløb på 6 x 106 celler i 2 ml, og en estimeret koncentration på 3.000 celler / ul. Fortynd denne koncentration på 1: 5 med henblik på at opnå den ønskede cellekoncentration og plade omkring 600-700 celler / ul. Hvis MEA område afgrænset af PDMS begrænsning er ca. 7,065 mm2, og det samlede antal udpladede celler 600 celler / pi x 24 pi = 14.400 celler, den endelige densitet på 2.038 celler / mm2. - Placer MEA enheder i inkubatoren med befugtet CO2-atmosfære (5%) ved 37 ° C.
- Fordel 160 pi af suspensionen med en cellekoncentration på 600-700 celler / pi (ca. 100.000 celler) på overfladen af mikroperler monolag placeret inde i flerbrøndsplader at fuldføre indledende skridt til opførelse af tre-dimensionelle kultur. Sæt flerbrøndsplader i inkubator med befugtet CO2-atmosfære (5%) ved 37 ° C.
4. 3D neuronal Network Byggeri
- 6-8 timer efter udpladning overføre suspensionen (mikroperler med neuroner) fra flerbrøndsplader meget nøje inde i området afgrænset af PDMS begrænsning ved hjælp af en pipette indstillet til et volumen på ca. 30-40 ul. Efter hver overførsel, vent cirka et halvt minut, for at tillade mikroperlerne til selv samles i en sekskantet kompakt struktur.
- Når alle lagene er deponeret og spontant samles, påfylde et stort fald på omkring 300 pi medium toppen af området afgrænset af PDMS begrænsning.
- Sæt 3D-strukturen er koblet til MEA i inkubator (T = 37,0 ° C, CO2 = 5%) i 48 timer før tilsætning af et slutvolumen (ca. 1 ml) vækstmedium kultur med sin supplement.
BEMÆRK: Overvej det samlede antal perler på flerbrøndsplader med membran indsatsen (30.000) og antallet af perler på et enkelt lag på MEA enheden (6000). Den resulterende 3D-struktur er sammensat af 5 lag af microbeads og celler. Under hensyntagen til, at 3D-neuronale netværk ikke er geometrisk perfekt, kunne den resulterende 3D-struktur består af 5-8 lag. - Dagen efter udpladning tilsættes forsigtigt det endelige volumen af mediet (ca. 900 pi) inde i MEA ring. Opretholde 3D kulturer i en befugtet CO2-atmosfære (5%) ved 37 ° C i 4-5 uger. Erstat halvdelen af mediet gang om ugen.
5. Konfokal mikroskopi Acquisition
- Fastgør biologiske prøver på scenen af mikroskopet i en holder. Sæt laseren (Argon, 496-555 nm), scanningen hastighed (400 Hz) ved at hente billedet, gevinsten og offset (-0,3%) af PMT for hvert billede for at fange den rigtige båndbredde emissionsfilter og for for at undgå mætning og at øge signal-støj-forholdet. Resultatafsnittet rapporterer værdier, der anvendes til at erhverve billeder af figur 4.
- Til erhvervelse af z -stack sekvens, granst vælger, værdien af z positionen af den øverste og nederste lag af prøven, og vælg derefter trin størrelse til at gøre købet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. I denne eksperimentelle fremgangsmåde, er en relevant rolle spillet af mikroperler, der definerer den mekaniske stillads for væksten af 3D neuronal netværk Figur 1A og B display arrangementet af mikroperler (nominel diameter på 40 ± 2 um; certificeret middeldiameter 42,3 ± 1,1 um) i planet. Det er kendetegnende for sådanne strukturer er, at mikroperler spontant samle definerer en kompakt sekskantet geometri (figur 1B og C). Den således genererede stillads garanterer en konstant vækst overflade til neuritter og en tilstrækkelig stor interstitielle rum for metabolisk udveksling af cellelegemer. Denne mikroperle dimension viser sig at være et rimeligt kompromis for interstitiel afstand og endelig neuronal tæthed. I betragtning af at PDMS strukturen genskaber en "ideel" cylinder, og siden den kompakte sekskantede struktur impact factor (HPF) er lig med 0,74, det maksimale antal af perler (diameter på 4081 m) er indeholdt i PDMS begrænsning er omkring 100.000, hvilket svarer til ca. 6.000 mikroperler pr hvert lag. Som forklaret i protokollen afsnit, disse mikroperler prækonditioneret med adhæsionsfaktorer (dvs., laminin og poly-D-lysin). Denne procedure sikrer, at neuroner overholde de mikroperler. Figur 1D viser et eksempel, hvor tre neuroner er koblet til en mikroperle med en diameter på 40 um.
Figur 1. Billeder af mikroperler anvendes til at skabe stilladset for den neuronale netværk. (A, B) To eksempler på monolag af mikrokugler på overfladen af en flerbrøndsplade med membran insert. (C) Microbeads fast under tyngdekraft og spontant samles i 2D sekskantede arrays. Når det første lag er fuldt pakket, andre perler tilsættes, byggeing et andet beordrede lag med den samme sekskantede symmetri. Yderligere tilsætning af mikroperler resulterede i konstruktionen af en pakket 3D montage. Det frie rum mellem mikroperlerne er fyldt af neuronale processer og celle organer. (D) tre neuroner er forankret på overfladen af en enkelt mikroperle, der tidligere condition med vedhæftning faktorer (Laminin og Poly-D-lysin). Klik her for at se en større version af dette tal.
Interfacing af mikroperler og neuroner med det aktive område af en MEA skyldes en elastomer begrænsning (figur 2C), realiseret med afbildet i figur 2A og B formen. Figur 2A viser layout og de valgte dimensioner. Det aktive område af MEA er afgrænset ved kobling af PDMS struktur figur 2C til MEA substrat (figur 2D). På denne måde er neuroner tvunget til at holde sig til den aktive elektrode område af MEA. Efterfølgende vil de glas mikroperle stakke med vedhængende neuroner rummes på denne første lag. Figur 2D viser et tværsnit af den endelige konfiguration, hvor rolle PDMS struktur kan klart værdsat. Rummet afgrænset af PDMS strukturen indeholder blandingen af mikrokugler og neuroner (hvidt pulver i det nederste panel af figur 2D). PDMS struktur har form af en cylinder bygget med den i figur 2B med følgende dimensioner formen: ydre og indre diameter på 22,0 og 3,0 mm henholdsvis og højde 650 um. Formen blev bygget ved hjælp af polycarbonat og PTFE, som gør en ideel glat og modstandsdygtigt materiale for at fremme ekstraktion af det elastomere mask.The PDMS begrænsninger vise en kortere levetid, da de klæbrige egenskaber af PDMS fald efter hver brug. Typisk Hver PDMS struktur med held kan anvendes tre gange.
Figur 2. Materialer til at bygge 3D-neuronale netværk. (A) Design og (B) billede af formen anvendes til at skabe den fysiske begrænsning. Den grå 3 mm diameter cylinder svarer til hullet i afbildet i (C) tvang. (C) PDMS begrænsning placeret på det aktive område af en mikroelektrode Array (MEA). Anvendelsen af en sådan fysisk barriere gør det muligt at indeholde mikroperler inden for et målområde (ca. 7 mm 2) og begrænse udviklingen af 3D-netværket. (D) Snit af MEA, og tvang. Mikroperler (skildret af mikroskopet i øverste højre hjørne) fyldes ind i rummet afgrænset af PDMS begrænsning (nederste panel).080fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter fødslen af det aktive område af MEA ved hjælp af PDMS masken, fortsætter protokollen som afbildet i panelerne i figur 3, der beskriver de vigtigste trin at realisere samlingen af neuroner og mikroperler.
Det første indledende skridt består i plating dissocierede neuroner på MEA overflade, der tidligere var præ-coatet med adhæsionsmolekylerne laminin og poly-D-lysin (figur 3A). Det er vigtigt, at 2D neuronale netværk klæber direkte til det aktive område af MEA: kun under disse betingelser, registrering af de elektrofysiologiske signaler (dvs., pigge og brister) er mulig. Denne første del af protokollen svarer til den standard, der anvendes til plade 2D neuroner. Selve konstruktionen af 3D-system er afbildet i figur 3B, C og D (figur 3B); Bagefter er en 160 pi suspension med en cellekoncentration på 600-700 celler / pi (ca. 100.000 celler) fordelt på mikroperler monolag (figur 3C). I betragtning af at cellerne kan optage halvdelen af vulstområdet, den totale frie overflade er 75 mm2. Celledensiteten på mikroperler monolag er omkring 1.500 celler / mm 2. De anvendte flerbrøndsplader med membran insert præsentere en porøs membran med en overflade på 33,6 mm2. Ved at betragte et virtuelt cylindrisk form med en base areal svarende til den porøse membran overflade og en højde på 40 um (perlediameter), er et ensartet lag bestående af 30.000 mikroperler koblet til flerbrøndsplader med membran insert. Den således realiserede suspension af mikrokugler og neuroner forbliver i ca. 6-8 timer inde i flerbrøndsplader med membran insert. Nårde førnævnte trin er afsluttet, kan konstruktionen af 3D-netværket starter. På dette tidspunkt er blandingen af neuroner og mikroperler fjernet fra flerbrøndsplader med membran indsatsen og anbringes på 2D neuronal net tidligere udpladet på området defineret af PDMS begrænsning (figur 3D). Under denne procedure opstår et tab på ca. 20-30% af neuroner på grund af (i) mekaniske manipulationer og (ii) til overførsel uden membranen. Ved at betragte grundarealet begrænsningen (7,06 mm2) og en højde på 178.56 um (5 lag af perler), og dividere antallet af celler med volumenet af det ideelle cylinder er dannet af 5 lag af perler, den resulterende 3D neuronal netværk celledensitet er ca. 80.000 celler / mm3.
Figur 3. Skitse af de grundlæggende trin for at oprette 2D-og 3D neuronale netværk. (A) Belægning of neuroner af det aktive område af en MEA. Suspensionen af neuroner udplades på MEA overflade, der tidligere konditioneret med adhæsionsfaktorer og afgrænset af PDMS begrænsning. Dette trin gør det muligt at realisere: i) en klassisk 2D neuronal netværk koblet til MEA; ii) det første lag af en 3D-net, hvorfra elektrofysiologiske aktivitet bliver registreret. (B) mikrokugler af glas og (C) neuroner leveres til overfladen af flerbrøndsplader med membran insert efter 6-8 timer. (D) Suspensionen af neuroner og mikroperler flyttes fra de flerbrøndsplader med membran indsats til 2D-netværket. Gentagelsen af dette trin flere gange gør det muligt at definere et tæt flerlaget 3D struktur. (E) Når 3D-strukturen er afsluttet, tilsættes en dråbe medium og den resulterende struktur er lagret i inkubatoren i 48 timer. (F ) Efter 48 timer er 3D kultur helt fyldes med det endelige volumen af mediet.Klik her for at se en større version af dette tal.
Når det første lag er blevet placeret, er den samme operation gentages for at opnå en pakket 3D ensemble. Den resulterende 3D-struktur reorganiserer sig definerer en kolloid krystal, selv-samler i en kompakt konstruktion består af ca. 5-8 lag af mikrokugler og neuroner (Figur 4). Når alle lagene dannes, 3D netværket skal fyldes med en dråbe 300 pi medium (figur 3E). På dette stadium kan 3D netværk koblet til MEA opbevares i inkubatoren i 48 timer. Efter dette, er 1 ml medium tilsat for at fylde ringen af MEA (figur 3F).
Når alle lagene er blevet samlet, neuritter vokse i mikroperlen stillads nå frem til en endelig celletæthed på omkring 80.000 celler / mm3. Det er værd noticing, at den opnåede værdi er ikke langt fra 92.000 celler / mm 3, den gennemsnitlige densitet i neuronal musen hjernecortex 14.
Figur 4 viser tre eksempler på 3D-netværk koblet til multilaterale miljøaftaler fanget ved hjælp af konfokal mikroskopi oprejst. I figur 4A, DIC (differential interferens kontrast) billede viser et enkelt lag af perler koblet til MEA overflade; mikroskopet blev kombineret med 20,0 NA 0,50 vand målsætning og billederne blev erhvervet med Transmitteret PMT inkluderet i mikroskop og en Laser Argon (488 nm). Billederne viser meget tydeligt den rumlige udformning af elektroderne (sorte prikker) og den regelmæssige rumlige organisering af mikroperlerne.
I figur 4B, en immunfluorescensfarvning for kort-2 (rødt signal) viser fordelingen af dendritiske arborizations og somata af neuroner omkring mikroperler koblet direkte til elektrodefladen ME(Kan observeres tilstedeværelsen af de sorte kontakter) A. Figur 4B er en maksimal projektion af en z-stak-sekvens (108 um) med trinstørrelsen lig med 1,53 um. Billeder blev erhvervet med mål 40,0 NA 0,80 vand; excitation er Argon Laser (488 nm), emission 496nm båndbredde-655nm.
Endelig viser figur 4C den maksimale projektion af en z -stack sekvens (187,79 um) af en 3D hippocampalt kultur (trin størrelse er 2,27 um). Den z -stack sekvens blev erhvervet med objektive 25,0 NA 0,95 vand. For grønne kanal, blev en Argon laser 488 nm og en emission filter båndbredde 499nm-551nm anvendes. For rød kanal, blev en 543 nm laser og en emission filter båndbredde 555 nm-645 nm anvendes. Kanalerne blev erhvervet i sekvenstilstand. En meget sammenkoblede net opstår, hvor neuroner er mærket til NeuN udtrykt i modne post-mitotiske neuroner (rødt signal) og for Gaba (grønt signal, yellavt merge). Gaba antistof afslørede en positivitet for inhiberende neuroner både i somata og neuritter.
Figur 4. Tre eksempler på 3D-netværk fanget af konfokal mikroskopi. (A) DIC (differential interferens kontrast) billede, der viser et enkelt lag af perler koblet til MEA overflade; den rumlige udformning af elektroderne (sorte prikker) kan observeres. (B) Immunfluorescensfarvning for kort-2 (rødt signal) viser fordelingen af dendritiske arborizations og somata af neuroner omkring mikroperler koblet direkte til elektrodefladen af MEA. ( C) Maksimal projektion af en z -stack sekvens (187,79 um) i en 3D-kultur viser en meget sammenhængende netværk, hvor neuroner er mærket til NeuN udtrykt i modne post-mitotiske neuroner (rødt signal) og for Gaba (grønt signal, gul i merge ). Gaba antistof revealed en positivitet for hæmmende neuroner både i somata og neuritter. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at forstå, om tilstedeværelsen af en 3D-struktur modulerer netværket dynamik, blev så genereret elektrofysiologiske aktivitet sammenlignet med konventionelle 2D neuronale netværk vokset multilaterale miljøaftaler, som repræsenterer referencemodellen.
Figur 5. Sammenligning mellem Netværksdynamik udvises af 3D (venstre kolonne) og 2D (højre kolonne) hippocampuskulturer På hvert tidsskala (A: 1.200 sec, B: 300 sek C: 60 sek; D: 10 sek)., 3D-samlinger vise en lang række underskrifter fra aktivitet (dvs. korte og lange netværk brister, tilfældige spikingaktivitet, synkroniserede brister), mens 2D dem vise en mere udtalt stereotyp aktivitet med kun høj synkroniserede brister. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 viser to raster plots af to repræsentative forsøg udført på en 3D (venstre paneler) og 2D (højre paneler) hippocampus kultur under den fjerde uge in vitro. Disse plots viser den elektriske aktivitet i netværket optaget på alle aktive elektroder (dvs.., Elektroder med en skudhastighed på mere end 0,1 spikes / s).
Dynamikken i 2D netværk vise en kvasi-synkron aktivitet består hovedsageligt af netværk brister. Undertegnelsen af denne dynamik er tilstedeværelsen af synkroniserede begivenheder, der involverer de fleste af optagelsen kanaler afbrudt af periode, hvor næsten ingen aktivitet registreres (se højre panel afFigur 5D). Denne adfærd kan blive værdsat på forskellige tidsskalaer, som de forskellige niveauer af forstørrelse understregning.
I tilfælde af en 3D-netværk, underskrivelsen af netværket dynamik består af en bredere repertoire af aktiviteter kendetegnet ved: (i) mindre global synkroni, (ii) mere tilfældige spiking aktivitet, (iii) perioder, hvor sub-netværk (dvs. , en delmængde af mikroelektroder) fremlægge en mere synkron aktivitet med forekomsten af netværk brister. Desuden er varigheden af nettet brister mere variabel samt: Der er tilstedeværelsen af netværk bursts med en varighed svarende til den observeret i 2D net, men der er også længere netværk brister. En fuldstændig og kvantitativ karakterisering af emergent 3D dynamik opnået ved anvendelse af en sådan metoder kan findes i 16. Som forventet, 3D neuronale netværk udviser også en betydelig 'tilfældig spiking «og ikke-synkron sprængning activity. Sandsynligheden af den dynamik, der genereres af disse 3D strukturer er blevet sikret med nogle kontrol-eksperimenter (fx tilstedeværelse af en 2D-netværk er koblet til en MEA med en stak nøgne mikrokugler og 3D netværk samles på mikroperlerne med en nøgen MEA), som rapporteret i 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde, en roman eksperimentel in vitro-platform består af 3D manipuleret neuronale kulturer koblet til multilaterale miljøaftaler for netværk elektrofysiologi er blevet præsenteret. Anvendelsen af mikroperler som stillads for at tillade neuritiske udvækst langs z-aksen er skræddersyet til at blive integreret med den plane MEA. På denne måde at de opnåede mikro-system resulterer i en gyldig og pålidelig in vitro-3D-model studere emergente elektrofysiologiske dynamik 16.
MEA optagelse opsætning
MEA enheder består af en kultur kammer med en integreret opstilling af substrat-embedded mikro-elektroder i stand til at måle ekstracellulære signaler fra elektro-aktive væv. De typiske optagne signaler består af pigge (dvs. enkelt overtærskel- spændingsvariation repræsenterer den elektriske aktivitet i et eller flere neuroner) og byger (dvs. sekvensen af højt pakket pigge ofte occurring samtidigt på flere kanaler). Optagelserne af neuronal netværk aktivitet med MEA-baserede systemer producerer store mængder data (f.eks, en 4 timers eksperiment med en 60 kanaler MEA producerer en rekord på omkring 15 GB). Dette indebærer nødvendigheden af at have effektive værktøjer til at bearbejde og analysere data, navnlig i tilfælde af forsøg, der skal lange optagelser. Generelt er optagelsen af de elektrofysiologiske signaler opnået ved en direkte ekstracellulær transduktion med de neuronale kulturer, og købet af en spænding signal. Efter en forstærkning og filtrering fase, er samplede signaler 10-50 kHz og lagres. De rå signaler er derefter peak-detekteres af en specialudviklet software-værktøj. Optagelsen Systemet bestod af (1) MEA forstærker, (2) personlig computer udstyret med A / D-erhvervelse bord, (3) optagelse software, (d) varmeanlægget og temperatur controller, (4) CO2 atmosfære-vedligeholdelse og fordampning-forebyggelse systemer.
Denbygning af 3D neuronal netværket går gennem to kritiske trin: den første er fordelingen af den korrekte mængde perler på flerbrøndsplader med membran insert overflade, den anden er overførslen af suspensionen af mikroperler med vedhængende neuroner fra flerbrøndspladens plader med membran indsatsen til: (i) 2D neuronal netværk udpladet på det aktive område af MEA (første lag); (ii) allerede bosatte lag. Denne operation bør gentages så mange gange som antallet af nødvendige lag. I den første uge af kultur, en hurtig vækst i neuritiske udvidelser sker omkring mikroperler tilhører på de forskellige lag. Den tætte forbindelse mellem neuroner og mikroperler stabiliserer biologiske prøver og lad at flytte den fra inkubatoren til at ændre / udskifte mediet og registrere med MEA forstærker den elektriske aktivitet uden at bekymre sig om at beskadige det.
Da elektrofysiologisk aktivitet af hele nettetarbejdet registreret fra det nederste lag (dvs., den ene direkte koblet til MEA), det aktive areal skal være dækket af en konventionel 2D netværk. De andre lag vil blive tilføjet trin for trin over 2D én og langtrækkende forbindelser vil blive spredt blandt lagene. I praksis er de andre lag tilføjes 6-8 timer senere end 2D én efter afsætte blandingen af neuroner og mikroperler. Valget af denne tidsvindue tillader dannelsen af et par synaptiske forbindelser i 2D lag og garanterer muligheden for at etablere forbindelser til de øvre lag også.
To faktorer gør brug af flerbrøndsplader med membran indsætte nødvendigt at realisere 3D net: (i) da neuroner og mikroperler har forskellige sedimentation hastigheder, anvendelse af flerbrøndsplader med membran insert garanterer en ensartet fordeling af neuroner på toppen af mikroperler : i gennemsnit, kan hver mikrokugle være omgivet af det samme antal neuroner. (ii) By udnytte de elastiske egenskaber af de flerbrøndsplader med membran insert, at returskylning af opløsningen af mikroperler koblet til neuroner er lettere end anvendelse af faste overflader som polycarbonat multi-brønde.
Den præsenterede arbejde følger den tilgang, foreslået af Pautot og medarbejdere 15: i denne undersøgelse brugen af silicaperler forudsat en vækst overflade stor nok til neuronale celle organer til at overholde, og for deres processer til at vokse, modne og producere præ- og postsynaptiske specialiseringer . En gyldig alternativ til anvendelsen af perler scaffold kommer fra hydrogeler matricer eller bioaktive og biologisk nedbrydelige perler, der består af naturlige biopolymer som chitosan. Chitin og dets deacetylerede derivat, chitosan, er ikke-toksiske, antibakterielle, biokompatible og bionedbrydelige biopolymerer. Tidskonstanten for et sådant bionedbrydning er kompatibel med netværket vokser 20,21.
Denne undersøgelse kan udgøre en reference work for den fremtidige udvikling af avancerede 3D-neuronal modelsystemer til systematisk at studere samspillet mellem netværk dynamik og struktur. I en kort tid, vi håber at kunne overføre 3D-netværk konstruktion på en ny generation af enheder 22. Fremstillingen teknik involverer fremstilling af elektroder i form af mikro-søjler i en variabel højde mellem 50 og 350 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Giorgio Carlini for den tekniske support i udviklingen af indespærring struktur og DOTT. Ornella LoBrutto for gennemgribende revision af manuskriptet. Den forskning, der fører til disse resultater, er udført med støtte fra Den Europæiske Unions 7. rammeprogram (ikt-FET FP7 / 2007-2013 FET Young Explorers ordning) under tilskudsaftale 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).
