Introduction
ברשתות מבחנה דו-ממדיות (2D) עצביות מצמידים את מיקרו-אלקטרודה מערכים (MEAs) עלה יפה אימץ ללמוד את יחסי הגומלין בין דינמיקה העצבית והקישוריות הבסיסית מודל ניסיוני זהב סטנדרטי. במהלך הפיתוח, נוירונים לשחזר רשתות מורכבות המציגות גם פעילות definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (כלומר, התפרצויות, התפרצויות רשת, פעילות spiking אקראית). MEAs להקליט את פעילות אלקטרו מאתרים רבים (בין עשרות לאלפים microelectrodes), המאפשר חקירה מפורטת של הדינמיקה הביעה ברמת הרשת. בנוסף, השימוש בתרבויות ניתק עושה possibile לעצב מהונדסות-רשתות. זה קל יותר להבין בדרך זו את היחסים הפונקציונליים בין פעילות אלקטרו נרשמה והפרמטרים של ארגון הרשת כמו תא צפיפות 3, מידת המודולריות 4,5, נוכחות של פופ העצבי הטרוגנית6 ulations, וכו 'עם זאת, כל במבחנה בתאים בתרבית ניתקו מבוססת על רשתות עצביות 2D. גישה זו מובילה לפשטנותן ביחס למערכת בvivo (3 ממדים מהותי, 3D): (i) בקונוסים מודל, somata וצמיחת 2D הם שטוחים ותולדת האקסונים-דנדריטים לא יכול להתפשט לכל הכיוונים 7. (Ii) במבחנה תערוכת רשתות 2D סטריאוטיפית דינמיקת אלקטרו נשלטה על ידי מתפוצץ פעילות הכרוכה ברוב הנוירונים של הרשת 8.
לאחרונה, פתרונות שונים פותחו כדי לאפשר הבנייה של במבחנה 3D ניתק רשתות עצביות. הרעיון המשותף מורכב ביצירת פיגום שבו תאי עצב יכולים לגדול בצורה 3D. כגון פיגום יכול להתממש עם ג'לי פולימר ומטריצות נקבוביות מוצקות 9-13. על ידי ניצול התכונות מכאניות של הפולימרים, ניתן להטביע בתוך תאים thesמבני דואר על ידי הגדרת בלוק אחיד של תרבויות 3D של neurospheres 11. התכונה העיקרית של גישה זו היא הרכוש המכני הנוקשה של neurospheres 9,12. עם זאת, חומרים אלה נקבוביות מוגבלים, והם לא מבטיחים נדידת תאים בתוך המטריצה. כדי להתגבר על חסרון זה, פתרון אפשרי מורכב בחיתוך המטריצה לתוך מודולים 'יחידה'. למרבה הצער, את מגוון הגודל וצורה של החלקיקים עלול להקשות על האריזה למבנים שכבתיים רגילים. ב -7, קאלן ועמיתים לעבודה שנועדו לבנות עצבי 3D מורכב מתאי עצב ו / או האסטרוציטים בתוך פיגום מבוסס מטריקס ביו. כגון רקמה עצבית מהונדסת אפשרה בחקירות מבחנה ללמוד ולתפעל תגובות נוירו-ביולוגיות בתוך מיקרו-סביבות 3D. מודל זה מורכב מתאי עצב וגליה מופצים ברחבי המטריצה תאית (ECM) ו / או פיגומי הידרוג'ל (500-600 מיקרומטר עבה). בשיתוף זהndition, כדאיות אופטימלית תא (יותר מ 90%) נמצאה על ידי תאי ציפוי בצפיפות סופית של כ 3,750 - 5,000 תאים / מ"מ 3. יש לציין שערך כגון צפיפות נמוך בהרבה מזה שבמצב in vivo, שבו צפיפות התאים בקליפת מוח העכבר היא כ 90,000 תאים / מ"מ 3 14. כדי להתגבר על מגבלה זו Pautot ועמיתים לעבודה 15 הבינו במבחנה מערכת 3D שבו צפיפות תאים וקישוריות לרשת נשלטות להידמות בתנאי vivo תוך שהוא מאפשרים הדמיה של הרשת בזמן אמת. למעשה, שיטה זו מבוססת על הרעיון שניתק נוירונים בתרבית יכולים לגדול על microbeads סיליקה. חרוזים אלה מספקים משטח צמיחה גדול מספיק עבור גופי תא עצביים לדבוק ולarborizations לגדול, בוגר, להאריך, ולהגדיר קשרים סינפטיים לנוירונים אחרים. שיטה זו מנצלת את תכונות הרכבה הספונטניות של חרוזים פיזור מונו לFOrm 3D שכבתי מערכי משושים המכילים תת שונה של תאי עצב בשכבות שונות עם קישוריות מוגבלת, בין הנוירונים בחרוזים שונים. צפיפות התאים הושגו בשיטה זו הייתה על 75,000 תאים / מ"מ 3.
לאחרונה, יש לנו השיטה מותאמת של Pautot לMEAs 16: התוצאות שהתקבלו מראות כי פעילות אלקטרו 3D מציגה רפרטואר רחב יותר של פעילויות מזו באה לידי ביטוי על ידי רשתות 2D. תרבויות בוגרות 3D תערוכה דינמית משופר שבה שני פרץ הרשת ולהתקיים פעילות ספייק אקראית. באופן דומה, טאנג-Schomer ועמיתים לעבודה 17 הבינו פיגום נקבובי מבוסס חלבון משי אשר שומר תרבות בקליפת המוח עיקרי במבחנה במשך כמה חודשים, ורשמו את פעילות אלקטרו באמצעות אלקטרודה טונגסטן.
בעבודה זו, הפרוצדורות לבנות רשתות עצביות 3D מצמידים את MEAs יתואר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הטיפול בבעלי חיים האירופי החקיקה (2010/63 / האיחוד האירופי), על ידי משרד בריאות האיטלקי בהתאם לDL 116/1992 ובהנחיות של אוניברסיטת גנואה (Prot. נ 13,130, מאי 2011). כל המאמצים שנעשו כדי להפחית את מספר בעלי החיים לפרויקט וכדי למזער את סבלם.
1. הכנת חומרים ותומכים
- לבנות העובש לבנות PDMS האילוץ (פולי-דימתיל-siloxane) באמצעות מכונת כרסום CNC (מחשב נומרית בקרה). כגון עובש מתממש בפוליקרבונט עם הצילינדר המרכזי בpolytetrafluoroethylene (PTFE). חומר זה מאפשר מיצוי קל של המסכה פעם PDMS הקשיח.
הערה: העיצוב של העובש שבוצעה על ידי בעזרת מחשב-עיצוב (CAD) ולאחר מכן מועברת למכונת כרסום CNC. - הכן את אלסטומר PDMS. PDMS הוא פולימר אורגני. הוא מורכב משני אלמנטים, סוכן ריפוי ופולימר. לערבב אותם על ידי יחס נפח של 1:10, חלק אחד של סוכן ריפוי ותשעה חלקים של פולימר. לשים את שני המרכיבים בצלחת פטרי, לנער ולהכניס את התערובת בתא הוואקום במשך 10 דקות כדי למנוע בועות אוויר. 3 גרם של PDMS מספיקים לאילוץ אחד.
- לבנות את אילוץ PDMS. הכנס את חומר PDMS לתוך להרקב והכנסתי אותו לתנור למשך 30 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. יש אילוץ PDMS הצורה של גליל אידיאלי עם קוטר חיצוני ופנימי של 22.0 ו -3.0 מ"מ, בהתאמה וגובה של 650 מיקרומטר.
- היום לפני הציפוי, זוג המסכה לאזור הפעיל של מערכי מיקרו-אלקטרודה (MEAs) באמצעות פינצטה תחת סטראו ולעקר את מסכת PDMS בתנור על 120 מעלות צלזיוס.
- לעקר את microbeads הזכוכית (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע של 42.3 מוסמך ± 1.1 מיקרומטר) באתנול 70% לשעה 2 בבקבוקון חרוטי ולסובב EVery 30 דקות כדי לחשוף את כל microbeads.
- הסר את פתרון אתנול מהבקבוקון ולשטוף microbeads שתי פעמים עם מים מעוקרים.
- להתנות חלק משטח MEA המופרד על ידי מסכת PDMS (קוטר שווה ל 3.0 מ"מ) עם 24 μl של פתרון המעורב של פולי-D-ליזין וLaminin ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר המרכזי.
- מעיל microbeads עם חלבוני הדבקה, Laminin ופולי-D-ליזין ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר ולהשאיר אותם לילה בחממה על 37 מעלות צלזיוס, להשיג ברשת עצבית יציבה וארוכה טווח.
- הסר את גורמי ההידבקות הן ממשטח הזכוכית של MEA ומmicrobeads הזכוכית. לשאוב כ -95% מפתרון הציפוי עם טפטפת ולהחיל volume- קטן 24μl- של מים סטריליים על פני השטח MEA. לשאוב שוב יותר מ -95% מהמים ולתת יבשים MEA מתחת למכסת המנוע למינרית עבור שעה 1 לפני ציפוי התאים.
הערה: במקרה של microbeads במקום, לשאוב את הציפויפתרון ולעשות כביסה ראשונה עם מים מעוקרים ואחד שני עם המדיום הבסיסי והתוספת שלה כגון B27, כדי להתנות את משטח הזכוכית שבו נוירונים יהיו מצופים. אל תתנו microbeads יבש. להשאיר אותם בהשעיה במדיום התרבות בתוך הבקבוקון. - להפיץ, באמצעות פיפטה -200 μl-, ההשעיה של microbeads טופל (כ 32,000) על צלחת multiwell עם הוספת קרום (קוטר נקבובית 0.4 מיקרומטר) שבו הם יהיו עצמיים להרכיב יוצרי שכבה אחידה.
- מלא היטב בכל הקרום עם 0.5 מיליליטר של מדיום ולשים אותו בחממה (T = 37.0 מעלות צלזיוס, CO 2 = 5%) עד נוירונים מוכנים להיות מצופה (3.2).
2. Dissection של עוברים ודיסוציאציה של רקמות
- חולדות בוגרות בית נקבה (200-250 גרם) בטמפרטורה קבועה (C 22 ± 1 °) ולחות היחסית (50%) בלוח זמני אור הכהה רגיל (אור-על 07:00-19:00) במתקן בעלי חיים. ודא שמזון ומים זמינים באופן חופשי.
- הרדימי נקבת עכברוש הריון לאחר 18 ימים של פיתוח (E18) באמצעות 3% isoflurane. לאחר מכן, להקריב בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם.
- הסר hippocampi מכל עובר חולדה ולהכניס אותם לתוך הפתרון של קרח הקר האנק המאוזן מלח ללא Ca 2 + וMg 2 +. ביום 18 בהיפוקמפוס פיתוח ורקמות קליפה רכים מאוד ולא צריכים לחתוך לחתיכות קטנות. ניתן למצוא פרטים נוספים 18,19.
- לנתק את הרקמה ב0.125% מהפתרון של טריפסין / האנק מכיל 0.05% מDNAse ל18-20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את פתרון supernatant עם טפטפת פסטר ולעצור את העיכול אנזימטי על ידי הוספה בינונית עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) במשך 5 דקות.
- הסר את המדיום עם FBS ולשטוף פעם אחת עם המדיום עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר. הסר שוב בינוני עם PIP פסטרette ולמלא אותו שוב עם כמות קטנה (500 μl) של מדיום גידול עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
- לנתק את גלולה הרקמה מכאנית עם פיפטה פסטר צרה עד השעיה חלבית של תאים היא לכאורה. אין צורך לצנטריפוגה ההשעיה התא.
- לדלל את הנפח הקטן של השעיה תא עם מדיום הגידול להשיג נפח סופי של 2.0 מיליליטר. לספור את הריכוז הסלולרי שהושג עם תא hemocytometer. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי של 600-700 תאים / μl.
3. תא ציפוי
- תאי פלייט בצפיפות של כ -2,000 תאים / מ"מ 2 על האזור הפעיל של MEA, שהוגדרו על ידי אילוץ PDMS ליצור רשת עצבית 2D.
הערה: כל ההיפוקמפוס מכיל כ 5 x 10 5 תאים, (1 x 10 6 לעובר יחיד). לנתח 6 עוברים כדי לקבל סכום כולל של 6 x 106 תאים 2 מיליליטר, וריכוז משוער של 3,000 תאים / μl. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי וצלחת על 600-700 תאים / μl. אם אזור MEA המופרד על ידי אילוץ PDMS הוא על 7.065 מ"מ 2, והמספר הכולל של תאים מצופים 600 תאים / μl x 24 μl = 14,400 תאים, הצפיפות הסופית של 2,038 תאים / מ"מ 2. - הנח את מכשירי MEA לתוך החממה עם CO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס.
- הפץ 160 μl של ההשעיה עם ריכוז תא של 600-700 תאים / μl (כ -100,000 תאים) על פני השטח של monolayer microbeads ממוקם בתוך צלחות multiwell כדי להשלים את השלב המקדים לבניית התרבות תלת-ממדית. שים את צלחות multiwell בחממה עם CO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס.
בניית 4. רשת העצבית 3D
- 6-8 שעות לאחר הציפוי, להעביר את ההשעיה (microbeads עם הנוירונים) מהצלחות multiwell מאוד בזהירות בתוך השטח המופרד על ידי אילוץ PDMS באמצעות פיפטה נקבעה לנפח של כ 30-40 μl. לאחר כל העברה, לחכות כחצי דק, כדי לאפשר microbeads לעצמי להרכיב במבנה קומפקטי משושה.
- לאחר שכל השכבות מופקדות וספונטאניות התאספו, למלא עם ירידה גדולה של כ -300 μl של מדיום העליון של האזור המופרד על ידי אילוץ PDMS.
- שים את מבנה 3D מצמידים את MEA בחממה (T = 37.0 מעלות צלזיוס, CO 2 = 5%) למשך 48 שעות לפני הוספת נפח סופי (כ 1 מיליליטר) של תרבות מדיום גידול עם התוספת שלה.
הערה: קחו למשל את המספר הכולל של חרוזים על צלחות multiwell עם הוספת הקרום (30,000) ומספר חרוזים בשכבה אחת על גבי מכשיר MEA (6000). מבנה 3D וכתוצאה מכך מורכב של 5 שכבות של מילcrobeads ותאים. אם ניקח בחשבון שהרשת העצבית 3D היא לא גיאומטרית מושלמת, מבנה 3D וכתוצאה מכך יכול להיות מורכב משכבות 5-8. - היום לאחר ציפוי, להוסיף בזהירות את הנפח הסופי של המדיום (כ -900 μl) בתוך טבעת MEA. לשמור על תרבויות 3D בCO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס במשך 4-5 שבועות. להחליף מחצית בינוני פעם בשבוע.
5. מיקרוסקופיה confocal רכישה
- תקן את הדגימות הביולוגיות לשלב של מיקרוסקופ בבעל. הגדר את הלייזר (ארגון, 496-555 ננומטר), מהירות הסריקה (400 הרץ) שבו לרכוש את התמונה, רווח וקיזוז (0.3%) של PMT עבור כל תמונה כדי ללכוד את מסנן פליטת רוחב פס הנכון וכדי כדי למנוע הרוויה ולהגדיל את יחס האות לרעש. תוצאות סעיף מדווח הערכים שימשו לרכישת התמונות של איור 4.
- לרכישת z -stack רצף, האשוחרח 'בחר, הערך של עמדת z של החלק העליון והשכבה התחתונה של המדגם, ולאחר מכן בחר את גודל צעד כדי להפוך את הרכישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. בהליך ניסיון זה, תפקיד רלוונטי הוא שיחק על ידי microbeads המגדירים את הפיגום המכני לצמיחה של הרשת העצבית 3D איורים תצוגת 1A ו- B ההסדר של microbeads (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע מוסמך של 42.3 ± 1.1 מיקרומטר) במטוס. הייחוד של מבנים כאלה הוא שmicrobeads באופן ספונטני עצמי להרכיב-הגדרת גיאומטריה קומפקטית משושה (איור 1 ו- C). הפיגום כך נוצר מבטיח משטח צמיחה עקבי לneurites ומרחב הבין מספיק גדול להחלפת חילוף החומרים של גופי התא. ממד microbead זה מוכיח להיות פשרה סבירה למרווח ביניים וצפיפות עצבית סופית. בהתחשב בכך שמבנה PDMS משחזר גליל "אידיאלי", ומאז גורם השפעת מבנה המשושה הקומפקטי (HPF) שווה ל0.74, המספר המרבי של חרוזים (בקוטר של 4081; מ ') בתוך אילוץ PDMS הוא כ -100,000, אשר תואם לכ -6,000 microbeads לכל שכבה. כפי שהוסבר בסעיף הפרוטוקול, microbeads אלה עם גורמי ההידבקות (כלומר, Laminin ופולי-D-ליזין) מיזוג מראש. הליך זה מבטיח כי נוירונים לדבוק microbeads. 1D איור מראה דוגמא שבו שלושה תאי עצב הם מצמידים לmicrobead בקוטר של 40 מיקרומטר.
איור 1. תמונות של microbeads השתמש כדי ליצור את הפיגום לרשת העצבית. (A, B) שתי דוגמאות של monolayers של microbeads על פני השטח של צלחת multiwell עם הוספת קרום. Microbeads (C) התיישב תחת כוח הכבידה והורכב באופן ספונטני למערכי משושה 2D. ברגע שהשכבה הראשונה היא ארוזה באופן מלא, חרוזים אחרים הוסיפו, לבנותing שכבה שנייה הורתה נתקל באותה הסימטריה משושה. בנוסף נוסף של microbeads הביא בבניית הרכבה 3D ארוזה. השטח הפנוי בין microbeads מלא על ידי תהליכים עצביים וגופי תא. (ד) שלושה נוירונים מעוגנים על פני השטח של microbead יחיד, התנו בעבר עם גורמי הידבקות (Laminin ופולי-D-ליזין). אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
הממשק של microbeads ונוירונים באזור הפעיל של MEA בשל אילוץ אלסטומרי (איור 2 ג), הבין עם העובש המתואר ב2A דמויות ו- B. איור 2A מציג את הפריסה ואת הממדים שנבחרו. האזור הפעיל של MEA הוא מופרד על ידי צימוד מבנה PDMS של איור 2C למצע MEA (איור 2 ד). בדרך זו, תאי עצב נאלצים לדבוק באזור אלקטרודה הפעיל של MEA. בהמשך לכך, ערימות microbead הזכוכית עם נוירונים חסיד תשוכנה בשכבה ראשונה זה. איור 2 ד מציג חתך של התצורה הסופית, שבו התפקיד של מבנה PDMS יכול להיות מוערך באופן ברור. שטח התחום במבנה PDMS מכיל התערובת של microbeads ונוירונים (אבקה לבנה בפנל התחתון של איור 2 ד). יש מבנה PDMS הצורה של גליל נבנה בתבנית המתוארת באיור 2 עם הממדים הבאים: קוטר חיצוני ופנימי של 22.0 ו -3.0 מ"מ בהתאמה וגובה של 650 מיקרומטר. העובש נבנה באמצעות פוליקרבונט וPTFE ההופכים חומר חלק ועמיד אידיאלי כדי להקל על החילוץ של אלסטומרי אילוצי mask.The PDMS להציג חיים קצרים יותר, שכן המאפיינים הדביקים של ירידת PDMS לאחר כל שימוש. בדרך כלל , כל מבנה PDMS יכול לשמש בהצלחה שלוש פעמים.
איור 2. חומרים לבניית הרשת העצבית 3D. תמונת עיצוב () ו- (ב) לתבנית המשמשת ליצירת האילוץ הפיזי. הגליל בקוטר 3 מ"מ האפור מתאים לחור של המגבלה המתוארת ב( C). (ג) PDMS אילוץ ממוקמת באזור הפעיל של מערך מיקרו-אלקטרודה (MEA). השימוש במחסום פיזי כגון מאפשר להכיל את microbeads בתוך אזור יעד (כ -7 מ"מ 2) ולהגביל את הפיתוח של רשת 3D. (ד) החתך של מערכת MEA ואילוץ. Microbeads (מתואר על ידי מיקרוסקופ בפינה הימנית העליונה) מלא לתוך החלל המופרד על ידי אילוץ PDMS (פנל תחתון)."Target =" _ 080fig2large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
לאחר הכליאה של האזור הפעיל של MEA באמצעות מסכת PDMS, הפרוטוקול ממשיך כמתואר בלוחות של איור 3, המתאר את השלבים העיקריים לממש את ההרכבה של תאי עצב וmicrobeads.
הצעד המקדים הראשון מורכב בציפוי ניתק נוירונים על פני השטח MEA שקודם לכן מראש מצופה עם מולקולות הידבקות Laminin ופולי-D-ליזין (איור 3 א). זה חיוני כי הרשת העצבית 2D שומרת ישירות לאזור הפעיל של MEA: רק בתנאים אלה, ההקלטה של אותות אלקטרו (כלומר, קוצים ופרצי) היא אפשרית. חלק ראשון זה של הפרוטוקול מתאים להליך הסטנדרטי המשמש לצלחת הנוירונים 2D. הבנייה בפועל של מערכת 3D מתוארת ב3B דמויות, C, ו- D (איור 3); לאחר מכן, השעיה 160 μl עם ריכוז תא של 600-700 תאים / μl (כ -100,000 תאים) מופצת על monolayer microbeads (איור 3 ג). בהתחשב בכך שתאים יכולים לכבוש במחצית שטח חרוז, הכולל המשטח החופשי הוא 75 מ"מ 2. צפיפות התאים בmonolayer microbeads היא כ -1,500 תאים / מ"מ 2. צלחות multiwell מנוצלות עם הוספת קרום להציג קרום נקבובי עם פני השטח של 33.6 מ"מ 2. על ידי בהתחשב צורה גלילית וירטואלית בשטח בסיס שווה למשטח הקרום הנקבובי וגובה של 40 מיקרומטר (קוטר חרוז), שכבה אחידה המורכבת של 30,000 microbeads היא מצמידים את צלחות multiwell עם הוספת קרום. ההשעיה כך הבינה מmicrobeads ונוירונים נשאר במשך כ 6-8 שעות בתוך צלחות multiwell עם הוספת קרום. ברגע שהצעדים האמורים הושלמו, הבנייה של רשת 3D יכול להתחיל. בשלב זה, התערובת של תאי עצב וmicrobeads היא להסיר את צלחות multiwell עם הוספת קרום והניחה על הרשת העצבית 2D מצופה בעבר על האזור שהוגדר על ידי אילוץ PDMS (איור 3D). במהלך הליך זה, בהפסד של כ 20-30% מתאי העצב מתרחש עקב מניפולציות ומכאניות (i) (ii) להעברה מחוץ לקרום. על ידי בהתחשב באזור הבסיס של האילוץ (7.06 מ"מ 2) וגובה של 178.56 מיקרומטר (5 שכבות של חרוזים), וחלוקת מספר התאים בנפח של הגליל האידיאלי שהוקם על ידי 5 השכבות של חרוזים, 3D וכתוצאה מכך צפיפות תאי רשת עצבית היא כ -80,000 תאים / מ"מ 3.
איור 3. סקיצה של הצעדים הבסיסיים ליצירת רשתות עצביות 2D and 3D. () ציפוי oנוירונים F באזור הפעיל של MEA. ההשעיה של תאי עצב היא מצופה על פני שטח MEA, התנתה בעבר עם גורמי הידבקות ומופרד על ידי אילוץ PDMS. צעד זה מאפשר להבין: א) רשת עצבית 2D קלאסי מצמידים את MEA; השכבה הראשונה של רשת 3D שמפעילות אלקטרו תירשם ii). microbeads (ב) ו- (תאי עצב C) מועברים אל פני השטח של צלחות multiwell עם הוספת קרום לאחר 6-8 שעות. (ד) ההשעיה של תאי עצב וmicrobeads מועבר מהצלחות multiwell עם הוספת קרום לרשת 2D. חזרה על שלב זה כמה פעמים מאפשר להגדיר מבנה 3D רב שכבתי צפוף. (E) כאשר מבנה 3D הושלם, ירידה של מדיום הוא הוסיפה, וכתוצאה מכך המבנה מאוחסן בחממה במשך 48 שעות. (F ) לאחר 48 שעות, תרבות 3D ממולאת לחלוטין עם הנפח הסופי של המדיום.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ברגע שהשכבה הראשונה כבר ממוקמת, את אותה הפעולה חוזרת על עצמו כדי להשיג הרכב 3D ארוז. מבנה 3D וכתוצאה מכך מארגן מחדש את עצמו הגדרת גביש colloidal ש- מרכיב עצמי במבנה קומפקטי מורכבת מכ 5-8 שכבות של microbeads ונוירונים (איור 4). לאחר שכל השכבות נוצרות, רשת 3D יש למילוי מחדש עם ירידה של 300 μl של מדיום (איור 3E). בשלב זה, ניתן לאחסן רשתות 3D מצמידים את MEAs בחממה במשך 48 שעות. לאחר ש, 1 מיליליטר של מדיום נוסף כדי למלא את הטבעת של MEA (איור 3F).
לאחר שכל השכבות כבר התאספו, neurites לגדול מעל פיגום microbead להגיע צפיפות תאים סופית של כ -80,000 תאים / מ"מ 3. ראוי פוסט-היפנוטיתing שהערך המתקבל הוא לא רחוק מ92,000 תאים / מ"מ 3, הצפיפות העצבית הממוצעת בקליפת מוח העכבר 14.
איור 4 מציג שלוש דוגמאות של רשתות 3D מצמידים את MEAs נתפס באמצעות מיקרוסקופיה confocal זקוף. באיור 4 א, דסק"ש (התערבות ההפרש לעומת זאת) תמונה מראה שכבה אחת של חרוזים מצמידים את פני השטח MEA; מיקרוסקופ היה בשילוב עם 20.0 אובייקטיבי מים NA 0.50 והתמונות נרכשו עם PMT מועבר כלולה למיקרוסקופ וארגון לייזר (488nm). התמונות מראות בבירור את הפריסה המרחבית של אלקטרודות (נקודות שחורות) וארגון המרחבי הרגיל של microbeads.
באיור 4, מכתים immunofluorescence למפה-2 (אות אדומה) מציג את חלוקת arborizations הדנדריטים וsomata של תאי העצב סביב microbeads ישירות מצמידים את מטוס אלקטרודה שלי(הנוכחות של אנשי הקשר השחורים ניתן לראות). איור 4 היא השלכה המרבית של רצף Z- מחסנית (108 מיקרומטר) עם גודל הצעד שווה ל1.53 מיקרומטר. תמונות נרכשו עם מטרת 40.0 NA 0.80 מים; העירור הוא ארגון לייזר (488 ננומטר), 496nm-655nm רוחב פס פליטה.
לבסוף, איור 4C מציג את ההקרנה המרבית של z -stack רצף (187.79 מיקרומטר) של תרבות בהיפוקמפוס 3D (גודל צעד הוא 2.27 מיקרומטר). Z -stack הרצף נרכש עם מטרת 25.0 NA 0.95 מים. לערוץ ירוק, 488nm לייזר ארגון ו499nm-551nm רוחב פס של מסנן פליטה היו בשימוש. לערוץ אדום, לייזר ננומטר 543 ו555nm-645nm רוחב פס של מסנן פליטה היו בשימוש. הערוצים נרכשו במצב רצף. רשת מחוברת מאוד עולה בי נוירונים מסומנים לNeuN באו לידי ביטוי בתאי עצב לאחר mitotic בוגר (אות אדומה) ולגאבא (אות ירוקה, ילנמוך במיזוג). נוגדן GABA חשף חיוביות לנוירונים מעכבים הן בsomata וneurites.
איור 4. שלוש דוגמאות של רשתות 3D נתפסו על ידי מיקרוסקופיה confocal. תמונה () דסק"ש (התערבות ההפרש לעומת זאת) מראה שכבה אחת של חרוזים מצמידים את פני השטח MEA; הפריסה המרחבית של אלקטרודות (נקודות שחורות) היא נצפית. מכתים immunofluorescence (ב) למפה-2 (אות אדומה) מציגה את חלוקת arborizations הדנדריטים וsomata של תאי העצב סביב microbeads ישירות מצמידים את מטוס אלקטרודה של MEA. ( ג) הקרנה המרבית של z -stack רצף (187.79 מיקרומטר) של תרבות 3D הצגת רשת מחוברת מאוד שבו נוירונים מסומנים לNeuN באה לידי ביטוי בתאי עצב לאחר mitotic בוגר (אות אדומה) ולגאבא (אות ירוקה, צהוב במיזוג ). rev נוגדן GABAealed חיוביות לנוירונים מעכבים הן בsomata וneurites. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כדי להבין אם הנוכחות של מבנה 3D מודולציה דינמיקת הרשת, פעילות אלקטרו כך שנוצרה הושוותה לרשתות קונבנציונליות 2D עצביים גדלו על MEAs, המייצגים את מודל ההתייחסות.
איור 5. השוואה בין דינמיקת הרשת הוצגה על ידי 3D (עמודה שמאלית) ו2D (עמודה ימנית) תרבויות בהיפוקמפוס בכל קנה מידה זמן (: 1,200 שניות, B: 300 שניות; C: 60 שניות; D: 10 שניות)., מכלולי 3D להציג מגוון רחב של חתימות של פעילות (כלומר, התפרצויות רשת קצרות וארוכות, spiking האקראיפעילות, התפרצויות מסונכרנות), ואילו אלה 2D להציג פעילות סטריאוטיפית בולטת יותר עם פרצים רק מסונכרנים גבוהה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 מראה שני מגרשי סריקה של שני ניסויים שבוצעו על נציג 3D (פנלים משמאל) ו2D (לוחות מימין) התרבות בהיפוקמפוס במהלך השבוע הרביעי במבחנה. חלקות אלו מראות את הפעילות החשמלית של הרשת נרשמה בכל אלקטרודות הפעילה (כלומר., אלקטרודות עם שיעור גבוה יותר של 0.1 / s קוצים ירי).
הדינמיקה של רשתות 2D להציג פעילות מעין-סינכרוני מורכבת בעיקר מהתפרצויות רשת. החתימה של דינמי זה היא נוכחותם של אירועים מסונכרנים אשר כרוך ביותר של ערוצי ההקלטה ובין על ידי תקופה שבה אין כמעט פעילות נרשמה (ראה לוח השמאלי של5D איור). התנהגות זו יכולה להיות מוערכת בקני מידת זמן שונים, כמו הרמות של קו תחתון בהגדלה השונות.
במקרה של רשת 3D, החתימה של דינמיקת הרשת מורכבת מרפרטואר רחב של פעילויות המתאפיין ב: (i) תיאום פחות גלובלי, (ii) פעילות spiking האקראי יותר, (iii) תקופות שבהן תת-רשתות (כלומר , קבוצת משנה של microelectrodes) להציג פעילות סינכרוני יותר עם ההתרחשות של התפרצויות רשת. יתר על כן, את משך הזמן של התפרצויות הרשת הוא יותר משתנה גם כן: יש הנוכחות של התפרצויות רשת עם משך דומה לזה שנצפה ברשתות 2D, אבל יש גם התפרצויות רשת כבר. ניתן למצוא אפיון דינמיקת 3D מתהווה מתקבלת באמצעות שיטות כגון שלם וכמותי ב -16. כצפוי, תערוכות 3D עצבי הרשת גם 'spiking האקראי' משמעותי והתפוצצות לא סינכרוניctivity. הסבירות של הדינמיקה שנוצרה על ידי מבני 3D אלה כבר אטומים עם שליטה מסוימת-ניסויים (למשל, נוכחות של רשת 2D מצמידים את MEA עם ערימה של microbeads החשוף ורשתות 3D התאסף על microbeads עם MEA חשוף), כ דיווח ב -16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו, ניסוי חדשני בפלטפורמת מבחנה המורכבת מ3D מהונדס תרבויות עצביות מצמידים את MEAs לאלקטרופיזיולוגיה רשת כבר הציג. השימוש בmicrobeads כפיגום לאפשר תולדת דלקת העצבים לאורך -axis z כבר מותאם להיות משולב עם MEA מישוריים. בדרך זו, תוצאות מיקרו-המערכת שהושגו במבחנת מודל 3D תקף ומהימן כדי ללמוד את דינמיקת אלקטרו מתהווה 16.
הגדרת הקלטת MEA
מכשירי MEA מורכבים מחדר תרבות עם מערך משולב של מוטבע מצע מיקרו-אלקטרודות מסוגלת למדוד אותות תאיים מרקמות אלקטרו-אקטיבי. האותות נרשמו הטיפוסיים מורכבים מקוצים (כלומר, וריאציה על-סף יחיד מתח המייצגת את הפעילות החשמלית של תאי עצב אחד או יותר) ופרצי (כלומר, רצף של קוצים ארוזים מאוד לעתים קרובות occurrinז בו-זמנית במספר ערוצים). ההקלטות של פעילות רשתות עצבית עם מערכות מבוססות MEA לייצר כמות עצומה של נתונים (למשל, ניסוי 4 שעות עם MEA ערוצים 60 מייצר שיא של כ -15 GB). זה מרמז על הצורך יש כלים יעילים לעבד ולנתח את הנתונים, במיוחד במקרה של מחקרים הדורשים הקלטות ארוכות. באופן כללי, ההקלטה של אותות אלקטרו מתקבלת על ידי התמרה ישירה תאית עם התרבויות עצביות, ורכישת אות מתח. לאחר שלב הגברה וסינון, אותות נדגמים 10-50 קילוהרץ ומאוחסן. אותות הגלם אז שיא זוהה על ידי כלי תוכנה שפותח בהתאמה אישית. מערכת ההקלטה כללה (1) מגבר MEA, (2) המחשב אישי מצוידים ברכישה, (3) תוכנת הקלטה, מערכת (ד) חימום ובקר טמפרטורה, לוח A / D (4) CO2 אווירה-שמירה ואידוי-מניעה מערכות.
הבניין של הרשת העצבית 3D עובר שני שלבים קריטיים: הראשון היא חלוקת הסכום הנכון של חרוזים על צלחות multiwell עם משטח להכניס קרום, השני היא ההעברה של ההשעיה של microbeads עם נוירונים חסיד מmultiwell צלחות עם הוספת קרום ל: (i) הרשת העצבית 2D מצופות על האזור הפעיל של MEA (השכבה ראשונה); (Ii) השכבות כבר התיישבו. פעולה זו יש לחזור כמה פעמים שמספר השכבות דרושות. במהלך השבוע של התרבות הראשון, צמיחה מהירה של הרחבות דלקת עצבים מתרחשת סביב microbeads השייך בשכבות השונות. הקשר ההדוק בין תאי עצב וmicrobeads מייצב את הדגימות הביולוגיות ומאפשר להזיז אותו מהחממה לשנות / להחליף את המדיום ולהקליט עם מגבר MEA הפעילות החשמלית מבלי לדאוג לפגוע בו.
מאז פעילות אלקטרו של כל נטועבודה נרשמה רק מהשכבה התחתונה (כלומר, אחד ישירות מצמידים את MEA), האזור הפעיל חייב להיות מכוסה על ידי רשת 2D קונבנציונלית. שכבות האחרות יתווספו צעד אחר צעד על 2D אחד, וקשרים ארוך טווח יהיו מפוזרים בין השכבות. למעשה, השכבות אחרות הוסיפו 6-8 שעות מאוחר יותר מ2D אחד על ידי הדחת התערובת של תאי עצב וmicrobeads. הבחירה של חלון זמן זה מאפשרת היווצרות של כמה קשרים סינפטיים בשכבת 2D, ומבטיחה את האפשרות ליצור חיבורים לשכבות העליונות יותר מדי.
שני גורמים הופכים את השימוש של צלחות multiwell עם קרום להכניס הכרחי על מנת לממש את רשתות 3D: (i) מאז נוירונים וmicrobeads מהירויות שקיעה שונות הנוכחיות, השימוש בצלחות multiwell עם הוספת קרום מבטיח פיזור אחיד של תאי עצב בחלק העליון של microbeads : בממוצע, כל microbead עשוי להיות מוקף באותו המספר של תאי עצב. (Ii) By ניצול תכונות האלסטיות של צלחות multiwell עם הוספת קרום, לגל של הפתרון של microbeads מצמידים את הנוירונים הוא קל יותר מאשר באמצעות משטחים מוצקים כמו רב-בארות פוליקרבונט.
העבודה מוצגת להלן הגישה המוצעת על ידי Pautot ועמיתים לעבודה 15: במחקר שהשימוש בחרוזי סיליקה סיפק משטח צמיחה גדול מספיק עבור גופי תא עצביים לדבוק ולתהליכים שלהם לגדול, בוגר ולייצר התמחויות לפני ואחרי-סינפטי . אלטרנטיבה חוקית לשימוש בפיגום חרוזים מגיעה ממטריצות הידרוג או ביו-אקטיבי וחרוזים מתכלים מורכבים מbiopolymer הטבעי כמו chitosan. כיטין והנגזר שלה deacetylated, chitosan, אינם רעיל, אנטיבקטריאלי, ביולוגית וbiopolymers מתכלה. המתמיד של תהליך פירוק ביולוגי כגון הזמן תואם את הרשת להיגמל 20,21.
מחקר זה עשוי להוות wor התייחסותk לפיתוח העתידי של מערכות מודל עצבי מתקדמות 3D ללמוד את יחסי הגומלין בין דינמיקת רשת ומבנה שיטתי. בתוך זמן קצר, אנו מקווים שנוכל להעביר את מבנה רשת 3D על דור חדש של מכשירים 22. טכניקת הייצור כרוכה ייצור אלקטרודות בצורה של מיקרו-עמודים בגבהים משתנים בין 50 ל 350 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים ג'ורג'יו Carlini לתמיכה הטכנית בפיתוח מבנה הכליאה וdott. Ornella LoBrutto לתיקון היסודי של כתב היד. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתכנית מסגרת ה -7 של האיחוד האירופי (ICT-FET FP7 / 2,007-2,013, FET צעיר מגלי ערכה) תחת 284,772 BOW BRAIN הסכם מענק (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).
