Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Grensesnitt 3D Engineered Nevronale kulturer til Micro-elektrode Arrays Et nyskapende Published: October 18, 2015 doi: 10.3791/53080
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 1
1Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering (DIBRIS), University of Genova, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Department of Cognitive Neuroscience, Radboud University Medical Center, 3Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia (IIT)

Introduction

In vitro-to-dimensjonale (2D) nevrale nettverk koblet til Micro-elektrode Arrays (måle) arethe gull-standard forsøksmodell vedtatt å studere samspillet mellom nerve dynamikk og den underliggende tilkobling. Under utviklingen, nevroner gjenskape komplekse nettverk som viser godt definedspatio-temporalpatternsof aktivitet 1,2 (dvs. bursts, nettverks bursts, tilfeldig spiking aktivitet). MEAs registrere elektrofysiologisk aktivitet fra mange steder (fra titalls til tusenvis av mikroelektroder), slik at en detaljert undersøkelse av de uttrykte dynamikken på nettverksnivå. I tillegg, gjør bruken av dissosierte kulturer possibile å utforme konstruerte-nettverk. Det er lettere å forstå på denne måten de funksjonelle forhold mellom det innspilte elektrofysiologisk aktivitet, og parametrene i nettverket organisasjon som celletettheten 3, grad av modularitet 4,5, nærvær av heterogene neuronal popskrifter 6, etc. Men alle in vitro-studier på dissosierte dyrkede celler er basert på 2D nevrale nettverk. Denne tilnærmingen fører til forenklinger med hensyn til in vivo (egentlig tre-dimensjonale, 3D) system: (i) i et 2D-modell, somata og vekst kjegler er flate og aksoner-dendritter utvekst kan ikke spre seg i alle retninger 7. (ii) 2D in vitro-nettverk oppviser konvensjonelektrodynamikk dominert av sprengning aktivitet som involverer de fleste av nevronene i nettverket 8.

Nylig har forskjellige løsninger blitt utviklet for å tillate bygging av in vitro 3D dissosiert nevrale nettverk. Den felles idé består i å skape et stillas der nerveceller kan vokse i et 3D mote. Et slikt stillas kan realiseres med polymergeler og solide porøse matriser 9-13. Ved å utnytte de mekaniske egenskaper av polymerer, er det mulig å legge inn celler inne these konstruksjoner med å definere en enhetlig blokk med 3D kulturer av neurosfærer 11. Den viktigste funksjonen i denne tilnærmingen er den stive mekaniske eiendom neurosfærene 9,12. Imidlertid har disse materialene begrenset porøsitet, og de garanterer ikke cellevandring inne i matrisen. For å overvinne denne ulempen, består en mulig løsning i slicing matrisen til andels 'moduler. Dessverre, kan størrelsen og formen mangfold av partiklene hindrer pakningen i regelmessige lagdelte strukturer. I 7, Cullen og medarbeidere utformet en 3D neuronal konstruksjon består av nevroner og / eller astrocytter innenfor et bioaktivt ekstracellulære matriks-baserte stillaset. En slik konstruert nervevev tillatt i vitro undersøkelser for å studere og manipulere nevrobiologiske svar innen 3D mikromiljøer. Modellen besto av neuroner og glia fordelt over hele den ekstracellulære matriks (ECM) og / eller hydrogel stillas (500-600 um tykk). I dette samarbeidetndition, en optimal celle-levedyktighet (større enn 90%) ble funnet ved utsåing av cellene i en endelig tetthet på omkring 3750 - 5000 celler / mm3. Det må bemerkes at en slik tetthetsverdi er langt lavere enn den i den in vivo tilstand, hvor celletettheten av musen hjernebarken er omtrent 90 000 celler / mm 3 14. For å overvinne denne begrensningen Pautot og medarbeidere 15 realisert en 3D-in vitro-system hvor celletetthet, og nettverkstilkoblingen blir styrt for å ligne in vivo forhold, samtidig som muliggjør sanntids avbildning av nettverket. I praksis er denne metoden basert på konseptet at dissosiert dyrkede nerveceller er i stand til å vokse på silika mikrokuler. Disse perlene gir en vekst overflate stort nok for nervecellelegemer til følge og for sine arborizations å vokse, modne, strekker seg, og definerer synaptiske kontakter til andre nerveceller. Denne metoden utnytter spontane monterings egenskapene til mono-spredt perler å form 3D lagvis sekskantede arrays som inneholder forskjellige undergrupper av nevroner på forskjellige lag med anstrengt tilkobling mellom nevroner på forskjellige perler. Den oppnådde celletetthet med denne fremgangsmåten var omtrent 75 000 celler / mm3.

Nylig har vi tilpasset Pautot metode i Meas 16: de oppnådde resultater viser at 3D-elektrofysiologisk aktivitet gir en bredere repertoar av aktiviteter enn den som er uttrykt ved 2D-nettverk. 3D modne kulturer viser en forbedret dynamisk der både nettverk burst og tilfeldig spike aktivitet eksistere. Tilsvarende Tang-Schomer og medarbeidere 17 realisert en silkeproteinbasert porøs stillas som opprettholder en primær kortikalt kultur in vitro for noen måneder, og tatt opp den elektrofysiologiske aktivitet ved hjelp av en wolframelektrode.

I dette arbeidet, til de eksperimentelle prosedyrer bygge 3D nevrale nettverk koplet i Meas vil bli beskrevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av EU-Animal Care Lovgivning (2010/63 / EU), av det italienske helsedepartementet i samsvar med DL 116/1992 og av retningslinjene ved Universitetet i Genova (Prot. N. 13130, May 2011). Alle forsøk ble gjort for å redusere antall dyr for prosjektet og for å minimere deres lidelser.

1. Utarbeidelse av Materialer og støtter

  1. Konstruere formen for å bygge PDMS (Poly-dimetyl-siloksan) begrensningen ved hjelp av en CNC (Computer Numerical Control) Fres. En slik form er realisert i polykarbonat med den sentrale sylinder i polytetrafluoretylen (PTFE). Dette materialet gjør en enklere ekstraksjon av masken når PDMS har herdet.
    MERK: Utformingen av mold er utført av Computer-Aided-Design (CAD) og deretter levert til CNC Fres.
  2. Forbered PDMS elastomer. PDMS er en organisk polymer. Den er sammensatt av to elementer, Et herdemiddel og en polymer. Blande dem ved et volumforhold på 01:10, en del av herdemiddel og ni deler polymer. Sett de to komponentene i en petriskål, rist og sett blandingen i vakuumkammeret i 10 min for å fjerne luftbobler. 3 g av PDMS er tilstrekkelig for en begrensning.
  3. Konstruer PDMS begrensningen. Sett PDMS materialet inn i molder og sette den inn i ovnen i 30 minutter ved 120 ° C. PDMS begrensningen har form av en enkelt sylinder med en utvendig og innvendig diameter på 22,0 mm og 3,0, henholdsvis og en høyde på 650 um.
  4. Dagen før plating, par masken til det aktive området av Micro-elektrode Arrays (måle) ved hjelp av en pinsett under en stereo og sterilisere PDMS masken i ovnen ved 120 ° C.
  5. Sterilglassmikroperler (nominell diameter på 40 ± 2 um; sertifisert midlere diameter på 42,3 ± 1,1 um) i 70% etanol i 2 timer i en konisk flaske og rotere everi 30 min å avsløre alle mikroperler.
  6. Fjern etanolen oppløsningen fra hetteglasset og skyll mikro to ganger med sterilisert vann.
  7. Kondisjonere den sentrale delen av MEA område avgrenset av PDMS masken (diameter lik 3,0 mm) med 24 ul av blandet oppløsning av poly-D-lysin og Laminin på 0,05 ug / ml.
  8. Coat mikroperlene med adhesjonsproteiner, Laminin og Poly-D-lysin på 0,05 ug / ml og la dem stå over natten i inkubatoren ved 37 ° C, for å oppnå en stabil og langvarig neuronal nettverk.
  9. Fjern de adhesjons faktorer både fra glassoverflaten på MEA og fra glass-mikroperler. Sug av ca. 95% av beleggoppløsningen med en pipette og påføre en liten volum- 24μl- sterilt vann på MEA overflaten. Aspirer igjen mer enn 95% av vannet og la det tørke MEA under laminære panseret i 1 time før utplating av cellene.
    MERK: I tilfelle av mikroperler i stedet, aspirer beleggoppløsning og foreta en første vask med sterilisert vann og en andre med en basal medium og dets supplement som B27, for å kondisjonere glassoverflaten hvor nerveceller vil bli belagt. Ikke la mikro tørr. La dem i suspensjon i kulturmediet inne i ampullen.
  10. Distribuere, ved hjelp av en pipette -200 μl-, suspensjonen av behandlede mikroperler (ca. 32 000) på en plate med flere brønner membraninnsats (porediameter 0,4 nm), hvor de vil selv montere å danne et jevnt lag.
  11. Fyll hver brønn av membranen med 0,5 ml medium og legg den i inkubatoren (T = 37,0 o C, CO 2 = 5%) til nervecellene er klar til å bli belagt (3,2).

2. Disseksjon av embryoer og dissosiasjon av Tissue

  1. Huset voksne hunnrotter (200-250 g) ved en konstant temperatur (22 ± 1 ° C) og relativ fuktighet (50%) under en vanlig lys-mørke-skjema (lys på 7 AM-7 PM) iDyreavdelingen. Sørg for at mat og vann er fritt tilgjengelig.
  2. Anesthetize en gravid hunnrotte etter 18 dager med utvikling (E18) med 3% isofluran. Deretter ofre dyret ved cervikal dislokasjon.
  3. Fjern hippocampi fra hver rotte embryo og plassere dem i iskald Hanks balanserte saltoppløsning uten Ca 2+ og Mg2 +. På dag 18 av utviklings hippocampus og cortex vev er veldig myk og ikke trenger å bli kuttet i små biter. Ytterligere detaljer kan finnes 18,19.
  4. Dissosiere vevet i 0,125% Trypsin / Hanks oppløsning inneholdende 0,05% av DNAse i 18-20 minutter ved 37 ° C.
  5. Fjern supernatanten løsning med en Pasteur pipette og stoppe den enzymatiske fordøyelse ved tilsetning av medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 5 min.
  6. Fjern mediet med FBS og vaskes en gang med medium med sin supplement, 1% L-glutamin, gentamicin 10 ug / ml. Fjern nytt medium med en Pasteur pipette og fylle den på nytt med en liten mengde (500 ul) i vekstmedium med sin supplement, 1% L-glutamin, gentamicin 10 ug / ml.
  7. Dissosiere vevet pellet mekanisk med en snever Pasteur-pipette til en melkeaktig suspensjon av celler som er åpenbare. Det er ikke nødvendig å sentrifugere cellesuspensjonen.
  8. Fortynn lite volum av cellesuspensjon med vekstmedium for å oppnå et sluttvolum på 2,0 ml. Telle innhentet cellular konsentrasjon med et hemocytometer kammer. Fortynn denne konsentrasjonen på 1: 5 for å oppnå den ønskede cellekonsentrasjon på 600-700 celler / mL.

3. Celleutplating

  1. Plate-celler ved en tetthet på omtrent 2,000 celler / mm 2 på det aktive område av MEA, definert av PDMS begrensningen for å skape en 2D neuronal nettverk.
    MERK: Hver hippocampus inneholder ca 5 x 10 5 celler, (1 x 10 6 for en enkelt embryo). Dissekere 6 embryo for å få et samlet beløp på 6 x 106-celler i 2 ml, og en beregnet konsentrasjon på 3000 celler / mL. Fortynn denne konsentrasjonen på 1: 5 for å oppnå den ønskede cellekonsentrasjon og plate ca 600 til 700 celler / mL. Dersom MEA område avgrenset av PDMS begrensningen er omtrent 7,065 mm 2, og det totale antall belagte celler 600 celler / mL x 24 mL = 14.400 celler, den endelige tetthet av 2,038 celler / mm 2.
  2. Plasser MEA enheter i kuvøse med fuktet CO 2 atmosfære (5%) ved 37 ° C.
  3. Fordel 160 pl av suspensjonen med en cellekonsentrasjon på 600-700 celler / ul (omtrent 100 000 celler) på overflaten av den mikroperler monolaget plassert inne i multibrønnplater for å fullføre det innledende trinn for konstruksjon av tredimensjonale kulturen. Sett multibrønnplater i inkubator med fuktet CO2-atmosfære (5%) ved 37 ° C.

4. 3D Neuronal Network Construction

  1. 6-8 timer etter plating, overføre suspensjonen (mikroperler med nevroner) fra den multibrønnplater meget nøye inne i området avgrenset av PDMS begrensningen ved hjelp av en pipette satt til et volum på ca. 30 til 40 ul. Etter hver overføring, vent i omtrent et halvt minutt, slik at de mikro å selv montere i en sekskantet kompakt struktur.
  2. Når alle lagene er avsatt og spontant sammen, fylle på med en stor dråpe ca 300 mL av medium toppen av området avgrenset av PDMS begrensningen.
  3. Sett 3D-strukturen koplet til MEA i inkubator (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) i 48 timer før tilsetning av et sluttvolum (ca. 1 ml) i vekstmedium kultur med sin supplement.
    MERK: Betrakt det totale antall perler på multibrønnplater med membraninnsats (30 000) og antallet av perler i et enkelt lag på MEA anordningen (6000). Den resulterende 3D-struktur er sammensatt av 5 lag av microbeads og celler. Tatt i betraktning at 3D-neuronale nett er ikke geometrisk perfekt, kan den resulterende 3D-strukturen være sammensatt av 5-8 lag.
  4. Dagen etter plating, tilsett forsiktig det endelige volum av mediet (900 ul) på innsiden av MEA ringen. Opprett 3D-kulturene i en fuktig CO2-atmosfære (5%) ved 37 ° C i 4-5 uker. Erstatte halvparten av det medium en gang i uken.

5. Konfokalmikroskopi Acquisition

  1. Fest biologiske prøver til scenen av mikroskopet i en holder. Sett laser (Argon, 496-555 nm), skannehastighet (400 Hz) ved å hente bildet, gevinst og offset (-0,3%) av PMT for hvert bilde for å fange riktig båndbredde utslipp filter og i orden for å unngå metning og for å øke signal til støyforhold. Resultatene delen rapporterer verdiene som brukes for å skaffe bilder av Figur 4.
  2. For kjøp av z -stack sekvens, first velger, idet verdien av z stilling av topp og bunnlaget av prøven, og velger deretter den trinnstørrelse for å gjøre anskaffelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

. I denne eksperimentelle prosedyren, er en relevant rolle spilt av mikroperlene som definerer den mekaniske stillas for vekst av 3D-neuronale nett Figurene 1A og B visning arrangementet av mikroperler (nominell diameter på 40 ± 2 um; sertifisert midlere diameter 42,3 ± 1,1 um) i planet. Det særegne ved slike strukturer er at mikroperler spontant selv montere definere et kompakt sekskantede geometri (Figur 1B og C). Den således genererte Stillaset garanterer en jevn vekst av neuritter overflate og en stor nok interstitielle rom for det metabolske utveksling av cellelegemene. Denne mikro dimensjonen viser seg å være et rimelig kompromiss for interstitiell mellomrom og endelig nevronale tetthet. Tatt i betraktning at PDMS strukturen gjenskaper en "ideell" sylinder, og siden den kompakte sekskantet struktur impact factor (HPF) er lik 0,74, det høyeste antall perler (diameter på 4081; m) inneholdt i PDMS begrensningen er omtrent 100 000, noe som tilsvarer ca. 6000-mikroperler pr hvert lag. Som forklart i seksjon protokollen, er disse mikroperler er forbehandlet med klebe faktorer (dvs. laminin og Poly-D-lysin). Denne prosedyre garanterer at nevroner holde mikroperlene. Figur 1D viser et eksempel der tre neuroner er koplet til en mikroperle med en diameter på 40 um.

Figur 1
Figur 1. Bilder av mikroperlene brukes til å lage stillaset for nevronale nettverk. (A, B) To eksempler på monosjikt av mikrokuler på overflaten av en plate med flere brønner membraninnsats. (C) mikrokuler avgjøres i henhold til tyngdekraften og spontant sammenstilt til 2D heksagonale matriser. Så snart det første lag er fullsatt, andre perler tilsettes, byggeing et andre bestilte lag med den samme heksagonal symmetri. Ytterligere tilsetning av mikrokuler resulterte i konstruksjonen av en pakket 3D-sammenstillingen. Den ledige plassen mellom mikro er fylt av nevronale prosesser og cellelegemer. (D) Tre nevroner er forankret på overflaten av en enkelt mikro, tidligere betinget med vedheft faktorer (Laminin og Poly-D-lysin). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den tilkopling av mikroperlene og neuroner med det aktive arealet av en MEA er på grunn av en elastomer begrensning (figur 2C), realisert med formen vist i figurene 2A og B. Figur 2A viser oppsett og de ​​valgte dimensjoner. Den aktive delen av MEA er avgrenset av kopling av PDMS strukturen på figur 2C til MEA substratet (figur 2D). På denne måten blir neuroner tvunget til å følge den aktive elektroden området av MEA. Deretter blir glassmikro stabler med adherente nerveceller innpasses på dette første sjiktet. Figur 2D viser et tverrsnitt av den endelige konfigurasjon, hvor rollen av PDMS struktur kan klart forstås. Det rom som begrenses av PDMS strukturen inneholder blandingen av mikroperler og nevroner (hvitt pulver i det nedre panel i figur 2D). PDMS struktur har form av en sylinder bygget med formen vist på figur 2B med følgende dimensjoner: utvendig og innvendig diameter på 22,0 mm og 3,0 henholdsvis, og høyde på 650 um. Formen ble bygget ved hjelp av polykarbonat og PTFE som gjør en ideell glatt og motstandsdyktig materiale for å lette utvinningen av det elastomere mask.The PDMS begrensninger viser en kortere levetid, da de selvklebende egenskaper av PDMS reduseres etter hver bruk. Typisk Hver PDMS struktur kan med hell brukes tre ganger.

Figur 2
Figur 2. Materialer for å bygge 3D-nevronale nettverk. (A) Konstruksjon og (B) bilde av formen som brukes til å lage den fysiske begrensning. Den grå sylinder 3 mm diameter svarer til hullet av den begrensning angitt i (C). (C) PDMS begrensning legges på det aktive område av en mikro-elektrode Array (MEA). Bruken av en slik fysisk barriere gjør det mulig å inneholde mikroperlene innenfor et målområde (ca. 7 mm 2) og begrense utviklingen av 3D-nettverket. (D) Tverrsnitt av MEA system og begrensningen. Mikroperler (avbildet med mikroskop i øvre høyre hjørne) er fylt inn mot bakrommet avgrenset av PDMS begrensningen (nederst panel).080fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Etter innesperring av det aktive området av MEA ved hjelp av PDMS maske, fortsetter den protokoll som avbildet i paneler av figur 3, som beskriver hovedtrinnene for å realisere monteringen av nerveceller og mikroperler.

Den første innledende trinn består i plette neuroner dissosiert på MEA flate som tidligere var på forhånd belagt med adhesjonsmolekylene laminin og Poly-D-lysin (figur 3A). Det er vesentlig at 2D-neuronale nett kleber direkte til det aktive området av MEA: Bare under disse betingelser, er mulig opptak av de elektrofysiologiske signaler (dvs. pigger og bursts). Denne første del av protokollen tilsvarer den standardprosedyre som brukes til å platen 2D neuroner. Selve konstruksjonen av 3D-system er vist i figurene 3B, C, og D (Figur 3B); Deretter blir en 160 ul suspensjon med en cellekonsentrasjon på 600-700 celler / ul (omtrent 100 000 celler) fordeles på mikromonolaget (figur 3C). Tatt i betraktning at cellene kan oppta halvparten av vulsten området, er 75 mm 2 den totale frie overflate. Celletettheten på mikroperlene monolaget er omtrent 1500 celler / mm 2. De anvendte multibrønnplater med membraninnsats presentere en porøs membran med en overflate på 33,6 mm 2. Ved å betrakte en virtuell sylinderform med en grunnflate lik den porøse membranflate og en høyde på 40 um (bead diameter), blir et jevnt lag bestående av 30000 mikroperler koplet til multibrønnplater med membraninnsats. Den så innså suspensjon av mikroperler og nevroner holder i ca 6-8 timer inne i multibrønnplater med membran innsats. Nårde nevnte trinn er fullført, kan konstruksjonen av 3D-nettverket starte. På dette tidspunkt, blir blandingen av nerveceller og mikroperlene fjernet fra multibrønnplater med membraninnsats og plassert på 2D-neuronale nett tidligere sådd ut på det området som defineres av PDMS begrensningen (figur 3D). I løpet av denne fremgangsmåten, oppstår et tap på omtrent 20 til 30% av nevronene grunn av (i) mekaniske manipulasjoner og (ii) til overførings utenfor membranen. Ved å ta hensyn baseområdet av den begrensning (7,06 mm 2) og en høyde på 178.56 um (5 lag av perler), og å dele antall celler ved volumet av den ideelle sylinder dannet av 5 lag av perler, den resulterende 3D nevronale nettverk celletetthet er ca 80 000 celler / mm 3.

Figur 3
Figur 3. Skisse av de grunnleggende trinnene for å lage 2D og 3D nevrale nettverk. (A) Plating of nevroner i det aktive område i en MEA. Suspensjonen av neuroner er belagt på overflaten MEA, tidligere kondisjonert med vedheft faktorer og avgrenset av PDMS begrensningen. Dette trinnet gjør det mulig å realisere: i) en klassisk 2D neuronal nettverk koplet til MEA; ii) det første laget av et 3D-nettverket som elektrofysiologisk aktivitet vil bli registrert. (B) mikrokuler, og (C) neuroner blir levert til overflaten av multibrønnplater med membraninnsats etter 6-8 timer. (D) Suspensjonen av nerveceller og mikrokuler er flyttet fra multibrønnplater med membraninnsats til 2D nettverket. Gjentagelse av dette trinn flere ganger, gjør det mulig å definere en kompakt flerlags 3D-struktur. (E) Ved 3D-strukturen er fullført, blir en dråpe av medium tilsatt, og den resulterende strukturen er lagret i inkubator i 48 timer. (F ) Etter 48 timer, er 3D-kulturen fullstendig fylles med det endelige volum av mediet.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Så snart det første lag er plassert, blir den samme operasjonen gjentas for å oppnå en pakket 3D ensemble. Den resulterende 3D-struktur omorganiserer seg selv danner en kolloidal krystall som selv setter sammen i en kompakt struktur som består av 5-8 lag av mikrokuler og neuroner (figur 4). Når alle lagene er dannet, har 3D-nettverket som skal fylles med et fall på 300 ul medium (figur 3E). På dette stadiet kan 3D-nettverk koplet i Meas lagres i inkubator i 48 timer. Deretter blir 1 ml medium tilsatt for å fylle ringen av MEA (figur 3F).

Når alle lag er blitt sammenstilt, neuritter vokse over mikro stillaset når en endelig celletetthet på omtrent 80 000 celler / mm3. Det er verdt å noticing at den oppnådde verdi er ikke langt fra 92.000 celler / mm 3, gjennomsnittlig neuronal tetthet i mus hjernebarken 14.

Figur 4 viser tre eksempler på 3D-nettverk koblet til MEAs fanget ved hjelp av konfokalmikroskopi oppreist. I figur 4A, DIC (differensiell interferenskontrast) bilde viser et enkelt lag av perler som er koplet til overflaten MEA; mikroskopet ble kombinert med 20,0 NA 0,50 vann objektiv og bildene ble kjøpt med overfør PMT inkludert for å mikroskopet og en Laser Argon (488nm). Bildene viser veldig klart den romlige utformingen av elektrodene (svarte prikker) og den vanlige romlige organiseringen av mikroperler.

I figur 4B, en immunofluorescens farging for Map-2 (rødt signal) viser fordelingen av dendrittiske arborizations og somata av nervecellene rundt mikroperlene direkte koplet til elektrodeplanet MEA (tilstedeværelsen av sorte kontaktene kan observeres). Figur 4B er en maksimal projeksjon av en Z- stabel sekvens (108 um) med den trinnstørrelse lik til 1,53 um. Bilder ble kjøpt med mål 40,0 NA 0,80 vann; eksitasjon er argonlaser (488 nm), båndbredde emisjon 496nm-655nm.

Til slutt viser figur 4C maksimal projeksjon av en z -stack sekvens (187,79 mm) av en 3D-hippocampus kultur (trinnstørrelse er 2,27 um). Z -stack sekvensen ble kjøpt med mål 25,0 NA 0,95 vann. For grønne kanalen, ble en Argon laser 488nm og et utslipp filter båndbredde 499nm-551nm brukt. For røde kanalen, ble en 543 nm laser og et utslipp filter båndbredde 555nm-645nm brukt. Kanalene ble kjøpt i sekvensmodus. Et sterkt sammenvevd nettverk framgår hvor nevroner er merket for Neun uttrykt i modne etter mitotiske nevroner (rødt signal) og for Gaba (grønt signal, yellav i flettingen). Gaba-antistoff viste en positivitet for inhibitoriske neuroner både i somata og neuritter.

Figur 4
Figur 4. Tre eksempler på 3D-nettverk fanget av konfokalmikroskopi. (A) DIC (differensiell interferenskontrast) bilde som viser et enkelt lag av perler som er koplet til overflaten MEA; den romlige utformingen av elektrodene (sorte prikker) er observerbar. (B) Immunofluorescens farging for Map-2 (rødt signal) viser fordelingen av dendrittiske arborizations og somata av nervecellene rundt mikroperlene direkte koblet til elektroden planet for MEA. ( C) Maksimal projeksjon av en z -stack sekvens (187,79 mikrometer) av en 3D-kultur viser en svært sammenvevd nettverk der nevroner er merket for Neun uttrykt i modne etter mitotiske nevroner (rødt signal) og for Gaba (grønt signal, gul i flettingen ). Gaba antistoff revealed en positivitet for hemmende nevroner både i somata og neuritter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å forstå hvorvidt nærvær av en 3D-struktur modulerer nettverksdynamikk de ble så generert elektrofysiologisk aktivitet sammenlignet med konvensjonelle 2D nevrale nettverk vokst i løpet MEAs, som representerer referansemodellen.

Figur 5
Figur 5. Sammenligning mellom nettverksdynamikk som utvises av 3D (venstre kolonne) og 2D (høyre kolonne) hippocampale kulturer Ved hvert tidsskala (A: 1200 sek, B: 300 sek; C: 60 sekunder; D: 10 sek)., 3D-samlinger vise en rekke underskrifter fra aktivitet (dvs. korte og lange nettverks bursts, tilfeldig spikingaktivitet, synkroniserte bursts), mens 2D de vise en mer uttalt stereotyp aktivitet med høy synkroniserte bursts. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 viser to raster plott av to representative eksperimenter utført på en 3D (venstre panel) og 2D (høyre panel) hippocampus kultur under den fjerde uken in vitro. Disse plott viser den elektriske aktiviteten i nettet registreres på alle aktive elektroder (f.eks., Elektroder med en avfyringshastighet som er større enn 0,1 pigger / s).

Dynamikken i 2D nettverk vise en kvasi-synkron aktivitet består hovedsakelig av nettverks bursts. Underskrift av denne dynamikken er tilstedeværelsen av synkroniserte hendelser som involverer de fleste av opptakskanaler ispedd av perioden hvor nesten ingen aktivitet er registrert (se høyre panel avFigur 5D). Denne atferden kan bli verdsatt på ulike tidsskalaer, som de forskjellige nivåer av forstørrelse understreking.

I tilfelle av en 3D-nettverk, signaturen til nettverksdynamikk de består av en bredere repertoar av virksomhet, karakterisert ved: (i) mindre global synkroniseringen, (ii) mer tilfeldig spiking aktivitet, (iii) perioder hvor sub-nett (dvs. En undergruppe av mikroelektroder) presentere en mer synkron aktivitet med forekomsten av nettverks bursts. Videre er varigheten av nettverket bursts mer variable i tillegg: det er tilstedeværelsen av nettverks støt med en varighet lik den som er observert i 2D-nettverk, men det er også lengre nettverks bursts. En komplett og kvantitativ karakterisering av emergent 3D-dynamikken som oppnås ved hjelp av et slikt metoder kan bli funnet i 16. Som forventet, 3D nevrale nettverk utstillinger også en betydelig 'tilfeldig spiking "og ikke-synkron sprengning activity. Plausibilitet av dynamikken som genereres av disse 3D-strukturer har blitt impregnert med noen kontroll-eksperimenter (for eksempel tilstedeværelse av en 2D nettverk koblet til en MEA med en stabel av nakne mikroperler og 3D-nettverk samlet på mikroperlene med en naken MEA), som rapportert i 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet, en roman eksperimentell in vitro-plattformen består av 3D konstruert nevrale kulturer koblet til MEAs for nettverkselektrofysiologi har blitt presentert. Bruken av mikroperler som stillas for å tillate neuritic utvekst langs z -aksen er skreddersydd for å bli integrert med planar MEA. På denne måten, til de oppnådde mikro systemet resulterer i en gyldig og pålitelig in vitro 3D-modellen studere emergent elektrodynamikk 16.

MEA opptak set-up

MEA-enheter består av en kultur kammer med en integrert rekke av substrat-innebygde mikroelektroder som er i stand til å måle ekstracellulære signaler fra elektro-aktive vev. De typiske registrerte signaler består av pigger (dvs. enkelt supra-terskelspenning variasjon som representerer den elektriske aktiviteten av ett eller flere neuroner) og bursts (dvs. sekvensen av sterkt pakket pigger ofte occurring samtidig på flere kanaler). Opptakene av nevronale nettverk aktivitet med MEA-baserte systemer produsere store mengder data (f.eks en 4 timers eksperiment med 60 kanaler MEA produserer en oversikt over ca 15 GB). Dette innebærer at behovet for å ha effektive verktøy for å behandle og analysere dataene, spesielt i tilfelle av studier som krever lange opptak. Generelt er innspillingen av elektrofysiologiske signaler oppnås ved en direkte ekstracellulært transduksjon med nevrale kulturer, og oppkjøpet av et spenningssignal. Etter en forsterkning og filtreringstrinnet, blir signaler samplet 10-50 kHz og lagres. Den rå signalene er så topp-oppdaget av en spesialutviklet programvare verktøyet. Registreringssystemet besto av (1) MEA forsterker, (2) personlige datamaskin utstyrt med A / D anskaffelse brett, (3) innspillingen programvare, (d) varmesystem og temperaturregulator, (4) CO2 atmosfære-opprettholde og fordampning hindrende systemer.

Denbygning av 3D-neuronal nettverket går gjennom to kritiske trinn: den første er fordelingen av den korrekte mengde av perler på multibrønnplater med membraninnsats overflaten, er den andre en overføring av suspensjonen av mikroperler med adherente nerveceller fra flere brønner plater med membran innsats til: (i) 2D neuronale nett sådd ut på det aktive område av MEA (første lag); (ii) allerede avgjort lag. Denne operasjon må gjentas så mange ganger som antallet nødvendige lag. I løpet av den første uken av kultur, tar en rask vekst av neuritic utvidelser sted rundt mikroperlene som tilhører på de forskjellige lagene. Den nære forbindelsen mellom nerveceller og mikro stabiliserer biologiske prøver og la til å flytte den fra inkubatoren å endre / erstatte medium og skal tas opp med MEA forsterker den elektriske aktiviteten uten å bekymre deg for å skade den.

Siden den elektrofysiologiske aktivitet av hele nettetArbeidet registreres bare fra bunnlaget (det vil si, den ene direkte koplet til MEA), det aktive området må dekkes ved en konvensjonell 2D-nettverk. De andre lagene vil bli lagt trinnvis over 2D en, og langtrekkende tilkoblinger vil bli spredt blant lagene. I praksis blir de andre lagene har lagt 6-8 timer senere enn 2D-en ved å avsette blandingen av nerveceller og mikroperler. Valget av denne time vinduet åpner for dannelsen av et par synaptiske forbindelser i 2D lag, og garanterer muligheten for å etablere forbindelser til de øvre lagene også.

To faktorer gjør bruk av multibrønnplater med membran sett er nødvendig for å realisere de 3D-nettverkene: (i) siden nerveceller og mikrokuler til stede forskjellige sedimenteringshastigheter, garanterer bruken av multibrønnplater med membraninnsats en jevn fordeling av neuroner på toppen av mikroperlene : i gjennomsnitt, kan hver mikro være omgitt av det samme antall nerveceller. (ii) By utnytte de elastiske egenskaper til multibrønnplater med membraninnsats, er tilbakespylings av oppløsningen av mikroperler som er koplet til neuroner enklere enn ved bruk av faste overflater som polykarbonat multi-brønner.

Den presenterte arbeidet følger den tilnærmingen foreslått av Pautot og kolleger 15: i den studien bruk av silika perler ga en vekst overflate stort nok for nervecellelegemer til følge og for sine prosesser for å vokse, modnes og produsere pre- og postsynaptiske spesialiseringer . En gyldig alternativ til bruk av perler stillas kommer fra hydrogeler matriser eller bioaktivt og biologisk nedbrytbare perler laget av naturlig biopolymer som kitosan. Kitin og dets deacetylerte derivat, kitosan, er ikke-toksisk, antibakteriell, biokompatible og biologisk nedbrytbare biopolymerer. Tidskonstanten av slike biologiske nedbrytningsprosess er kompatibel med nettverket vokse 20,21.

Denne studien kan utgjøre en referanse work for den fremtidige utviklingen av avanserte 3D neuronal modellsystemer for å systematisk studere samspillet mellom nettverks dynamikk og struktur. I en kort tid, håper vi å kunne overføre 3D-nettverket konstruksjonen på en ny generasjon av enheter 22. Den fremstillingsteknikk omfatter produksjon av elektroder i form av mikro søyler i en variabel høyde mellom 50 og 350 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne takker Giorgio Carlini for teknisk støtte i utviklingen av innesperring struktur og dott. Ornella LoBrutto for grundig revisjon av manuskriptet. Forskningen som fører til disse resultatene har fått midler fra EUs 7. rammeprogram (IKT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers ordning) under tilskuddsavtalen 284772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminin Sigma-Aldrich L2020 0.05 µg/ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 0.05 µg/ml
Trypsin Gibco 25050-014 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase Sigma-Aldrich D5025 0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal Gibco Invitrogen 21103049 culture medium
B27 Gibco Invitrogen 17504044 2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-2442 10%
Glutamax-I  Gibco 35050038 0.5 mM
gentamicin Sigma-Aldrich G.1272 5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) Corning Sigma 481939 curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays Multi Channel Systems (MCS) 60MEA200/30-Ti-pr MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead Distrilab-Duke Scientific 9040  1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
Transwell Costar Sigma CLS 3413 multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++  Gibco Invitrogen 14175-052
Hanks Buffer Solution  Sigma  H8264
Teflon Sigma 430935-5G polytetrafluoroethylene
Rat Sprague Dawley Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright Leica TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
40.0x0.80 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
25.0x0.95 WATER objective Leica HCX IRAPO L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
  2. Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
  3. Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
  4. Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
  5. Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
  6. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
  7. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
  8. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
  9. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
  10. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
  11. Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
  12. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
  13. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
  14. Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
  15. Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
  16. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
  17. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
  18. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
  19. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
  20. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
  21. Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
  22. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).

Tags

Nevrovitenskap 3D-nettverk utviklet nettverk nevrale kulturer Micro-elektrode Arrays (måle) nettverksdynamikk elektrofysiologiske signaler
Grensesnitt 3D Engineered Nevronale kulturer til Micro-elektrode Arrays Et nyskapende<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tedesco, M., Frega, M., Martinoia,… More

Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model. J. Vis. Exp. (104), e53080, doi:10.3791/53080 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter