Introduction
В пробирке двумерных (2D) нейронных сетей, соединенных с микро-матриц электродов (МПС) arethe золотой стандарт, принятый экспериментальную модель для изучения взаимосвязи между нейронных динамики и основной связи. Во время разработки, нейроны воссоздать сложные сети, которые хорошо просмотров definedspatio-temporalpatternsof деятельность 1,2 (т.е. всплески, сетевые всплески, случайные пики активности). МЭС записи электрофизиологических деятельность с многих сайтах (от десятков до тысяч микроэлектродов), что позволяет детально исследовать выраженных динамики на сетевом уровне. Кроме того, использование диссоциированных культурах делает возможен спроектировать инженерии-сети. Это легче понять, таким образом, функциональные отношения между записанной электрофизиологических деятельности и параметры сетевой организации как плотность клеток 3 степени модульности 4,5, наличие гетерогенной нейронов попленностей 6, и т.д. Однако, все исследования в пробирке на диссоциированных клеток, культивируемых на основе нейронных сетей 2D. Такой подход приводит к чрезмерному упрощению по отношению к (внутренне 3-мерной, 3D) системы в естественных условиях: (I) в 2D модели, somata и роста конусов уплощенных и аксонов дендриты-вырост не могут распространяться во всех направлениях 7. (II) 2D в пробирке сети экспонат стереотипные электрофизиологические динамику с преобладанием трещит деятельность, связанную большинство нейронов сети 8.
Недавно различные решения были разработаны, чтобы позволить строительство в пробирке 3D диссоциирует нейронные сети. Общая идея состоит в создании эшафот, где нейроны могут расти в 3D моде. Такой каркас может быть реализован с полимерными гелями и твердых пористых матриц 9-13. Эксплуатируя механические свойства полимеров, можно вставлять внутрь клетки Фесе структур, определяя единую блок 3D культур нейросфер 11. Главной особенностью этого подхода является жесткая механическая собственностью нейросфер 9,12. Тем не менее, эти материалы имеют ограниченный пористость, и они не гарантируют миграцию клеток внутри матрицы. Чтобы преодолеть этот недостаток, возможным решением состоит в том нарезки матрицы в 'Unit' модулей. К сожалению, размер и форма разнообразие частиц может помешать упаковка в обычных слоистых структур. В 7 Каллен и его коллеги разработали 3D нейронов конструкцию, составленную из нейронов и / или астроцитов в биологически активного внеклеточного матрикса на основе эшафот. Такое инженерии нервной ткани позволил в пробирке исследований для изучения и манипулирования нейробиологические ответы в 3D-среде микро. Эта модель состоит из нейронов и глии, распределенных по всему внеклеточного матрикса (ЕСМ) и / или гидрогеля каркасов (толщиной 500-600 мкм). В этом сотрудничествеndition, оптимальное жизнеспособность клеток (более 90%) была обнаружена путем культивирования клеток в конечной плотностью около 3750 - 5000 клеток / мм 3. Следует отметить, что такой значение плотности намного ниже, чем в том состоянии, в естественных условиях, где плотность клеток коры мозга мыши составляет около 90000 клеток / мм 3 14. Чтобы преодолеть это ограничение Pautot и сотрудники 15 реализована система 3D в пробирке, где плотность клеток и подключения к сети контролируются походить в условиях естественных условиях при одновременном обеспечении реального времени визуализации сети. Практически, этот метод основан на том, что культивируемые нейроны диссоциированной способны расти на силикагеле, микрогранул. Эти шарики обеспечивают поверхность роста, достаточно большой для нейронных клеточных тел придерживаться и их arborizations расти, зрелые, расширяющих и определяют синаптические контакты с другими нейронами. Этот метод использует спонтанные сборке свойства монодисперсных шариков для FORM 3D слоистых гексагональных матриц, содержащих различные подмножества нейронов на разных слоях с условной связи между нейронами на различных бусин. Достигнутый плотность клеток с помощью этого метода было около 75000 клеток / мм 3.
В последнее время мы адаптировали метод Pautot к МПС 16: полученные результаты показывают, что электрофизиологические деятельность 3D представляет широкий репертуар деятельности, чем та, выраженной 2D сетей. 3D зрелые культур проявляют повышенную динамику, в которой и сеть взрыв и случайные всплеска активности сосуществуют. Аналогичным образом, Тан-Шомер и соавторы 17 реализован белка шелка на основе пористого матрикса, который поддерживает первичный кортикальный культуру в пробирке в течение нескольких месяцев, и записали электрофизиологическое активности с помощью вольфрамового электрода.
В этой работе, экспериментальные процедуры для создания 3D нейронных сетей, соединенных с МПС будет описано.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальный протокол был одобрен Европейской ухода за животными законодательства (2010/63 / ЕС), итальянским Министерством здравоохранения в соответствии с DL 116/1992 и руководящими принципами университета Генуи (Prot. N. 13130, май 2011). Все усилия были сделаны, чтобы уменьшить количество животных для проекта и свести к минимуму их страдания.
1. Подготовка материалов и поддерживает
- Построить формы на постройку PDMS (Поли-диметил-Силоксан) ограничений с помощью ЧПУ (числовым программным управлением) фрезерного станка. Такое формы осуществляется из поликарбоната с центральным цилиндром политетрафторэтилена (ПТФЭ). Этот материал позволяет легче извлечение маски после того, как ПДМС затвердеет.
ПРИМЕЧАНИЕ: дизайн формы была выполнена по автоматизированного-Design (CAD), а затем доставлен в фрезерного станка с ЧПУ. - Подготовка эластомера PDMS. PDMS является органический полимер. Она состоит из двух элементов, Отвердитель и полимер. Смешайте их объемном соотношении 1:10, одна часть отвердителя и девять частей полимера. Поместите два компонента в чашке Петри, встряхнуть и вставить смесь в вакуумной камере в течение 10 мин, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. 3 г PDMS достаточно для одного ограничения.
- Построить ограничение PDMS. Вставьте материал PDMS в формовщика и поставить в духовку на 30 мин при 120 ° С. PDMS ограничение имеет форму идеального цилиндра с внешним и внутренним диаметром 22,0 и 3,0 мм соответственно и высотой 650 мкм.
- За день до посева, пара маска для активной области микро-матриц электродов (МПС) с помощью пинцета под стереомикроскопом и стерилизовать маску PDMS в духовке при 120 ° С.
- Стерилизация стеклянные микрошарики (номинальный диаметр 40 ± 2 мкм; сертифицированный средний диаметр 42,3 ± 1,1 мкм) в 70% этаноле в течение 2 ч в конической пробирке и вращать эВERy 30 мин, чтобы выставить все микрошарики.
- Удалить этанольного раствора из флакона и промыть микрошариков два раза стерилизованной водой.
- Condition центральную часть области MEA, ограниченной маской PDMS (диаметр равен 3,0 мм) с 24 мкл смешанного раствора поли-D-лизина и ламинин на 0,05 мкг / мл.
- Покрывают микрошарики адгезии протеинов, ламинин и поли-D-лизина в 0,05 мкг / мл и оставить их в течение ночи в инкубаторе при 37 ° С, чтобы получить стабильный и длительный нейронной сети.
- Удалить факторов адгезии, как с поверхности стекла СМЭ и со стекла микросфер. Аспирируйте примерно 95% раствора для нанесения покрытия с помощью пипетки и нанести небольшое Volume- 24μl- стерильной воды на поверхности МЭС. Аспирируйте раз больше, чем 95% воды, и пусть MEA сушат при ламинарном шкафу в течение 1 часа, прежде чем покрытие клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае микросфер вместо, аспирация покрытиераствора и сделать первой стирки стерилизованной водой и второй с базальной средой и ее дополнение, таких как B27, для того, чтобы обусловить стеклянной поверхности, где нейроны будут высевали. Не позволяйте микросферы сухой. Оставьте их в виде суспензии в культуральной среде внутри флакона. - Распределить, с помощью пипетки -200 μl- суспензию обработанных микрошариков (около 32000) на многоямного пластины с мембраной вставки (диаметр пор 0,4 мкм), где они будут самосборке образуя равномерный слой.
- Заполните каждую лунку мембраны с 0,5 мл среды и поместить его в инкубатор (Т = 37,0 ° С, СО 2 = 5%) до тех пор, нейроны не готовы быть покрыты (3.2).
2. Вскрытие эмбрионов и диссоциация ткани
- Дом взрослых самок крыс (200-250 г) при постоянной температуре (22 ± 1 ° С) и относительной влажности (50%) при регулярной свет-темнота расписанию (свет от 7 утра-7 вечера) вживотное объект. Убедитесь, что пища и вода в свободном доступе.
- Обезболить беременную самок крыс после 18 дней развития (E18) с использованием 3% изофлуран. Затем жертву животное смещением шейных позвонков.
- Удалить гиппокампе крыс из каждой эмбриона и поместить их в сбалансированный солевой раствор лед холодной Хэнка без Са 2+ и Mg 2+. В день 18 гиппокампа и коры развития тканей очень мягкие и не нужно разрезать на небольшие кусочки. Дальнейшие детали могут быть найдены 18,19.
- Отделить ткани в 0,125% раствора трипсин / Хенкса, содержащего 0,05% ДНКазы в течение 18-20 мин при температуре 37 ° С.
- Удалить супернатант раствор с помощью пастеровской пипетки и остановить ферментативного расщепления добавлением среды с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в течение 5 мин.
- Удалить жидкость с FBS и мыть один раз со средой с его дополнением, 1% L-глутамина, гентамицина 10 мкг / мл. Удалить снова среду с пип ПастераEtte и пополнить его снова с небольшим количеством (500 мкл) среды роста с его дополнением, 1% L-глутамина, гентамицина 10 мкг / мл.
- Отделить ткани осадок механически с узким пипетки Пастера до молочно суспензию клеток не видно. Нет необходимости, чтобы центрифуги клеточной суспензии.
- Развести небольшой объем клеточной суспензии с ростовой средой, чтобы получить конечный объем 2,0 мл. Подсчитайте, полученный клеточный концентрации с гемоцитометре камеры. Развести эту концентрацию в соотношении 1: 5, чтобы получить желаемую концентрацию в клетке 600-700 клеток / мкл.
3. Покрытие сотовый
- Пластина клеток при плотности около 2000 клеток / мм 2 на активной области МЭС, определенные ограничения PDMS, чтобы создать 2D нейронной сети.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый гиппокамп содержит около 5 х 10 5 клеток, (1 х 10 6 на одном эмбриона). Проанализируйте 6 эмбрионов, чтобы получить общее количество 6 х 106 клеток в 2 мл, а по оценкам концентрация 3000 клеток / мкл. Развести эту концентрацию в соотношении 1: 5, чтобы получить нужную концентрацию клеток и пластины 600-700 клеток / мкл. Если площадь МЭА ограничена ограничения PDMS около 7,065 мм 2, а общее количество посеянных клеток 600 клеток / мкл 24 мкл х = 14400 клеток, конечная плотность 2038 клеток / мм 2. - Поместите МЭС устройств в инкубаторе с увлажненным СО 2 атмосферы (5%) при 37 ° С.
- Распределить 160 мкл суспензии с концентрацией клеток 600-700 клеток / мкл (около 100000 клеток) на поверхности монослоя микрошарики, расположенного внутри луночные планшеты для завершения предварительную стадию для построения трехмерной культуре. Поместите луночные планшеты в инкубаторе с увлажненным СО 2 атмосферы (5%) при 37 ° С.
4. 3D нейронной сети Строительство
- 6-8 ч после посева, передавать суспензии (микрошарики с нейронами) от луночные планшеты тщательно внутри области, ограниченной ограничения PDMS с помощью пипетки набор для объема примерно 30-40 мкл. После каждой передачи, подождите примерно полминуты, чтобы позволить микрогранулы, чтобы самостоятельно собрать в гексагональной компактной конструкции.
- После того как все слои нанесены и спонтанно собран, пополнить с большим падением около 300 мкл среды в верхней части области, ограниченной ограничения PDMS.
- Поместите структуру 3D, соединенный с МЭА в инкубаторе (T = 37,0 ° С, CO 2 = 5%) в течение 48 ч перед добавлением конечного объема (около 1 мл) среды роста культуры с дополнением.
Примечание: Рассмотрим общее количество бусин на луночные планшеты с мембранной вставки (30000) и количество шариков на одном слое на MEA устройства (6000). В результате 3D структура состоит из 5 слоев миcrobeads и клетки. Принимая во внимание, что 3D нейронной сети не геометрически совершенным, в результате 3D структура может состоять из 5-8 слоев. - На следующий день после посева, осторожно добавить Конечный объем среды (около 900 мкл) внутри кольца MEA. Поддержание 3D-культур в увлажненной атмосфере СО 2 (5%) при 37 ° С в течение 4-5 недель. Заменить половина среды один раз в неделю.
5. Приобретение конфокальной микроскопии
- Закрепите биологических образцов в стадии микроскопа в держатель. Установите лазер (аргон, 496-555 нм), скорость проверки (400 Гц), при которой на приобретение образ, усиления и смещения (-0.3%) ФЭУ для каждого изображения, чтобы захватить правильный фильтр излучения полосы пропускания и для того, чтобы избежать насыщения и увеличить отношение сигнал-шум. Секция Результаты сообщает значения, используемые для приобретения изображения рисунке 4.
- Для приобретения г -stack последовательности, пихтыул выбрать, значение г положении верхней и нижней слое образца, а затем выберите размер шага, чтобы сделать приобретение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. В этой экспериментальной процедуры, соответствующую роль играет микрошариков, которые определяют механическую каркас для роста нейронной сети 3D фиг.1А и B Дисплей расположение микрошариков (номинальный диаметр 40 ± 2 мкм; сертифицирована средний диаметр 42.3 ± 1.1 мкм) в плоскости. Особенностью таких структур является то, что микросферы самопроизвольно самосборке определении компактную гексагональную геометрию (Фигура 1В и С). Так генерируется каркас гарантирует последовательное поверхности роста нейритов и для достаточно большом интерстициальное пространство для метаболического обмена клеточных тел. Это измерение Microbead оказывается разумным компромиссом для интерстициального расстояния и окончательного нейронов плотности. Учитывая, что структура PDMS воссоздает "идеального" цилиндр, а с компактной гексагональной фактора воздействия структура (HPF) равна 0,74, максимальное количество бусин (диаметр 4081; м) содержится в ограничении PDMS около 100000, что соответствует примерно 6000 микрошариков в каждом слое. Как объяснено в разделе протокола, эти микросферы предварительно кондиционируют адгезии факторов (например, ламинин и поли-D-лизин). Эта процедура гарантирует, что нейроны придерживаться микрошариков. Рис 1D показан пример, где три нейроны, соединенный с Microbead с диаметром 40 мкм.
Рисунок 1. Изображения микросфер, используемых для создания эшафот для нейронной сети. (А, В) Два примера монослоев микрогранул на поверхности многоямного пластины с мембраной вставки. (C) Microbeads разрешению в соответствии гравитационной силы и спонтанно собираются в 2D гексагональных решеток. После того, как первый слой полностью упакованы, другие гранулы добавляют построитьIng второй упорядоченный слой, имеющий ту же гексагональную симметрию. Дальнейшее добавление микросфер привело к строительству упакованном 3D сборки. Свободное пространство между микрогранул заполнено нейрональных процессов и клеточных тел. (D) Три нейроны закреплены на поверхности одного Microbead, ранее обусловлено адгезии факторов (ламинин и поли-D-лизин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенная версия этой фигуры.
Взаимостыковки микрошариков и нейронов с активной площади МЭА обусловлено эластомерного ограничения (фиг.2с), реализованной с формой, изображенной на фиг.2А и Б. 2А показывает расположение и размеры выбранные. Активная зона МЭС ограничена путем сочетания структуры PDMS из рис 2С с MEA подложки (рис 2D). Таким образом, нейроны вынуждены придерживаться активного площади электрода МЭС. Впоследствии стекла микросферические складывается с адгезивными нейронов будут размещены на этом первом слое. Рис 2D показывает поперечное сечение конечной конфигурации, где роль структуры PDMS может быть четко оценены. Пространство ограничена структуры PDMS содержит смесь микрогранул и нейронов (белый порошок в нижней части рисунка 2D). Структура PDMS имеет форму цилиндра, построенного с формой, показанной на рисунке 2B со следующими размерами: внешний и внутренний диаметр 22,0 мм и 3,0 соответственно и высотой 650 мкм. Форма была построена с использованием поликарбоната и ПТФЭ, которые делают идеальным гладкой и стойкий материал, чтобы облегчить извлечение эластомерного mask.The PDMS ограничения отображения меньший срок службы, так как липкие свойства уменьшением PDMS после каждого использования. Типично , Каждая структура PDMS могут быть успешно использованы три раза.
Рисунок 2. Материалы для строительства нейронной сети 3D. (А) Конструкция и (Б) изображение пресс-формы, используемой для создания физических ограничений. Серое 3 мм Диаметр цилиндра соответствует отверстие ограничения, изображенной на (с). (С) ПДМС ограничения, размещенной на активной площади массива микро-электрод (MEA). Использование такого физического барьера позволяет содержать микрогранулы в пределах целевой зоны (около 7 мм 2) и ограничивают развитие 3D сети. (D) Поперечное сечение системы MEA и ограничения. Microbeads (изображенные микроскопом в верхнем правом углу) заполнены в пространстве, ограниченном ограничения PDMS (нижняя панель).080fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
После удержания активной области МЭС посредством маски PDMS, протокол продолжается, как показано на панелях фиг.3, описывающие основные этапы реализовать сборку нейронов и микрогранул.
Первый этап предварительной состоит в покрытие диссоциируют нейроны на поверхности МЭС, который был ранее предварительно покрытой адгезионных молекул ламинин и поли-D-лизина (3А). Важно, что 2D нейронной сети придерживается прямо на активной области МЭС: только в этих условиях, запись электрофизиологических сигналов (например, шипы и всплесков) является возможным. Эта первая часть протокола соответствует стандартной процедуре, используемой на пластине 2D нейронов. Фактическое построение системы 3D показана на фиг.3В, С, D и (рис 3B); После этого 160 мкл подвеска с клеточной концентрации 600-700 клеток / мкл (около 100000 клеток) распределяется на микрогранулы монослоя (рис 3C). Учитывая, что клетки могут занимать половину области борта, общее свободной поверхности 75 мм 2. Плотность клеток на монослой микрошарики около 1500 клеток / мм 2. Используемый луночные планшеты с мембранной вставки представляют пористую мембрану с поверхностью 33,6 мм 2. Рассматривая виртуальную цилиндрическую форму с площадью основания, равной пористой поверхности мембраны и высотой 40 мкм (диаметр шарика), равномерным слоем, состоящий из 30000 микрогранул соединен с луночные планшеты с мембранной вставкой. Так понял, приостановление микросфер и нейронов остается около 6-8 часов внутри луночные планшеты с мембранной вставки. однаждывышеупомянутые шаги будут завершены, строительство 3D сети может начать. В это время, смесь нейронов и микрогранул удаляется из луночные планшеты с мембранной вставкой и размещены на нейронной сети 2D ранее высевали на области, определенной в PDMS ограничения (рис 3D). Во время этой процедуры, потеря около 20-30% нейронов происходит вследствие (I) механических манипуляций и (II) с передачей внешнего мембраны. Рассматривая базовую область ограничения (7,06 мм 2) и высотой 178.56 мкм (5 слоев гранул), и деления количества клеток по объему идеального цилиндра, образованного 5 слоев бус, в результате 3D нейронов плотность сотовых составляет около 80000 клеток / мм 3.
Рисунок 3. Эскиз из основных шагов для создания 2D и 3D нейронные сети. (А) Покрытие ОF нейроны на активной области в МЭА. Приостановление нейронов высевают на поверхность MEA, ранее с кондиционером, факторов адгезии и разделяются ограничения PDMS. Этот шаг позволяет реализовать: я) классический 2D нейронной сети в сочетании с МЭА; II) первый слой 3D-сети, из которой электрофизиологическое активности будет записан. (B) Microbeads и (с) нейроны доставляются поверхности луночные планшеты с мембранной вставки через 6-8 ч. (D) суспензии нейронов и микрогранул перемещается из луночные планшеты с мембранной вставкой в сеть 2D. Повторение этого шага несколько раз позволяет определить плотную многослойную 3D структуру. (Е) Когда структура 3D завершена, капли среду добавляют, и полученный в результате структура хранится в инкубаторе в течение 48 ч. (F ) После 48 часов, 3D культуры полностью пополнен с конечного объема среды.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
После того, как первый слой был расположен, та же самая операция повторяется для получения упакованный 3D ансамбль. В результате 3D структура реорганизуется сама определения коллоидной кристалл, который самособирается в компактную структуру, составленную около 5-8 слоев микросфер и нейронов (рисунок 4). После того как все слои образованы, 3D сеть должна быть пополнен с каплей 300 мкл среды (рис 3e). На этом этапе, 3D сети, соединенные с МПС могут быть сохранены в инкубаторе в течение 48 ч. После этого 1 мл среды добавляют, чтобы заполнить кольцо МЭС (рис 3F).
После того как все слои были собраны, невриты расти в течение микрогранулами помост принятия окончательного плотности клеток около 80000 клеток / мм 3. Стоит NOTICING, что полученное значение не далеко от 92000 клеток / мм 3, средняя нейронов плотности в коре головного мозга мыши 14.
Рисунок 4 отображает три примера 3D сетей, соединенных с МПС, захваченных с помощью конфокальной микроскопии в вертикальном положении. На фиг.4А, ОПК (дифференциального интерференционного контраста) изображение показывает один слой бусин, соединенных с поверхностью MEA; микроскоп в сочетании с 20,0 Н.А. 0,50 Вода цели и изображения были получены с Передано ФЭУ включены в микроскоп и аргоновый лазер (488 нм). Фотографии показывают очень четко пространственное расположение электродов (черные точки) и регулярную пространственную организацию микросфер.
На рисунке 4В, в иммунофлюоресценции окрашивания для карт-2 (красный сигнал) отображает распределение дендритных arborizations и somata нейронов вокруг микросфер непосредственно связанных с электрода плоскости MEА (наличие черных контактов можно наблюдать). 4В максимум проекция z-последовательности стека (108 мкм) с размером шага равен 1,53 мкм. Изображения были получены с 40,0 Н.А. 0,80 воды задачи; возбуждение Аргон лазер (488 нм), ширина полосы излучения 496nm-655nm.
Наконец, на рис 4C показывает максимальную проекцию г -stack последовательности (187,79 мкм) 3D-гиппокампа культуры (размер шага 2,27 мкм). Г -stack последовательность была приобретена с 25,0 Н.А. 0,95 Вода цели. Для зеленого канала, были использованы лазер 488nm Аргон и выбросов полоса пропускания фильтра 499nm-551nm. Для красного канала, были использованы нм лазер 543 и выброс полоса пропускания фильтра 555nm-645nm. Каналы были приобретены в режиме последовательности. Очень взаимосвязаны сеть, где нейроны возникает помечены для NeuN выражается в зрелых постмитотических нейронов (красный сигнал) и ГАМК (зеленый сигнал, елнизкий в слиянии). Габа антитела показали положительность для тормозных нейронов как в somata и невриты.
Рисунок 4. Три примера 3D сетей, захваченных конфокальной микроскопии. (А) ДВС (дифференциального интерференционного контраста) изображение, показывающее один слой бусин, соединенных с поверхностью MEA; пространственное расположение электродов (черные точки) наблюдается. (Б) Иммунофлуоресценции окрашивание карте-2 (красный сигнал) отображает распределение дендритных arborizations и somata нейронов вокруг микросфер непосредственно связанных с электрода плоскости МЭА. ( С) Максимальное проекция г -stack последовательности (187,79 мкм) 3D-культуры, где отображаются весьма взаимосвязанной сети, где нейроны помечены для NeuN выражается в зрелых постмитотических нейронов (красный сигнал) и ГАМК (зеленый сигнал, желтый в слиянии ). Габа антитела оборотовealed положительности для тормозных нейронов как в somata и невриты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Чтобы понять, модулирует ли наличие 3D структуры динамику сети, так генерируется электрофизиологические активность по сравнению с обычными 2D нейронных сетей, выращенных по МПС, которые представляют базовую модель.
Рисунок 5. Сравнение между сетевыми динамики проявляемых 3D (левый столбец) и 2D (правая колонка) гиппокампа культур На каждом временном масштабе (A: 1,200 сек, В: 300 сек; C: 60 сек; D: 10 сек)., 3D сборки отображать различные подписей деятельности (т.е., короткие и длинные сетевые всплески, случайный пикидеятельность, синхронизированные вспышки), в то время как те, 2D отображения более выраженным стереотипный деятельность с только высокое синхронизированных импульсов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 показывает два растровых графики двух представительных экспериментов, выполненных на 3D (левые панели) и 2D (правая панели) гиппокампа культуры в течение четвертой недели в пробирке. Эти графики показывают электрическую активность в сети, записанных на всех активных электродов (т.е.., Электроды с скорострельность более 0,1 шипы / с).
Динамика 2D сетей отображать квази-синхронная деятельность состоит в основном из сетей очередей. Подпись этой динамики является наличие синхронизированных событий, которые включают большинство каналов записи чередуются с периода, в котором почти нет действия записываются (см правой панелиРисунок 5D). Такое поведение может быть оценено в различных временных масштабах, как различные уровни увеличения подчеркиванием.
В случае 3D-сети, подпись сети динамики состоит из широкой репертуара деятельности характеризуется: (I) меньше глобальной синхронно, (II) более случайным пики активности, (III) периодов, в которых подсети (т.е. подмножество микроэлектродов) представить более синхронный деятельности с возникновением сети очередей. Кроме того, продолжительность сетевых всплесков более переменных, а также: есть присутствие сети всплесков с длительностью, аналогичной той, которая наблюдается в 2D сетей, но есть также более длинные сетевые всплески. Полный и количественной характеристики возникающих 3D динамики полученных с помощью такого метода можно найти в 16. Как и ожидалось, 3D-нейронной сети показывает также значительное "случайных всплески» и несинхронное разрывной аctivity. Реалистичность динамики порожденных этими 3D структур были оборудована устройством с некоторыми контрольно-экспериментов (например, наличие 2D сети, соединенной с МЭА с кипой голыми микросфер и 3D сетей, собранных на микрошариков с голой МЭА), а сообщили в 16 лет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе, роман экспериментальный платформы пробирке из 3D инженерии нейронные культур в сочетании с МПС для сетевого электрофизиологии были представлены. Применение микросфер, как строительные леса, чтобы позволить нейритных нарост вдоль оси х г была специально для интеграции с плоской МЭА. Таким образом, полученные результаты микро-системы в достоверной и надежной в пробирке 3D модели для изучения возникающих электрофизиологические динамику 16.
МЭС записи настройка
Устройства MEA состоят из культуральной камеры со встроенным массивом подложки с внедренными микро-электродов, способных измерения внеклеточные сигналы от электроактивных тканей. Типичные записанные сигналы состоят из шипов (т.е. изменение одного сверх-пороговое напряжение, представляющее электрическую активность одного или нескольких нейронов) и всплески (т.е. последовательность высоко упакованных шипы часто occurrinг одновременно на нескольких каналах). Запись деятельности нейронов сети с системами МПС на основе произвести огромное количество данных (например, 4 ч эксперимент с 60 каналов МЭА производит запись о 15 ГБ). Это подразумевает необходимость иметь эффективные инструменты для обработки и анализа данных, особенно в случае исследований, которые требуют длинных записей. В общем, запись электрофизиологических сигналов получается путем прямого внеклеточной трансдукции с нейронным культур, и приобретение сигнал напряжения. После каскада усиления и фильтрации, сигналы оцифровываются 10-50 кГц и хранятся. Исходные сигналы затем пик детектируется специально разработанных инструмента программного обеспечения. Система записи состоял из (1) усилителя MEA, (2) персональный компьютер, оборудованный с / D приобретения борту, (3) программа записи, (г) системы отопления и регулятора температуры (4) СО2 атмосферы и поддержании и испарение предотвращающее системы.
Здание нейронной сети 3D проходит через две критические шаги: первый является распределение правильное количество шариков на луночные планшеты с поверхности мембраны вставки, второй является передача о приостановлении микросфер с прилипших нейронов из Multiwell пластины с мембраной вставки на: (I) 2D нейронной сети высевали на активной области МЭС (первый слой); (II) в уже обосновались слои. Эта операция должна быть повторена столько раз, сколько количества требуемых слоев. В течение первой недели культуры, быстрый рост нейритных расширений происходит вокруг микрошариков, принадлежащих в различных слоях. Тесная связь между нейронами и микросфер стабилизирует биологические образцы и позволяют перемещать его из инкубатора, чтобы изменить / заменить носитель и записать с усилителем MEA электрическую активность, не беспокоясь о его повреждения.
С электрофизиологической активности всей сетиРабота записаны только с нижним слоем (т.е., напрямую соединен с MEA), активная область должна быть покрыта обычной 2D сети. Другие слои будут добавлены шаг за шагом в течение одного 2D и соединения дальнего будет распространяться среди слоев. Практически, другие слои добавляются 6-8 ч позже, чем 2D одной, свергнув смесь нейронов и микрогранул. Выбор этого временного окна позволяет для формирования нескольких синаптических связей в 2D слоя, и гарантирует возможность установления соединений в верхние слои тоже.
Два фактора делает использование луночные планшеты с мембраной вставки необходимо реализовать 3D сети: (I) с момента нейронов и микрогранулы, присутствующих различными скоростями седиментации, использование луночные планшеты с мембранной вставкой гарантирует равномерное распределение нейронов в верхней части микрошариков : в среднем, каждый Microbead может быть окружен таким же количеством нейронов. (II) Bу эксплуатируя упругие свойства луночные планшеты с мембранной вставки обратной промывки раствора микрогранул, соединенных нейронов проще, чем твердых поверхностей, например, из поликарбоната нескольких скважин.
Представленная работа следующим подход, предложенный Pautot и коллег 15: в этом исследовании использование диоксида кремния бисером предоставил поверхность роста, достаточно большой для нейронных клеточных тел и придерживаться их для процессов роста, зрелые и производить до и после специализации синаптические , Реальной альтернативой использованию бисером помост приходит из гидрогелей матриц или биоактивными и биоразлагаемых бусы из натурального биополимера хитозана, как. Хитин и его производным деацетилированный, хитозан, нетоксичны, антибактериальное, биологически совместимый и биологически биополимеры. Постоянная времени такого процесса биодеградации совместим с сетью перерастают 20,21.
Это исследование может представлять собой справочный пристак, для дальнейшего развития передовых 3D нейронов модельных систем для изучения систематически взаимодействие между динамики и структуры сети. В скором времени, мы надеемся, что сможем перенести 3D сетевой конструкции на новое поколение устройств 22. Техника изготовления включает в себя производство электродов в виде микро-колонн в переменной высоты от 50 до 350 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы благодарят Giorgio Carlini за техническую поддержку в разработке структуры удержания и Dott. Орнелла LoBrutto для тщательного пересмотра рукописи. Исследование приводит к этим результатам получил финансирование от 7-й Рамочной Программы Европейского Союза (ИКТ-FET FP7 / 2007-2013, FET Молодой Исследователи схема) по договору гранта 284772 МОЗГА ЛУК (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).
