Introduction
In vitro de dos dimensiones (2D) redes neuronales acoplados a micro-electrodos Arrays (AMUMA) arethe modelo experimental de oro-estándar adoptado para estudiar la interacción entre la dinámica neuronal y la conectividad subyacente. Durante el desarrollo, las neuronas recrean redes complejas que muestran bien definedspatio temporalpatternsof actividad 1,2 (es decir, las explosiones, las explosiones de red, actividad clavar al azar). AAM registran la actividad electrofisiológica de muchos sitios (de decenas a miles de microelectrodos), lo que permite una investigación detallada de la dinámica expresadas a nivel de red. Además, el uso de cultivos disociados hace possibile para diseñar-redes de ingeniería. Es más fácil de entender de esta manera las relaciones funcionales entre la actividad electrofisiológica registrada y los parámetros de la organización de la red, como la densidad de células 3, grado de modularidad 4,5, presencia de pop neuronal heterogéneaulations 6, etc. Sin embargo, todos los estudios in vitro sobre células cultivadas disociadas se basan en redes neuronales 2D. Este enfoque conduce a simplificaciones con respecto al sistema in vivo (intrínsecamente 3-dimensional, 3D): (I) en un modelo conos, somata de crecimiento y 2D son aplanadas y la consecuencia axones-dendritas no puede extenderse en todas las direcciones 7. (ii) 2D in vitro redes exhibición estereotipada dinámica electrofisiológicos dominadas por la actividad que implica la mayor parte de las neuronas de la red 8 reventar.
Recientemente, diferentes soluciones han sido desarrolladas para permitir la construcción de in vitro 3D disociada redes neuronales. La idea común consiste en crear un andamio donde las neuronas pueden crecer en una forma 3D. Un andamio de este tipo puede realizarse con geles de polímeros y matrices porosas sólidas 9-13. Mediante la explotación de las propiedades mecánicas de los polímeros, es posible incrustar dentro de las células Tse estructuras mediante la definición de un bloque uniforme de las culturas 3D de neuroesferas 11. La característica principal de este enfoque es la propiedad mecánica rígida de las neuroesferas 9,12. Sin embargo, estos materiales han porosidad limitada, y no garantizar la migración de células dentro de la matriz. Para superar este inconveniente, una posible solución consiste en cortar la matriz en módulos "unidad". Por desgracia, el tamaño y la forma de las partículas de diversidad podría obstaculizar el embalaje en estructuras en capas regulares. En 7, Cullen y sus colaboradores diseñaron un constructo neuronal 3D compuesto por neuronas y / o astrocitos dentro de un andamiaje basado en la matriz extracelular bioactiva. Tal tejido neural ingeniería permitido en investigaciones in vitro para estudiar y manipular las respuestas neurobiológicas dentro de micro-ambientes 3D. Este modelo consistía en neuronas y glia distribuidos por toda la matriz extracelular (ECM) y / o andamios de hidrogel (de 500-600 m de espesor). En este condition, una viabilidad celular óptima (mayor que 90%) se encontró en placas células a una densidad final de aproximadamente 3.750 - 5.000 células / mm 3. Debe tenerse en cuenta que un valor tal densidad es mucho menor que el que está en la condición in vivo, donde la densidad de células de la corteza cerebral de ratón es de aproximadamente 90.000 células / mm 3 14. Para superar esta limitación Pautot y compañeros de trabajo 15 se dieron cuenta de un sistema in vitro en 3D donde la densidad celular y la conectividad de red están controlados para asemejarse a las condiciones in vivo al tiempo que permite imágenes en tiempo real de la red. Prácticamente, este método se basa en el concepto de que disocian neuronas cultivadas son capaces de crecer en microperlas de sílice. Estas cuentas proporcionan una superficie de crecimiento lo suficientemente grande para que los cuerpos celulares neuronales para adherirse y para sus arborizaciones para crecer, madurar, ampliar y definir contactos sinápticos con otras neuronas. Este método aprovecha las propiedades de montaje espontáneas de cuentas monodispersados a form 3D en capas matrices hexagonales que contienen distintos subconjuntos de neuronas en diferentes capas con conectividad restringida entre las neuronas en diferentes cuentas. La densidad celular lograda con este método fue de alrededor de 75.000 células / mm 3.
Recientemente, hemos adaptado el método de Pautot los AMUMA 16: los resultados obtenidos muestran que la actividad electrofisiológica 3D presenta un repertorio más amplio de actividades que la expresada por las redes 2D. Culturas maduras 3D muestran una dinámica mejorada en la que tanto la explosión de la red y actividad pico aleatoria coexisten. Del mismo modo, Tang-Schomer y compañeros de trabajo 17 se dieron cuenta de un armazón poroso a base de proteínas de seda-que mantiene una cultura cortical primaria in vitro para algunos meses, y registraron la actividad electrofisiológica por medio de un electrodo de tungsteno.
En este trabajo, los procedimientos experimentales para construir redes neuronales en 3D, junto a los acuerdos ambientales multilaterales se describirá.
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Protocol
El protocolo experimental fue aprobado por la Legislación Europea de Cuidado de Animales (2010/63 / UE), por el Ministerio de Salud de Italia, de conformidad con el DL 116/1992 y por las directrices de la Universidad de Génova (Prot. N. 13130, de mayo 2011). Se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales para el proyecto y para minimizar su sufrimiento.
1. Preparación de Materiales y Apoyos
- Construir el molde para construir el PDMS (poli-dimetil-siloxano) de restricciones por medio de un CNC (Control Numérico Computarizado) fresadora. Tal molde se realiza en policarbonato con el cilindro central en politetrafluoroetileno (PTFE). Este material permite una extracción más fácil de la máscara una vez que el PDMS ha endurecido.
NOTA: El diseño del molde se ha realizado por Computer-Aided-Design (CAD) y luego entregado a la fresadora CNC. - Preparar el elastómero PDMS. PDMS es un polímero orgánico. Se compone de dos elementos, Un agente de curado y un polímero. Mezclar por una relación en volumen de 1:10, una parte del agente de curado y nueve partes de polímero. Ponga los dos componentes en una placa de Petri, agitar e introduzca la mezcla en la cámara de vacío durante 10 min para eliminar las burbujas de aire. 3 g de PDMS son suficientes para una restricción.
- Construir la restricción PDMS. Inserte el material de PDMS en el moldeador y ponerlo en el horno durante 30 minutos a 120 ° C. La restricción de PDMS tiene la forma de un cilindro ideal, con un diámetro externo e interno de 22,0 y 3,0 mm, respectivamente y una altura de 650 m.
- El día antes de la galvanoplastia, acoplar la máscara a la zona activa de las matrices de micro-electrodos (AMUMA) por medio de una pinza bajo un microscopio estereoscópico y esterilizar la máscara de PDMS en el horno a 120 ° C.
- Esterilizar las microesferas de vidrio (diámetro nominal de 40 ± 2 micras; diámetro medio certificada de 42,3 ± 1,1 micras) en etanol al 70% durante 2 horas en un vial cónico y girar every 30 minutos para exponer todas las microesferas.
- Retirar la solución de etanol del vial y enjuagar las microperlas dos veces con agua esterilizada.
- Acondicionar la parte central de la zona MEA delimitada por la máscara de PDMS (diámetro igual a 3,0 mm) con 24 l de solución mixta de poli-D-lisina y laminina en 0.05 g / ml.
- Escudo las microperlas con proteínas de adhesión, laminina y poli-D-lisina en 0,05 g / ml y se dejan durante la noche en la incubadora a 37 ° C, para obtener una red neuronal estable y de larga duración.
- Retire los factores de adhesión tanto de la superficie de vidrio de la MEA y de las microesferas de vidrio. Aspirar aproximadamente 95% de la solución de revestimiento con una pipeta y se aplica una pequeña en volumen 24μl- de agua estéril en la superficie MEA. Aspirar de nuevo más de 95% del agua y dejar que el MEA seca bajo el capó laminar durante 1 hora antes en placas las células.
NOTA: En el caso de las microesferas lugar, aspirar el recubrimientosolución y hacer un primer lavado con agua esterilizada y una segunda con el medio basal y su suplemento tales como B27, con el fin de acondicionar la superficie del vidrio en el que se sembraron las neuronas. No dejes que las microesferas secas. Deja ellos en suspensión en el medio de cultivo en el interior del vial. - Distribuir, por medio de una pipeta -200 μl-, la suspensión de microperlas tratados (aproximadamente 32.000) en una placa de múltiples pocillos con inserción de membrana (diámetro de poro 0,4 micras) donde se auto-ensamblan formando una capa uniforme.
- Llene cada pocillo de la membrana con 0,5 ml de medio y ponerlo en la incubadora (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) hasta que las neuronas están listos para ser plateado (3,2).
2. La disección de embriones y la disociación de Tejidos
- Ratas hembras Casa adultas (200-250 g) a una temperatura constante (22 ± 1 ° C) y humedad relativa (50%) en un horario de luz-oscuridad normal (luz de 7 a.m.-7 p.m.) en elanimalario. Asegurar que los alimentos y el agua son de libre acceso.
- Anestesiar una rata hembra embarazada después de 18 días de desarrollo (E18) con 3% de isoflurano. Luego, sacrificar al animal por dislocación cervical.
- Retire hipocampos de cada embrión de rata y colocarlos en una solución salina equilibrada helada de Hank sin Ca 2+ y Mg 2+. En el día 18 de hipocampo de desarrollo y los tejidos de la corteza son muy suaves y no tienen que ser cortado en trozos pequeños. Más detalles se pueden encontrar 18,19.
- Disociar el tejido en 0,125% de solución de tripsina / de Hank que contiene 0,05% de ADNasa durante 18-20 min a 37 ° C.
- Eliminar la solución sobrenadante con una pipeta Pasteur y detener la digestión enzimática mediante la adición de medio con suero bovino fetal al 10% (FBS) durante 5 min.
- Eliminar el medio con FBS y lavar una vez con el medio con su suplemento, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 mg / ml. Quite de nuevo el medio con un pip Pasteurette y vuelva a llenar de nuevo con una pequeña cantidad (500 l) de medio de crecimiento con su suplemento, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 mg / ml.
- Disociar el sedimento de tejido mecánicamente con una pipeta Pasteur estrecha hasta una suspensión lechosa de las células es evidente. No es necesario centrifugar la suspensión celular.
- Diluir el pequeño volumen de suspensión de células con el medio de crecimiento para obtener un volumen final de 2,0 ml. Contar la concentración celular obtenida con una cámara de hemocitómetro. Diluir esta concentración a 1: 5 con el fin de obtener la concentración celular deseada de 600-700 células / mL.
3. celular Chapado
- Células de placas a una densidad de aproximadamente 2.000 células / mm 2 en el área activa del MEA, definidos por la restricción de PDMS para crear una red neuronal 2D.
NOTA: Cada hipocampo contiene aproximadamente 5 x 10 5 células, (1 x 10 6 para un solo embrión). Diseccionar 6 embriones para conseguir un total de 6 x 106 células en 2 ml, y una concentración estimada de 3.000 células / mL. Diluir esta concentración a 1: 5 con el fin de obtener la concentración deseada de células y la placa aproximadamente de 600-700 células / l. Si el área de MEA delimitada por la restricción de PDMS es de aproximadamente 7,065 mm 2, y el número total de células cultivadas en placas células 600 / l x 24 l = 14.400 células, la densidad final de 2.038 células / mm 2. - Coloque los dispositivos de los AMUMA en la incubadora con humidificado atmósfera de CO 2 (5%) a 37 ° C.
- Distribuir 160 l de la suspensión con una concentración celular de 600-700 células / l (aproximadamente 100.000 células) sobre la superficie de la monocapa microperlas posicionado dentro de las placas de múltiples pocillos para completar el paso preliminar para la construcción de cultivo tridimensional. Coloque las placas de múltiples pocillos en la incubadora con humidificado atmósfera de CO 2 (5%) a 37 ° C.
Construcción 4. Red Neuronal 3D
- 6-8 horas después de la galvanoplastia, transferir la suspensión (microperlas con neuronas) de las placas de múltiples pocillos con mucho cuidado dentro del área delimitada por la restricción PDMS mediante el uso de una pipeta fijada para un volumen de alrededor de 30-40 l. Después de cada transferencia, espere alrededor de medio minuto, para permitir que las microesferas de auto-ensamblan en una estructura compacta hexagonal.
- Una vez que todas las capas se depositan y espontáneamente se reunieron, vuelva a llenar con una gran caída de unos 300 l de medio con la parte superior de la zona delimitada por la restricción PDMS.
- Ponga la estructura 3D acoplado a la MEA en la incubadora (T = 37.0 o C, CO 2 = 5%) durante 48 horas antes de añadir un volumen final (aproximadamente 1 ml) del crecimiento medio de cultivo con su suplemento.
NOTA: Tenga en cuenta el número total de cuentas en las placas de múltiples pocillos con inserto de membrana (30.000) y el número de cuentas en una sola capa sobre el dispositivo MEA (6000). La estructura 3D resultante se compone de 5 capas de microbeads y células. Teniendo en cuenta que la red neuronal 3D no es geométricamente perfecto, la estructura 3D resultante podría estar compuesto por capas 5-8. - El día después de la siembra, añadir con cuidado el volumen final del medio (aproximadamente 900 l) en el interior del anillo de MEA. Mantener las culturas 3D en una atmósfera de CO2 humidificado (5%) a 37 ° C durante 4-5 semanas. Reemplazar la mitad del medio una vez por semana.
5. Microscopía Confocal Adquisición
- Fijar las muestras biológicas a la platina del microscopio en un soporte. Ajuste el láser (argón, 496-555 nm), la velocidad de exploración (400 Hz) en el que adquirir la imagen, la ganancia y el offset (-0,3%) de PMT para cada imagen para capturar el filtro de emisión de ancho de banda correcto y con el fin para evitar la saturación y para aumentar la relación señal a ruido. La sección de resultados informa de los valores utilizados para adquirir las imágenes de la Figura 4.
- Para la adquisición de la z -stack secuencia, abetost seleccionar, el valor de la posición z de la parte superior y la capa inferior de la muestra, a continuación, seleccione el tamaño de paso para hacer la adquisición.
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Representative Results
. En este procedimiento experimental, un papel relevante es interpretado por las microperlas que definen el andamiaje mecánico para el crecimiento de la red neuronal 3D Figuras pantalla 1A y B la disposición de las microperlas (diámetro nominal de 40 ± 2 m; diámetro medio certificada de 42,3 ± 1,1 micras) en el avión. La peculiaridad de tales estructuras es que microperlas espontáneamente se auto-ensamblan definir una geometría hexagonal compacta (Figura 1B y C). El andamio así generada garantiza una superficie de crecimiento consistente para las neuritas y un espacio intersticial lo suficientemente grande para el intercambio metabólico de los cuerpos celulares. Esta dimensión microperla demuestra ser un compromiso razonable para el espaciamiento intersticial y densidad neuronal final. Teniendo en cuenta que la estructura PDMS recrea un cilindro de "ideal", y puesto que el factor de estructura de impacto hexagonal compacta (HPF) es igual a 0,74, el número máximo de granos (diámetro de 4081; m) contenida dentro de la restricción PDMS es de aproximadamente 100.000, que corresponde a alrededor de 6.000 microperlas por cada capa. Como se explica en la Sección de Protocolo, estas microperlas son pre-acondicionado con los factores de adhesión (es decir, laminina y poli-D-lisina). Este procedimiento garantiza que las neuronas se adhieren a las microperlas. Figura 1D muestra un ejemplo en el que tres neuronas están acoplados a una microperla con un diámetro de 40 micras.
Figura 1. Imágenes de las microperlas utilizados para crear el andamio para la red neuronal. (A, B) Dos ejemplos de monocapas de microperlas en la superficie de una placa de múltiples pocillos con inserción de membrana. (C) microperlas resuelta conforme a la fuerza gravitatoria y espontáneamente montado en matrices hexagonales 2D. Una vez que la primera capa está totalmente lleno, se añaden otros granos, construiring una segunda capa ordenado que tienen la misma simetría hexagonal. Además adición de microperlas resultó en la construcción de un conjunto de 3D lleno. El espacio libre entre las microesferas se llena por procesos neuronales y cuerpos celulares (D) Tres neuronas están anclados en la superficie de una sola microperla, previamente acondicionado con factores de adhesión (laminina y poli-D-lisina).. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La interconexión de las microperlas y neuronas con el área activa de un MEA se debe a una limitación de elastómero (Figura 2C), realizado con el molde representado en las Figuras 2A y B. La Figura 2A muestra la disposición y las dimensiones seleccionadas. El área activa del MEA está delimitada por el acoplamiento de la estructura de la Figura 2C PDMS al sustrato MEA (Figura 2D). De esta manera, las neuronas se ven obligados a adherirse a la zona del electrodo activo de la MEA. Posteriormente, las pilas de microperlas de vidrio con las neuronas adherentes serán alojados en esta primera capa. 2D muestra la figura una sección transversal de la configuración final, donde el papel de la estructura de PDMS puede ser claramente apreciado. El espacio delimitado por la estructura PDMS contiene la mezcla de microperlas y neuronas (polvo blanco en el panel inferior de la Figura 2D). La estructura de PDMS tiene la forma de un cilindro construido con el molde representado en la Figura 2B con las siguientes dimensiones: diámetro externo e interno de 22,0 y 3,0 mm, respectivamente, y la altura de 650 m. El molde se construye a partir de policarbonato y PTFE que crea un material liso y resistente ideal para facilitar la extracción de la elastomérico limitaciones en elastómero, PDMS muestran un tiempo de vida más corto, ya que las propiedades adhesivas de la disminución PDMS después de cada uso. Típicamente , Cada estructura de PDMS puede ser utilizado con éxito tres veces.
Figura 2. Materiales para la construcción de la red neuronal 3D. (A) Diseño y (B) Imagen del molde utilizado para crear la restricción física. El cilindro de diámetro 3 mm gris corresponde al orificio de la restricción se representa en (C). (C) PDMS restricción colocado en el área activa de una matriz de Micro-electrodo (MEA). El uso de una barrera física tal permite contener las microperlas dentro de un área objetivo (alrededor de 7 mm 2) y limitar el desarrollo de la red 3D. (D) Sección transversal del sistema de MEA y restricción. Microbeads (representados por el microscopio en la esquina superior derecha) se introducen en el espacio delimitado por la restricción PDMS (panel inferior).080fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Después de que el confinamiento de la zona activa de la MEA por medio de la máscara de PDMS, el protocolo continúa según se representa en los paneles de la Figura 3, que describe los pasos principales para realizar el montaje de las neuronas y las microperlas.
La primera etapa preliminar consiste en neuronas disociadas chapado sobre la superficie MEA que fue previamente pre-recubierto con las moléculas de adhesión laminina y poli-D-lisina (Figura 3A). Es esencial que la red neuronal 2D se adhiere directamente a la zona activa de la MEA: sólo bajo estas condiciones, la grabación de las señales electrofisiológicas (es decir, los picos y ráfagas) es factible. Esta primera parte del protocolo se corresponde con el procedimiento estándar usado a la placa neuronas 2D. La construcción real del sistema 3D se representa en las figuras 3B, C, y D (Figura 3B); después, una suspensión 160 l con una concentración celular de 600-700 células / l (aproximadamente 100.000 células) se distribuye en las microperlas monocapa (Figura 3C). Teniendo en cuenta que las células pueden ocupar la mitad de la zona del talón, la superficie libre total es de 75 mm 2. La densidad de células en la monocapa microperlas es de aproximadamente 1.500 células / mm 2. Las placas de múltiples pocillos utilizados con inserto de membrana presentan una membrana porosa con una superficie de 33,6 mm 2. Al considerar una forma cilíndrica virtual con una superficie de base igual a la superficie de la membrana porosa y una altura de 40 m (diámetro de perla), una capa uniforme de compuesto de 30.000 microperlas está acoplado a las placas de múltiples pocillos con inserción de membrana. La suspensión así que se dio cuenta de microesferas y las neuronas se mantiene durante aproximadamente 6-8 horas en el interior de las placas de múltiples pocillos con inserto de membrana. Una vez quelos pasos antes mencionados se han completado, la construcción de la red 3D pueden comenzar. En este tiempo, la mezcla de las neuronas y las microperlas se retira de las placas de múltiples pocillos con inserción de membrana y se coloca en la red neuronal 2D anteriormente chapada en el área definida por la restricción de PDMS (Figura 3D). Durante este procedimiento, una pérdida de aproximadamente el 20-30% de las neuronas se produce debido a (i) las manipulaciones mecánicas y (ii) para la transferencia fuera de la membrana. Al tener en cuenta el área de la base de la restricción (7,06 mm 2) y una altura de 178,56 m (5 capas de perlas), y dividiendo el número de células por el volumen del cilindro ideales formado por las 5 capas de perlas, el 3D resultante neuronal densidad celular de la red es de unos 80 000 células / mm 3.
Figura 3. Bosquejo de los pasos fundamentales para crear redes neuronales en 2D y 3D. (A) Chapado of neuronas en el área activa de un MEA. La suspensión de las neuronas se extendió sobre la superficie MEA, previamente acondicionado con factores de adhesión y delimitada por la restricción de PDMS. Este paso permite realizar: i) una red neuronal 2D clásica acoplado a MEA; ii) la primera capa de una red 3D a partir de los cuales se registró la actividad electrofisiológica. (B) microperlas y (C), las neuronas se entregan a la superficie de las placas de múltiples pocillos con inserto de membrana después de 6-8 horas. (D) La suspensión de las neuronas y las microperlas se mueve desde la placas de múltiples pocillos con membrana de inserción a la red 2D. La repetición de este paso varias veces permite definir una densa estructura 3D multi-capa. (E) Cuando se ha completado la estructura 3D, se añade una gota de medio, y la estructura resultante se almacena en la incubadora durante 48 hr. (F ) Después de 48 h, la cultura 3D está completamente rellenado con el volumen final del medio.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una vez que la primera capa se ha colocado, la misma operación se repite para obtener un conjunto 3D lleno. La estructura 3D resultante se reorganiza la definición de un cristal coloidal que se constituye en una estructura compacta componen de cerca de 5-8 capas de microesferas y neuronas (Figura 4). Una vez que se forman todas las capas, la red 3D tiene que ser rellenado con una gota de 300 l de medio (Figura 3E). En esta etapa, las redes de 3D acoplados a los AMA pueden ser almacenados en la incubadora durante 48 hr. Después de eso, se añade 1 ml de medio para llenar el anillo del MEA (Figura 3F).
Una vez que todas las capas se han montado, neuritas crecen sobre el andamio microperla alcanzar una densidad celular final de aproximadamente 80.000 células / mm 3. Vale la pena noticing que el valor obtenido no está lejos de 92.000 células / mm 3, la densidad neuronal medio en el ratón corteza cerebral 14.
La figura 4 muestra tres ejemplos de redes 3D acoplados a los AMUMA capturados mediante microscopía confocal vertical. En la Figura 4A, la DIC (contraste de interferencia diferencial) imagen muestra una sola capa de perlas acopladas a la superficie MEA; el microscopio se acopló con 20,0 NA 0.50 objetiva agua y las imágenes fueron adquiridas con Transmitido PMT incluye para el microscopio y un láser de argón (488 nm). Las imágenes muestran muy claramente la disposición espacial de los electrodos (puntos negros) y la organización espacial regular de las microperlas.
En la Figura 4B, una tinción de inmunofluorescencia para Map-2 (señal roja) muestra la distribución de las arborizaciones dendríticas y somas de las neuronas alrededor de microperlas directamente acoplados al plano del electrodo de MEA (la presencia de los contactos negros se puede observar). La figura 4B es una proyección máxima de una secuencia de pila Z- (108 micras) con el tamaño del paso es igual a 1,53 m. Las imágenes fueron adquiridas con el objetivo 40,0 NA 0,80 de agua; la excitación es Argon Laser (488 nm), el ancho de banda de emisión de 496nm-655nm.
Finalmente, la Figura 4C muestra la proyección máxima de una secuencia de -stack z (187,79 m) de un cultivo del hipocampo 3D (tamaño de paso es 2,27 m). El -stack secuencia z fue adquirido con el objetivo 25,0 NA 0.95 agua. Para el canal verde, se utilizaron un 488 nm láser de argón y una emisión de ancho de banda del filtro 499nm-551nm. Para el canal rojo, se utilizaron un láser de 543 nm y una emisión de ancho de banda del filtro 555nm-645nm. Los canales fueron adquiridos en el modo de secuencia. Una red altamente interconectada emerge donde las neuronas están etiquetados para NeuN expresan en las neuronas post-mitóticas maduros (señal roja) y para Gaba (señal verde, yelbaja en combinación). Anticuerpo Gaba reveló una positividad para neuronas inhibitorias tanto en la somata y neuritas.
Figura 4. Tres ejemplos de redes de 3D capturados por microscopía confocal. (A) DIC (contraste de interferencia diferencial) imagen que muestra una sola capa de perlas acopladas a la superficie MEA; la disposición espacial de los electrodos (puntos negros) es observable. (B) tinción de inmunofluorescencia para Map-2 (señal roja) muestra la distribución de las arborizaciones dendríticas y somas de las neuronas alrededor de microperlas directamente acoplados al plano de electrodo de la MEA. ( C) la proyección máxima de un -stack secuencia z (187,79 m) de una cultura en 3D que muestra una red altamente interconectado donde las neuronas están etiquetados para NeuN expresa en neuronas post-mitóticas maduros (señal roja) y para Gaba (señal verde, amarillo en la fusión ). Gaba rev anticuerpoealed una positividad para las neuronas inhibitorias tanto en el somata y neuritas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para comprender si la presencia de una estructura 3D modula la dinámica de la red, la actividad electrofisiológica así generada se comparó con redes neuronales en 2D convencional, cultivado sobre MEAs, que representan el modelo de referencia.
Figura 5. Comparación entre la dinámica de la red exhibidas por 3D (columna izquierda) y 2D (columna derecha) cultivos de hipocampo En cada escala de tiempo (A: 1,200 seg, B: 300 seg; C: 60 segundos; D: 10 seg)., asambleas 3D muestran una variedad de firmas de actividad (es decir, las ráfagas de red de corto y largo, Rematar al azaractividad, explosiones sincronizadas), mientras que las 2D muestran una actividad estereotipada más pronunciado con ráfagas única sincronizados alta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 muestra dos parcelas de trama de dos experimentos representativos realizados en 3D (paneles de la izquierda) y 2D (paneles de la derecha) la cultura del hipocampo durante la cuarta semana in vitro. Estos gráficos muestran la actividad eléctrica de la red de grabado en todos los electrodos activos (es decir., Electrodos con una tasa de disparo superior a 0,1 espigas / s).
La dinámica de las redes 2D muestran una actividad cuasi-sincrónico compuesto principalmente de ráfagas de red. La firma de esta dinámica es la presencia de eventos sincronizados que implican la mayoría de los canales de registro intercalados por periodo en el que se registra casi ninguna actividad (véase el panel derecho deFigura 5D). Este comportamiento se puede apreciar en diferentes escalas de tiempo, ya que los diferentes niveles de subrayado ampliación.
En el caso de una red 3D, la firma de la dinámica de la red consiste en un repertorio más amplio de actividades que se caracteriza por: (i) la sincronía menos global, (ii) la actividad de un rápido aumento más al azar, (iii) los períodos en los que los sub-redes (es decir, , un subconjunto de microelectrodos) presentan una actividad más sincrónica con la ocurrencia de ráfagas de red. Además, la duración de las ráfagas de red es más variable, así: existe la presencia de ráfagas de red con una duración similar a la observada en las redes 2D, pero también hay ráfagas de red más largos. Una caracterización completa y cuantitativa de la dinámica emergente 3D obtenidos mediante el uso de un métodos tales se pueden encontrar en 16. Como se preveía, las exposiciones de redes neuronales en 3D también un "Rematar al azar" significativo y no sincrónica reventar unctividad. La plausibilidad de la dinámica generada por estas estructuras 3D se han impermeabilizado con algunos experimentos de control (por ejemplo, la presencia de una red 2D junto a un MEA con una pila de microesferas desnudas y redes 3D ensamblados en las microesferas con un MEA desnuda), como reportado en 16.
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Discussion
En esta obra, una novela experimental en la plataforma vitro formado por 3D diseñado cultivos neuronales, junto a los acuerdos ambientales multilaterales para electrofisiología red se ha presentado. El uso de microperlas como andamio para permitir la consecuencia a lo largo del eje x neurítico z se ha adaptado para ser integrado con el MEA planar. De esta manera, los resultados obtenidos micro-sistema en un modelo in vitro de 3D válido y fiable para estudiar la dinámica electrofisiológicos emergentes 16.
MEA grabación de puesta a punto
Dispositivos MEA consisten en una cámara de cultivo con una serie integrada de micro-electrodos de sustrato-incrustado capaces de medir señales extracelulares de los tejidos electro-activa. Las señales registradas típicas consisten en picos (es decir, la variación de voltaje único supra-umbral que representa la actividad eléctrica de una o más neuronas) y ráfagas (es decir, la secuencia de picos muy a menudo envasados Occurring simultáneamente en varios canales). Las grabaciones de la actividad neuronal redes con sistemas basados en los AMUMA producen gran cantidad de datos (por ejemplo, un experimento de 4 horas con canales MEA 60 produce un registro de alrededor de 15 GB). Esto implica la necesidad de disponer de herramientas eficientes para procesar y analizar los datos, especialmente en el caso de los estudios que requieren grabaciones largas. En general, la grabación de las señales electrofisiológicas se obtiene mediante una transducción extracelular directo con los cultivos neuronales, y la adquisición de una señal de tensión. Después de una etapa de amplificación y filtrado, las señales son muestreadas de 10-50 kHz y se almacenan. Las señales en bruto son entonces pico detectado por una herramienta de software desarrollado a medida. El sistema de grabación consistió en (1) amplificador de MEA, (2) ordenador personal equipado con A / D tarjeta de adquisición, (3) el software de grabación, (d) el sistema de calefacción y control de temperatura, (4) CO2 atmósfera mantenimiento y la evaporación de prevención sistemas.
losconstrucción de la red neuronal 3D pasa a través de dos pasos críticos: el primero es la distribución de la cantidad correcta de los granos en las placas de múltiples pocillos con la superficie de inserción de membrana, la segunda es la transferencia de la suspensión de microperlas con neuronas adherentes de la multipocillo placas con membrana de inserción a: (i) la red neuronal 2D sembraron en la zona activa de la MEA (primera capa); (ii) las capas ya asentados. Esta operación debe repetirse tantas veces como el número de capas requeridas. Durante la primera semana de la cultura, un rápido crecimiento de las extensiones neuríticas tiene lugar alrededor de las microesferas que pertenecen a las diferentes capas. La estrecha conexión entre las neuronas y las microesferas estabiliza las muestras biológicas y permite moverla de la incubadora para cambiar / reemplazar el medio y grabar con el amplificador MEA la actividad eléctrica sin preocuparse de dañarlo.
Dado que la actividad electrofisiológica de toda la redel trabajo se registra sólo desde la capa inferior (es decir, la que está directamente acoplado a la MEA), el área activa debe estar cubierto por una red 2D convencional. Las otras capas se añadirán paso a paso sobre el 2D uno, y las conexiones de largo alcance se repartirán entre las capas. Prácticamente, se añaden las otras capas 6-8 horas más tarde que el 2D uno por deponer la mezcla de las neuronas y microperlas. La elección de esta ventana temporal permite la formación de unas pocas conexiones sinápticas en la capa 2D, y garantiza la posibilidad de establecer conexiones a las capas superiores también.
Dos factores hacen que el uso de placas de múltiples pocillos con membrana insertar necesario darse cuenta de las redes de 3D: (i) desde las neuronas y las microbolas presentes diferentes velocidades de sedimentación, el uso de placas de múltiples pocillos con inserción de membrana garantiza una distribución uniforme de las neuronas en la parte superior de las microperlas : en promedio, cada microbead puede estar rodeado por el mismo número de neuronas. (ii) By la explotación de las propiedades elásticas de las placas de múltiples pocillos con inserto de membrana, el lavado a contracorriente de la solución de microperlas acopladas a las neuronas es más fácil que el uso de superficies sólidas como el policarbonato multi-pozos.
El trabajo presentado sigue el enfoque propuesto por Pautot y compañeros de trabajo 15: en ese estudio el uso de perlas de sílice proporcionó una superficie de crecimiento lo suficientemente grande para que los cuerpos celulares neuronales para adherirse y para sus procesos para crecer, madurar y producir especializaciones pre y post-sinápticas . Una alternativa válida al uso de perlas de andamio proviene de hidrogeles matrices o bioactivo y perlas biodegradables compuestos de biopolímero natural como quitosano. La quitina y su derivado desacetilado, quitosano, no son tóxicos, antibacteriano, biocompatible y biopolímeros biodegradables. La constante de tiempo de dicho proceso de biodegradación es compatible con la red superan con la edad 20,21.
Este estudio puede constituir una referencia work para el futuro desarrollo de avanzados sistemas modelo neuronal 3D para estudiar sistemáticamente la interacción entre la dinámica y la estructura de la red. En poco tiempo, esperamos ser capaces de transferir el constructo de red 3D en una nueva generación de dispositivos de 22. La técnica de fabricación implica la producción de electrodos en forma de micro-pilares en unas alturas variables entre 50 y 350 micras.
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Acknowledgments
Los autores agradecen a Giorgio Carlini por el apoyo técnico en el desarrollo de la estructura de confinamiento y Dott. Ornella LoBrutto para la revisión a fondo del manuscrito. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del 7º Programa Marco de la Unión Europea (TIC-FET FP7 / 2007-2013, FET joven Exploradores esquema) bajo acuerdo de subvención 284.772 CEREBRO DEL ARCO (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
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