Introduction
In vitro bidimensionali (2D) reti neurali accoppiati a micro-elettrodi Array (MEA) arethe modello sperimentale gold-standard adottato per studiare l'interazione tra la dinamica neuronale e la connettività di base. Durante lo sviluppo, i neuroni ricreano reti complesse che mostrano ben definedspatio-temporalpatternsof attività 1,2 (cioè, scoppi, esplosioni di rete, attività chiodare casuale). MEA registrare l'attività elettrofisiologica da molti siti (da decine a migliaia di microelettrodi), che consente un esame approfondito delle dinamiche espresse a livello di rete. Inoltre, l'uso di colture dissociate rende possibile progettare-reti ingegnerizzati. È facile capire in questo modo le relazioni funzionali tra dell'attività elettrofisiologica registrata ei parametri dell'organizzazione network come densità cellulare 3, grado di modularità 4,5, presenza di eterogenea pop neuronaleulations 6, ecc, tuttavia, tutti gli studi in vitro su cellule in coltura dissociate sono basati su reti neuronali 2D. Questo approccio porta a semplificazioni rispetto al sistema in vivo (intrinsecamente 3-dimensionale, 3D): (i) in un modello 2D, somata e coni di crescita sono appiattite e la conseguenza assoni-dendriti non può diffondere in tutte le direzioni 7. (ii) 2D in vitro reti mostra stereotipata dinamiche elettrofisiologiche dominati da scoppio attività che comporti la maggior parte dei neuroni della rete 8.
Recentemente, diverse soluzioni sono state sviluppate per consentire la costruzione di in vitro 3D dissociato reti neuronali. L'idea comune consiste nella creazione di un ponteggio in cui i neuroni possono crescere in modo 3D. Tale impalcatura può essere realizzato con gel polimerici e solidi matrici porose 9-13. Sfruttando le proprietà meccaniche dei polimeri, è possibile incorporare all'interno delle cellule these strutture definendo un blocco omogeneo di culture 3D di neurosfere 11. La caratteristica principale di questo approccio è la proprietà meccanica rigida delle neurosfere 9,12. Tuttavia, questi materiali hanno limitato la porosità, e non garantisce la migrazione delle cellule all'interno della matrice. Per ovviare a questo inconveniente, una possibile soluzione consiste nel tagliare la matrice in moduli 'unità'. Purtroppo, la dimensione e la forma delle particelle diversità potrebbe ostacolare l'imballaggio in strutture stratificate regolare. In 7, Cullen e colleghi hanno progettato un costrutto neuronale 3D fatta di neuroni e / o astrociti all'interno di un ponteggio a matrice extracellulare bioattivi. Tale tessuto neurale progettata consentito in Studi in vitro per studiare e manipolare le risposte neurobiologiche all'interno di micro-ambienti 3D. Questo modello consisteva di neuroni e glia distribuiti in tutta la matrice extracellulare (ECM) e / o ponteggi idrogel (spessore 500-600 micron). In questo condition, una vitalità cellulare ottimale (superiore al 90%) è stato trovato placcando le cellule ad una densità finale di circa 3.750 - 5.000 cellule / mm3. Si deve notare che tale valore di densità è di gran lunga inferiore a quello nella condizione in vivo, in cui la densità delle cellule della corteccia cerebrale mouse è circa 90.000 cellule / mm 3 14. Per superare questa limitazione Pautot e collaboratori 15 realizzato un sistema 3D in vitro dove la densità cellulare e la connettività di rete sono controllati per assomigliare in condizioni in vivo consentendo imaging in tempo reale della rete. In pratica, questo metodo si basa sul concetto che dissociata neuroni in coltura sono in grado di crescere su microsfere di silice. Queste perle forniscono una superficie di crescita abbastanza grande per i corpi cellulari neuronali di aderire e per i loro arborizzazioni per crescere, maturare, estendere, e definire contatti sinaptici con altri neuroni. Questo metodo sfrutta le proprietà di assemblaggio spontanei di perline monodisperse a form 3D strati array esagonale contenenti sottoinsiemi distinti di neuroni su livelli diversi con connettività vincolata tra i neuroni in diverse sfere. La densità cellulare ottenuta con questo metodo è stato di circa 75.000 cellule / mm3.
Recentemente, abbiamo adattato il metodo di Pautot di MEA 16: i risultati ottenuti mostrano che l'attività elettrofisiologica 3D presenta un repertorio più ampia di attività rispetto a quello espresso dalle reti 2D. Culture mature 3D mostrano una dinamica rafforzata cui sia scoppio rete e casuale coesistono attività picco. Analogamente, Tang-Schomer e collaboratori 17 realizzato uno scaffold poroso a base di proteina di seta che mantiene una cultura corticale primaria in vitro per alcuni mesi, e registrato l'attività elettrofisiologica mediante un elettrodo di tungsteno.
In questo lavoro, le procedure sperimentali per costruire reti neuronali 3D accoppiati a MEA sarà descritta.
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Protocol
Il protocollo sperimentale è stato approvato dalla cura degli animali Legislazione Europea (2010/63 / UE), dal Ministero della Salute italiano, secondo la DL 116/1992 e dalle linee guida dell'Università di Genova (Prot. N. 13130, maggio 2011). Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre il numero di animali per il progetto e per ridurre al minimo la loro sofferenza.
1. Preparazione dei Materiali e supporti
- Costruire lo stampo per costruire le PDMS (Poly-dimetil-silossano) vincolo mediante un CNC (Computer Numerical Control) fresatrice. Tale stampo è realizzato in policarbonato con cilindro centrale in politetrafluoroetilene (PTFE). Questo materiale consente una più facile estrazione della maschera quando il PDMS è indurito.
NOTA: Il design dello stampo è stata eseguita da Computer-Aided-Design (CAD) e poi consegnato alla fresatrice CNC. - Preparare l'elastomero PDMS. PDMS è un polimero organico. Esso è composto da due elementi, Un agente di indurimento e un polimero. Mescolare con un rapporto volumetrico 1:10, una parte di agente indurente e nove parti di polimero. Mettere i due componenti in una capsula di Petri, agitare e inserire la miscela nella camera a vuoto per 10 minuti per eliminare le bolle d'aria. 3 g di PDMS sono sufficienti per un vincolo.
- Costruire il vincolo PDMS. Inserire il materiale PDMS nel modellatore e metterla in forno per 30 minuti a 120 ° C. Il vincolo PDMS ha la forma di un cilindro ideale, con un diametro esterno e interno di 22,0 mm e 3,0, rispettivamente, e un'altezza di 650 micron.
- Il giorno prima della placcatura, coppia la maschera per l'area attiva delle matrici Micro-elettrodo (MEA) per mezzo di una pinzetta allo stereomicroscopio e sterilizzare la maschera PDMS in forno a 120 ° C.
- Sterilizzare le microsfere di vetro (diametro nominale di 40 ± 2 micron; diametro medio certificato di 42,3 ± 1,1 micron) in etanolo al 70% per 2 ore in un flaconcino conica e ruotare every 30 minuti per esporre tutte le microsfere.
- Rimuovere la soluzione di etanolo dal flaconcino e lavare le microsfere due volte con acqua sterilizzata.
- Condizionare la parte centrale della zona MEA delimitata dalla maschera PDMS (diametro pari a 3,0 mm) con 24 ml di soluzione mista di poli-D-lisina e laminina a 0,05 ug / ml.
- Rivestire le microsfere con proteine di adesione, laminina e Poly-D-lisina a 0,05 mg / ml e lasciare per una notte in incubatore a 37 ° C, per ottenere una rete neuronale stabile e duratura.
- Rimuovere i fattori di adesione sia dalla superficie del vetro del MEA e dalle microsfere di vetro. Aspirare circa il 95% della soluzione di rivestimento con una pipetta e applicare una piccola volume- 24μl- di acqua sterile sulla superficie MEA. Aspirare ancora più del 95% dell'acqua e lasciare che il MEA secca sotto il cofano laminare per 1 ora prima della placcatura cellule.
NOTA: Nel caso di microsfere invece, aspirare il rivestimentosoluzione e fare un primo lavaggio con acqua sterilizzata e un secondo con il mezzo basale e il suo supplemento come B27, per condizionare la superficie di vetro in cui verranno piastrate neuroni. Non lasciate che le microsfere asciugare. Lasciarli in sospensione nel mezzo di coltura all'interno del flacone. - Distribuire, mediante una pipetta -200 μl-, la sospensione di microsfere trattate (circa 32.000) su una piastra multipozzetto con inserto di membrana (diametro dei pori 0,4 micron) in cui si auto-assemblano formare uno strato uniforme.
- Riempire ciascun pozzetto della membrana con 0,5 ml di terreno e metterlo in incubatrice (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) fino a quando i neuroni sono pronte per essere placcato (3.2).
2. Dissezione degli embrioni e la dissociazione di tessuto
- Casa ratti femmina adulti (200-250 g) ad una temperatura costante (22 ± 1 ° C) e umidità relativa (50%) sotto una pianificazione luce-buio normale (light-on 7 AM-7 PM) nelstabulario. Assicurarsi che il cibo e l'acqua sono liberamente disponibili.
- Anestetizzare un topo femmina incinta dopo 18 giorni di sviluppo (E18) utilizzando 3% isoflurano. Poi, sacrifica l'animale per dislocazione cervicale.
- Rimuovere ippocampi da ogni embrione di ratto e metterli in una soluzione salina bilanciata ghiacciata di Hank senza Ca 2 + e Mg 2+. Al giorno 18 di ippocampo di sviluppo e dei tessuti della corteccia sono molto morbidi e non hanno bisogno di essere tagliato in piccoli pezzi. Ulteriori dettagli possono essere trovati 18,19.
- Dissociare il tessuto 0,125% di soluzione di tripsina / Hank contenente lo 0,05% di DNAsi per 18-20 minuti a 37 ° C.
- Rimuovere la soluzione surnatante con una pipetta Pasteur e fermare la digestione enzimatica aggiungendo mezzo con siero fetale bovino 10% (FBS) per 5 min.
- Rimuovere il mezzo con FBS e lavare una volta con il mezzo con il suo complemento, 1% L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml. Rimuovere di nuovo il supporto con un pip Pasteurette e riempire nuovamente con una piccola quantità (500 ml) di mezzo di crescita con il suo complemento, 1% L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml.
- Dissociare il precipitato di tessuto meccanicamente con una pipetta Pasteur stretta fino una sospensione lattiginosa di cellule è evidente. Non è necessario centrifugare la sospensione cellulare.
- Diluire il piccolo volume di sospensione cellulare con il terreno di coltura per ottenere un volume finale di 2,0 ml. Contare il concentrazione cellulare ottenuto con una camera emocitometro. Diluire la concentrazione a 1: 5 per ottenere la concentrazione desiderata di cellule 600-700 cellule / microlitro.
3. cellule placcatura
- Cellule piastra ad una densità di circa 2.000 cellule / mm 2 sulla zona attiva del MEA, definiti dal vincolo PDMS per creare una rete neuronale 2D.
NOTA: Ogni ippocampo contiene circa 5 x 10 5 cellule, (1 x 10 6 per un singolo embrione). Sezionare 6 embrioni per ottenere un importo totale di 6 x 106 cellule in 2 ml, e una concentrazione stimata di 3.000 cellule / microlitro. Diluire la concentrazione a 1: 5 per ottenere la concentrazione desiderata e piastra di cellule circa 600-700 cellule / ml. Se l'area MEA delimitata dal vincolo PDMS è di circa 7.065 mm 2, e il numero totale di cellule piastrate 600 cellule / ml x 24 ml = 14.400 cellule, la densità finale di 2.038 cellule / mm 2. - Posizionare i dispositivi MEA nel incubatore umidificato con CO2 nell'atmosfera (5%) a 37 ° C.
- Distribuire 160 microlitri della sospensione con una concentrazione cellulare di 600-700 cellule / microlitro (circa 100.000 cellule) sulla superficie del monostrato microsfere posizionato all'interno delle piastre multipozzetto per completare la fase preliminare per la costruzione della cultura tridimensionale. Mettere le piastre a pozzetti multipli nell'incubatore con umidificata CO 2 nell'atmosfera (5%) a 37 ° C.
Edilizia 4. 3D Rete neuronale
- 6-8 ore dopo la placcatura, trasferire la sospensione (microsfere con neuroni) dalle piastre multipozzetto attentamente all'interno dell'area delimitata dal vincolo PDMS utilizzando una pipetta impostato per un volume di circa 30-40 ml. Dopo ogni trasferimento, attendere circa mezzo minuto, per consentire le microsfere di auto-assemblarsi in una struttura compatta esagonale.
- Una volta che tutti gli strati sono depositati e spontaneamente assemblati, riempire con una grande goccia di circa 300 ml di mezzo della parte superiore dell'area delimitata dal vincolo PDMS.
- Mettere la struttura 3D accoppiato al MEA in incubatore (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) per 48 ore prima di aggiungere un volume finale (circa 1 ml) di crescita terreno di coltura con il suo supplemento.
NOTA: Si consideri il numero totale di perline su piastre multipozzetto con inserto membrana (30.000) e il numero di perle su un singolo strato sul dispositivo MEA (6000). La struttura 3D risultante è composta da 5 strati di microbeads e cellule. Tenendo conto che la rete neuronale 3D non è geometricamente perfetta, la struttura 3D risultante potrebbe essere composta di 5-8 strati. - Il giorno dopo la placcatura, aggiungere con attenzione il volume finale del mezzo (circa 900 ml) all'interno dell'anello MEA. Mantenere le culture 3D in un umidificata CO 2 nell'atmosfera (5%) a 37 ° C per 4-5 settimane. Sostituire la metà del mezzo una volta alla settimana.
5. Microscopia confocale Acquisizione
- Fissare i campioni biologici alla fase del microscopio in un supporto. Posizionare il laser (Argon, 496-555 nm), la velocità di scansione (400 Hz) di acquisire l'immagine, il guadagno e offset (-0,3%) di PMT per ogni immagine di catturare il filtro per le emissioni di banda corretta e in ordine per evitare la saturazione e per aumentare il rapporto segnale-rumore. La Sezione I risultati sono riportati i valori utilizzati per acquisire le immagini di figura 4.
- Per l'acquisizione del z impili sequenza, abetest selezionare, il valore della posizione z della parte superiore e lo strato inferiore del campione, e quindi selezionare il passo di rendere l'acquisizione.
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Representative Results
. In questa procedura sperimentale, un ruolo importante è giocato dalle microsfere che definiscono l'impalcatura meccanica per la crescita della rete neuronale 3D Figure 1A e B mostra la disposizione delle microsfere (diametro nominale di 40 ± 2 micron; diametro medio certificata di 42.3 ± 1.1 micron) nel piano. La particolarità di tali strutture è che microsfere spontaneamente auto-assemblano definendo una geometria esagonale compatto (Figura 1B e C). L'impalcatura così generata garantisce una superficie di crescita costante per neuriti e un ampio spazio interstiziale sufficiente per lo scambio metabolico dei corpi cellulari. Questa dimensione microbead rivela un ragionevole compromesso per la spaziatura interstiziale e densità neuronale finale. Considerando che la struttura PDMS ricrea un cilindro "ideale", e poiché il fattore compatto impatto struttura esagonale (HPF) è pari a 0,74, il numero massimo di perline (diametro di 4081; m) contenuto all'interno del vincolo PDMS è di circa 100.000, che corrisponde a circa 6.000 microsfere per ogni strato. Come spiegato nella sezione Protocollo, queste microsfere sono pre-condizionata, con i fattori di adesione (ad esempio, laminina e poli-D-lisina). Questa procedura garantisce che i neuroni aderiscono alle microsfere. Figura 1D mostra un esempio dove tre neuroni sono accoppiate ad un microbead con un diametro di 40 micron.
Figura 1. Le immagini delle microsfere utilizzate per creare l'impalcatura per la rete neuronale. (A, B) Due esempi di monostrati di microperle sulla superficie di una piastra multipozzetto con inserto membrana. (C) Microbeads depositato sotto la forza gravitazionale e spontaneamente assemblati in matrici esagonali 2D. Una volta che il primo strato è completamente pieno, vengono aggiunti altri branelli, costruirezione un secondo strato ordinato aventi la stessa simmetria esagonale. Ulteriore aggiunta di microsfere portato alla realizzazione di un assieme 3D imballato. Lo spazio libero tra le microsfere è riempito da processi neuronali e corpi cellulari. (D) tre neuroni sono ancorati sulla superficie di un singolo microbead, precedentemente condizionata con fattori di adesione (laminina e Poly-D-lisina). Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'interfacciamento delle microsfere e neuroni con l'area attiva di un MEA è dovuta ad un vincolo elastomerico (Figura 2C), realizzato con lo stampo rappresentato nelle figure 2A e B. Figura 2A mostra la disposizione e le dimensioni selezionate. L'area attiva del MEA è delimitato accoppiando la struttura di figura 2C PDMS al substrato MEA (Figura 2D). In questo modo, i neuroni sono costretti ad aderire alla superficie dell'elettrodo attivo del MEA. Successivamente, le pile microsfere di vetro con neuroni aderenti saranno sistemati su questo primo strato. Figura 2D mostra una sezione trasversale della configurazione finale, dove il ruolo della struttura PDMS può essere chiaramente apprezzato. Lo spazio delimitato dalla struttura PDMS contiene la miscela di microsfere e neuroni (polvere bianca nel pannello inferiore della Figura 2D). La struttura PDMS ha la forma di un cilindro realizzato con lo stampo illustrato nella Figura 2B con le seguenti dimensioni: diametro esterno ed interno di 22,0 mm e rispettivamente 3.0 e un'altezza di 650 micron. Lo stampo è stato costruito utilizzando policarbonato e PTFE che rendono un materiale liscio e resistente ideale per agevolare l'estrazione del elastomerico vincoli mask.The PDMS mostrano una vita più breve, poiché le proprietà adesive della diminuzione PDMS dopo ogni uso. Tipicamente , Ogni struttura PDMS può essere utilizzato con successo per tre volte.
Figura 2. Materiali per la costruzione della rete neuronale 3D. Immagine (A) Design e (B) dello stampo utilizzato per creare il vincolo fisico. Il cilindro 3 mm grigio diametro corrisponde al foro del vincolo rappresentato in (C). (C) PDMS vincolo posto sulla zona attiva di una matrice micro-elettrodo (MEA). L'utilizzo di una barriera fisica tale permette di contenere le microsfere all'interno di un'area di destinazione (circa 7 mm 2) e limitare lo sviluppo della rete 3D. (D) Sezione del sistema MEA e costrizione. Microsfere (rappresentate dal microscopio in alto a destra) sono riempiti nello spazio delimitato dal vincolo PDMS (pannello inferiore).080fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Dopo il confinamento della zona attiva del MEA mediante maschera PDMS, il protocollo continua come descritto nei pannelli di figura 3, che descrive i passi principali per realizzare l'assemblaggio dei neuroni e microsfere.
Il primo passo preliminare consiste nella placcatura dissociato neuroni sulla superficie MEA precedentemente prerivestita con le molecole di adesione laminina e Poly-D-lisina (Figura 3A). È essenziale che la rete neuronale 2D aderisce direttamente alla zona attiva del MEA: solo in queste condizioni, la registrazione dei segnali elettrofisiologici (cioè, chiodi e burst) è fattibile. Questa prima parte del protocollo corrisponde alla procedura standard utilizzato per placcare neuroni 2D. La costruzione attuale del sistema 3D è rappresentato nelle figure 3B, C, e D (Figura 3B); successivamente, una sospensione di 160 microlitri con una concentrazione cellulare di 600-700 cellule / microlitro (circa 100.000 cellule) viene distribuito sul microsfere monostrato (Figura 3C). Considerando che le cellule possono occupare metà della zona del tallone, la superficie totale è di 75 mm connessione 2. La densità delle cellule in monostrato microsfere è di circa 1.500 cellule / mm 2. Le piastre multipozzetto utilizzati con inserto membrana presentano una membrana porosa con una superficie di 33.6 mm 2. Considerando una forma cilindrica virtuale con una superficie di base pari alla superficie della membrana porosa e un'altezza di 40 micron (diametro tallone), uno strato uniforme composto di 30.000 microsfere è accoppiata alle piastre multipozzetto con inserto membrana. La sospensione così realizzato delle microsfere e neuroni rimane per circa 6-8 ore dentro le piastre a pozzetti multipli con inserto membrana. Una voltale suddette fasi vengono completati, la costruzione della rete 3D può iniziare. A questo punto, la miscela di neuroni e microperle viene rimosso dalle piastre multipozzetto con inserto di membrana e collocarlo nella rete neuronale 2D precedentemente placcato sull'area definita dal vincolo PDMS (Figura 3D). Durante questa procedura, una perdita di circa il 20-30% dei neuroni si verifica a causa di (i) manipolazioni meccaniche e (ii) per il trasferimento all'esterno della membrana. Considerando la superficie di base del vincolo (7.06 mm 2) e un'altezza di 178.56 micron (5 strati di perline), e dividendo il numero di cellule per il volume del cilindro ideale formata dai 5 strati di perline, 3D risultante neuronale densità delle cellule della rete è di circa 80.000 cellule / mm 3.
Figura 3. Disegno schematico dei passi fondamentali per creare reti neuronali 2D e 3D. (A) o placcaturaneuroni F sulla zona attiva di un MEA. La sospensione di neuroni è placcato sulla superficie MEA, precedentemente condizionata con fattori di adesione e delimitata dal vincolo PDMS. Questo passaggio consente di realizzare: i) una classica rete neuronale 2D accoppiata a MEA; ii) il primo strato di una rete 3D da cui verrà registrato l'attività elettrofisiologica. (B) microperle e (C) neuroni vengono consegnati alla superficie delle piastre multipozzetto con inserto membrana dopo 6-8 ore. (D) La sospensione di neuroni e microperle viene spostato dalle piastre a pozzetti multipli con inserto membrana alla rete 2D. La ripetizione di questo passaggio più volte permette di definire un multistrato struttura 3D densa. (E) Quando la struttura 3D è completata, viene aggiunta una goccia di soluzione, e la struttura risultante è memorizzata in incubatrice per 48 ore. (F ) Dopo 48 ore, la coltura 3D è completamente riempita con il volume finale del mezzo.Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Una volta che il primo strato è stato posizionato, la stessa operazione viene ripetuta per ottenere un insieme 3D imballato. La struttura 3D risultante riorganizza definendosi un cristallo colloidale che autoassembla in una struttura compatta formata da circa 5-8 strati di microperle e neuroni (Figura 4). Una volta formati tutti gli strati, la rete 3D deve essere riempito con una goccia di 300 ml di medium (Figura 3E). In questa fase, le reti 3D accoppiati a MEA possono essere memorizzati in incubatrice per 48 ore. Dopo di che, 1 ml di terreno viene aggiunta per riempire l'anello del MEA (Figura 3F).
Una volta che tutti gli strati sono stati assemblati, neuriti crescono sopra il patibolo microbead raggiungendo una densità cellulare finale di circa 80.000 cellule / mm3. Vale la pena di noticing che il valore ottenuto non è lontano da 92.000 cellule / mm 3, la densità media neuronale nel cervello di topo corticale 14.
Figura 4 mostra tre esempi di reti 3D accoppiati a MEA catturate mediante microscopia confocale verticali. In Figura 4A, la DIC (contrasto interferenziale differenziale) immagine mostra un singolo strato di perline accoppiati alla superficie MEA; il microscopio è stato accoppiato con 20,0 NA 0.50 obiettivo acqua e le immagini sono state acquisite con trasmessa PMT incluso per il microscopio e un Laser ad Argon (488 nm). Le immagini mostrano chiaramente la disposizione spaziale degli elettrodi (punti neri) e l'organizzazione spaziale regolare delle microsfere.
Nella Figura 4B, una colorazione immunofluorescenza per Map-2 (segnale rosso) mostra la distribuzione di arborizations dendritiche e somata dei neuroni intorno microsfere direttamente accoppiati al piano elettrodo MEA (la presenza dei contatti nere può osservare). Figura 4B è una proiezione massima di una sequenza pila Z- (108 micron), con la dimensione del passo pari a 1,53 micron. Le immagini sono state acquisite con l'obiettivo 40,0 NA 0,80 acqua; l'eccitazione è Argon laser (488 nm), la larghezza di banda di emissione 496nm-655nm.
Infine, la Figura 4C mostra la sporgenza massima di un z impili sequenza (187,79 micron) di una cultura dell'ippocampo 3D (passo è da 2.27 micron). Il impili sequenza di z è stata acquisita con l'obiettivo 25,0 NA 0.95 acqua. Per il canale verde, sono stati utilizzati un 488nm laser ad argon e un'emissione banda del filtro 499nm-551nm. Per il canale rosso, sono stati utilizzati un laser 543 nm e un'emissione banda del filtro 555nm-645nm. I canali sono stati acquisiti in modalità sequenza. Una rete altamente interconnessa emerge dove i neuroni sono etichettati per NeuN espressi in neuroni maturi post-mitotico (segnale rosso) e per Gaba (segnale verde, yela basso contenuto di merge). Anticorpo Gaba ha rivelato una positività per i neuroni inibitori sia nel somata e neuriti.
Figura 4. Tre esempi di reti 3D catturate mediante microscopia confocale. Immagine (A) DIC (contrasto interferenziale differenziale) con un solo strato di perline accoppiati alla superficie MEA; la disposizione spaziale degli elettrodi (punti neri) è osservabile. (B) colorazione immunofluorescenza per Map-2 (segnale rosso) mostra la distribuzione di arborizzazioni dendritiche e somata dei neuroni intorno microsfere direttamente accoppiate al piano elettrodo della MEA. ( C) la proiezione massima di un z impili sequenza (187,79 micron) di una cultura 3D visualizzando una rete altamente interconnesso in cui i neuroni sono etichettati per NeuN espresso in neuroni maturi post-mitotico (segnale rosso) e per Gaba (segnale verde, giallo in merge ). Gaba anticorpo revealed una positività per i neuroni inibitori sia nel somata e neuriti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Per capire se la presenza di una struttura 3D modula le dinamiche di rete, l'attività elettrofisiologica così generato è stato confrontato alle tradizionali reti neuronali cresciute nel 2D MEA, che rappresentano il modello di riferimento.
Figura 5. Confronto tra le dinamiche di rete esposti da 3D (colonna di sinistra) e 2D (colonna di destra) colture ippocampali Ad ogni scala temporale (A: 1.200 sec, B: 300 sec; C: 60 sec; D: 10 sec)., assiemi 3D mostrano una serie di firme di attività (ad esempio, raffiche di rete a breve e lungo, spiking casualeattività, scoppia sincronizzate), mentre quelli 2D mostrano un'attività stereotipata più pronunciato con esplosioni sincronizzate solo alta. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La Figura 5 mostra due lotti raster di due esperimenti rappresentativi eseguiti su un 3D (pannelli di sinistra) e 2D (pannelli di destra) cultura ippocampale durante la quarta settimana in vitro. Questi grafici mostrano l'attività elettrica della rete registrato su tutti gli elettrodi attivi (cioè., Elettrodi con una gittata superiore a 0,1 spikes / s).
La dinamica di reti 2D mostrano un'attività quasi-sincrono composto principalmente da raffiche di rete. La firma di questa dinamica è la presenza di eventi sincronizzati che coinvolgono la maggior parte dei canali di registrazione intervallate da periodo in cui vengono registrati quasi alcuna attività (vedere il pannello di destraFigura 5D). Questo comportamento può essere apprezzato a differenti scale temporali, come i diversi livelli di ingrandimento sottolineatura.
Nel caso di una rete 3D, la firma delle dinamiche di rete consiste di un repertorio più ampio di attività caratterizzato da: (i) la sincronia meno globale, (ii) l'attività spiking più casuale, (iii) i periodi in cui sottoreti (ie , un sottoinsieme di microelettrodi) presentano un'attività più sincrona con la presenza di raffiche di rete. Inoltre, la durata dei burst di rete è più variabile così: vi è la presenza di raffiche di rete con una durata simile a quello osservato nelle reti 2D, ma ci sono anche raffiche di rete più lunghi. Una caratterizzazione completa e quantitativa delle dinamiche emergenti 3D ottenuti usando una tali metodi possono essere trovate in 16. Come anticipato, le mostre di rete neuronali 3D anche un significativo 'spike casuale' e non-sincrono a scoppioctivity. La plausibilità della dinamica generati da tali strutture 3D è stato reso impermeabile con alcuni controllo esperimenti (ad esempio, la presenza di una rete 2D accoppiato ad un MEA con una pila di microperle nude e reti 3D montati sulle microsfere con un MEA nuda), come riportati in 16.
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Discussion
In questo lavoro, un romanzo sperimentale in vitro piattaforma costituita da 3D progettato colture neuronali accoppiati a MEA per elettrofisiologia rete è stata presentata. L'uso di microsfere come impalcatura per consentire la conseguenza neuritica lungo la z -axis è stata adattata per essere integrato con il MEA planare. In questo modo, i risultati ottenuti micro-sistema in vitro modello 3D valida ed affidabile per studiare le dinamiche emergenti elettrofisiologici 16.
MEA registrazione set-up
Dispositivi MEA costituiti da una camera di coltura con un array integrato di substrato-embedded microelettrodi capaci di misurare segnali extracellulari da tessuti elettroattivi. I tipici segnali registrati consistono picchi (cioè, variazione di tensione singola soprallimitare rappresenta l'attività elettrica di una o più neuroni) e scoppia (cioè, sequenza di picchi altamente imballati spesso occurring simultaneamente su più canali). Le registrazioni di attività neuronale reti con sistemi basati MEA-producono enormi quantità di dati (ad esempio, un esperimento di 4 ore con una canali MEA 60 produce un record di circa 15 GB). Ciò implica la necessità di disporre di strumenti efficaci per elaborare e analizzare i dati, in particolare nel caso di studi che richiedono lunghe registrazioni. In generale, la registrazione dei segnali elettrofisiologici è ottenuta una trasduzione extracellulare diretto con le colture neuronali, e l'acquisizione di un segnale di tensione. Dopo uno stadio di amplificazione e filtraggio, i segnali vengono campionati 10-50 kHz e memorizzati. I segnali grezzi sono poi picco rilevato da uno strumento software personalizzato sviluppato. Il sistema di registrazione costituito da (1) Amplificatore MEA, (2) personal computer dotato di A / D scheda di acquisizione, (3) software di registrazione, (d) sistema di riscaldamento e di controllo della temperatura, (4) CO2 atmosfera mantenimento ed evaporazione-prevenzione sistemi.
Ilcostruzione della rete neuronale 3D passa attraverso due passaggi critici: il primo è la distribuzione della quantità corretta di perline su piastre multipozzetto con superficie inserto della membrana, il secondo è il trasferimento della sospensione di microsfere con neuroni aderenti dalla pozzetti piastre con inserto membrana per: (i) la rete neuronale 2D placcato sulla superficie attiva del MEA (primo strato); (ii) gli strati già insediati. Questa operazione deve essere ripetuta tante volte quanto il numero di strati necessari. Durante la prima settimana di coltura, una rapida crescita di estensioni neuritiche avviene intorno alle microsfere appartenenti ai diversi livelli. La stretta connessione tra neuroni e microperle stabilizza i campioni biologici e permettono di spostarlo dal termostato di modificare / sostituire il medio e di registrare con l'amplificatore MEA l'attività elettrica, senza preoccuparsi di danneggiarlo.
Poiché l'attività elettrofisiologica di tutta la retelavoro viene registrata solo lo strato inferiore (cioè quella direttamente accoppiato al MEA), l'area attiva deve essere coperta da una rete convenzionale 2D. Gli altri livelli saranno aggiunti passo dopo passo sul 2D una, e le connessioni a lungo raggio saranno distribuiti tra gli strati. In pratica, gli altri strati sono aggiunti 6-8 hr entro il 2D quella deponendo la miscela di neuroni e microsfere. La scelta di questa finestra temporale consente la formazione di alcune connessioni sinaptiche nello strato 2D, e garantisce la possibilità di stabilire connessioni a strati superiori anche.
Due fattori rendono inserire necessario realizzare reti 3D l'utilizzo di piastre multipozzetto con membrana: (i) da neuroni e microsfere presenti diverse velocità di sedimentazione, l'utilizzo di piastre multipozzetto con inserto membrana garantisce una distribuzione uniforme dei neuroni in cima delle microsfere : in media, ogni microsfere può essere circondato da uno stesso numero di neuroni. (ii) By sfruttando le proprietà elastiche delle piastre a pozzetti multipli con inserto di membrana, il controlavaggio della soluzione di microsfere accoppiati ai neuroni è più facile che utilizzando superfici solide come policarbonato multi-pozzetti.
Il lavoro presentato segue l'approccio proposto dalla Pautot e collaboratori 15: in questo studio l'uso di perle di silice fornito una superficie di crescita abbastanza grande per i corpi cellulari neuronali di aderire e per i loro processi di crescere, maturare e produrre specializzazioni pre e post-sinaptici . Una valida alternativa all'uso di perline scaffold proviene da idrogeli matrici o bioattivo e perline biodegradabili costituiti di biopolimero naturale come chitosano. Chitina e la sua derivata deacetilato, chitosano, non sono tossici, antibatterico, biocompatibile e biopolimeri biodegradabili. La costante di tempo di tale processo di biodegradazione è compatibile con la rete outgrow 20,21.
Questo studio può costituire un wor di riferimentok per il futuro sviluppo di avanzati sistemi modello 3D neuronale per studiare sistematicamente l'interazione tra le dinamiche e la struttura di rete. In breve tempo, speriamo di essere in grado di trasferire la costruzione della rete 3D su una nuova generazione di dispositivi 22. La tecnica di fabbricazione prevede la produzione di elettrodi in forma di micro-pilastri in una variabile altezze tra 50 e 350 micron.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano Giorgio Carlini per il supporto tecnico per lo sviluppo della struttura di confinamento e dott. Ornella LoBrutto per l'accurata revisione del manoscritto. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal 7 ° programma quadro dell'Unione europea (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET giovani esploratori schema), contratto di sovvenzione 284.772 CERVELLO ARCO (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
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