Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों के लिए 3 डी इंजीनियर Neuronal संस्कृति Interfacing: एक अभिनव Published: October 18, 2015 doi: 10.3791/53080
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 1
1Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering (DIBRIS), University of Genova, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Department of Cognitive Neuroscience, Radboud University Medical Center, 3Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia (IIT)

Introduction

माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों (meas) के लिए मिलकर इन विट्रो दो आयामी (2 डी) तंत्रिका नेटवर्क में न्यूरोनल गतिशीलता और अंतर्निहित कनेक्टिविटी के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए अपनाया सोने का मानक प्रयोगात्मक मॉडल arethe। विकास के दौरान, न्यूरॉन्स अच्छी तरह से प्रदर्शित जो जटिल नेटवर्क बहलाना definedspatio-temporalpatternsof गतिविधि 1,2 (यानी, फटने, नेटवर्क फटने, यादृच्छिक spiking गतिविधि)। Meas नेटवर्क के स्तर पर व्यक्त की गतिशीलता की एक विस्तृत जांच की अनुमति देता है, कई साइटों से (दसियों से microelectrodes के हजारों लोगों के लिए) electrophysiological गतिविधि रिकॉर्ड। इसके अलावा, अलग संस्कृतियों के उपयोग के इंजीनियर-नेटवर्क डिजाइन करने के लिए संभव हो बनाता है। यह इस तरह से समझने में आसान है दर्ज की electrophysiological गतिविधि के बीच कार्यात्मक संबंध और सेल घनत्व 3, प्रतिरूपकता 4,5 की डिग्री, विषम न्यूरोनल पॉप की उपस्थिति की तरह नेटवर्क संगठन के मापदंडोंआदि ulations 6, हालांकि, अलग संवर्धित कोशिकाओं पर सभी इन विट्रो अध्ययन में 2 डी neuronal नेटवर्क पर आधारित हैं। सभी दिशाओं 7 में नहीं फैला सकते हैं चपटा कर रहे हैं एक 2 डी मॉडल, somata और विकास शंकु में (i) और एक्सोन-डेन्ड्राइट परिणाम: इस दृष्टिकोण में विवो (आंतरिक रूप से 3 आयामी, 3 डी) प्रणाली के संबंध में oversimplifications की ओर जाता है। (Ii) 2 डी में इन विट्रो नेटवर्क प्रदर्शनी नेटवर्क 8 के न्यूरॉन्स के सबसे शामिल गतिविधि फोड़ का प्रभुत्व electrophysiological गतिशीलता टकसाली।

हाल ही में, अलग अलग समाधान 3 डी neuronal नेटवर्क अलग इन विट्रो के निर्माण की अनुमति के लिए विकसित किया गया है। आम विचार न्यूरॉन्स एक 3 डी फैशन में विकसित कर सकते हैं, जहां एक चबूतरा बनाने में होते हैं। इस तरह की एक पाड़ बहुलक जैल और ठोस झरझरा मेट्रिसेस 9-13 साथ महसूस किया जा सकता है। पॉलिमर के यांत्रिक गुणों का शोषण करके, यह एचटीएमएल अंदर कोशिकाओं एम्बेड करने के लिए संभव हैneurospheres 11 का 3 डी संस्कृतियों का एक समान ब्लॉक परिभाषित द्वारा ई संरचनाओं। इस दृष्टिकोण की मुख्य विशेषता neurospheres 9,12 के कठोर यांत्रिक संपत्ति है। हालांकि, इन सामग्रियों सरंध्रता सीमित है, और वे मैट्रिक्स के अंदर सेल प्रवास की गारंटी नहीं है। इस खामी को दूर करने के लिए, एक संभावित हल 'इकाई' मॉड्यूल में मैट्रिक्स टुकड़ा करने की क्रिया में होते हैं। दुर्भाग्य से, कणों के आकार और आकार विविधता नियमित बहुस्तरीय ढांचे में पैकिंग में बाधा सकता है। 7 में, कलन और सहकर्मियों एक बायोएक्टिव बाह्य मैट्रिक्स आधारित पाड़ के भीतर न्यूरॉन्स और / या astrocytes से बना एक 3 डी न्यूरोनल निर्माण बनाया गया है। इस तरह के एक इंजीनियर तंत्रिका ऊतक 3 डी सूक्ष्म वातावरण के भीतर neurobiological प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने और हेरफेर करने के लिए इन विट्रो जांच में अनुमति दी। यह मॉडल बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) और / या हाइड्रोजेल मचानों (500-600 माइक्रोन मोटी) भर में वितरित न्यूरॉन्स और glia शामिल थे। इस सह में/ मिमी 3 5,000 कोशिकाओं - ndition, एक इष्टतम सेल व्यवहार्यता (90% से अधिक) के बारे में 3,750 के अंतिम घनत्व पर चढ़ाना कोशिकाओं द्वारा पाया गया था। यह एक ऐसी घनत्व मूल्य माउस मस्तिष्क प्रांतस्था के सेल घनत्व के बारे में 90,000 कोशिकाओं / मिमी 3 14 है, जहां इन विवो हालत में से एक है, की तुलना में कहीं कम है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इस सीमा Pautot पर काबू पाने और 15 सेल घनत्व और नेटवर्क कनेक्टिविटी नेटवर्क के वास्तविक समय इमेजिंग सक्षम करते हुए विवो परिस्थितियों में सदृश नियंत्रित कर रहे हैं, जहां एक 3 डी में इन विट्रो प्रणाली का एहसास सहकर्मियों के लिए। व्यावहारिक रूप से, इस विधि सभ्य न्यूरॉन्स सिलिका microbeads पर विकसित करने के लिए सक्षम हैं अलग है कि अवधारणा पर आधारित है। ये मोती पालन करने के लिए neuronal सेल निकायों के लिए और, परिपक्व, बढ़ने का विस्तार, और अन्य न्यूरॉन्स के लिए synaptic संपर्कों को परिभाषित करने के लिए उनके arborizations के लिए एक बहुत बड़ी वृद्धि की सतह प्रदान करते हैं। इस विधि के लिए करने के लिए मोनो छितरी मोतियों की सहज विधानसभा गुणों का लाभ उठातेआर एम 3 डी विभिन्न मनकों पर न्यूरॉन्स के बीच विवश कनेक्टिविटी के साथ अलग अलग परतों पर न्यूरॉन्स की अलग कैंपेन्स युक्त हेक्सागोनल सरणियों स्तरित। इस विधि के साथ हासिल की सेल घनत्व / मिमी 3 के बारे में 75,000 कोशिकाओं था।

हाल ही में, हम Meas से 16 Pautot की विधि ढाल लिया है: प्राप्त परिणामों 3 डी electrophysiological गतिविधि 2 डी नेटवर्क के द्वारा व्यक्त की तुलना में एक की गतिविधियों की एक व्यापक प्रदर्शनों की सूची प्रस्तुत करता है दिखाते हैं। 3 डी परिपक्व संस्कृतियों एक बढ़ाया गतिशील दिखा रहे हैं जिसमें नेटवर्क फट और यादृच्छिक कील गतिविधि समय में होना दोनों। इसी तरह, तांग Schomer और सहकर्मियों 17 कुछ महीनों के लिए इन विट्रो में एक प्राथमिक cortical संस्कृति को बनाए रखता है जो एक रेशम प्रोटीन आधारित झरझरा पाड़ एहसास है, और एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड के माध्यम से electrophysiological गतिविधि दर्ज की गई।

इस काम में, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं Meas करने के लिए मिलकर 3 डी न्यूरोनल नेटवर्क बनाने के लिए वर्णित किया जाएगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल डीएल 116/1992 के अनुसार और जेनोवा (प्रॉट विश्वविद्यालय के दिशा-निर्देशों के द्वारा स्वास्थ्य के इतालवी मंत्रालय द्वारा यूरोपीय पशु देखभाल कानून (2010/63 / ईयू) द्वारा अनुमोदित किया गया था। एन 13,130 मई 2011)। सभी प्रयासों को परियोजना के लिए पशुओं की संख्या कम करने के लिए और उनकी पीड़ा को कम करने के लिए किए गए थे।

सामग्री और समर्थन करता है 1. तैयारी

  1. एक सीएनसी (कंप्यूटर न्यूमेरिकल नियंत्रण) मिलिंग मशीन के माध्यम से PDMS (पाली-डाइमिथाइल-siloxane) बाधा का निर्माण करने के लिए मोल्ड निर्माण। इस तरह की एक मोल्ड polytetrafluoroethylene में केंद्रीय सिलेंडर (PTFE) के साथ पॉली कार्बोनेट में महसूस किया है। PDMS कठोर है एक बार इस सामग्री का मुखौटा का एक आसान निकासी की अनुमति देता है।
    नोट: मोल्ड के डिजाइन कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) द्वारा किया जाता है और फिर सीएनसी मिलिंग मशीन के लिए दिया गया है।
  2. PDMS इलास्टोमेर तैयार करें। PDMS एक कार्बनिक बहुलक है। यह दो तत्वों से बना हैएक इलाज एजेंट और एक बहुलक। 1:10 के अनुपात मात्रा द्वारा उन्हें मिक्स, इलाज एजेंट में से एक हिस्सा है और बहुलक के नौ भागों। एक पेट्री डिश में दो घटकों रखो हिला और हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए 10 मिनट के लिए निर्वात चैम्बर में मिश्रण डालें। PDMS की 3 जी एक बाधा के लिए पर्याप्त हैं।
  3. PDMS बाधा का निर्माण। टुकड़े टुकड़े हो जाना में PDMS सामग्री डालें और 120 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ओवन में डाल दिया। PDMS बाधा क्रमश: 22.0 और 3.0 मिमी, के एक बाहरी और आंतरिक व्यास और 650 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ एक आदर्श सिलेंडर के आकार की है।
  4. चढ़ाना पहले दिन, युगल एक stereomicroscope के तहत एक चिमटी से नोचना के माध्यम से माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों (meas) के क्षेत्र में सक्रिय करने के लिए मुखौटा और 120 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में PDMS मुखौटा बाँझ।
  5. एक शंक्वाकार शीशी में 2 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में और ईवी बारी बारी से; (42.3 ± 1.1 माइक्रोन से प्रमाणित मतलब व्यास 40 ± 2 माइक्रोन की नाममात्र व्यास) कांच microbeads जीवाणुरहितery 30 मिनट के सभी microbeads बेनकाब करने के लिए।
  6. शीशी से इथेनॉल समाधान निकालें और microbeads निष्फल पानी के साथ दो बार कुल्ला।
  7. 0.05 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में पाली-डी-लाइसिन और laminin की मिश्रित समाधान के 24 μl के साथ (व्यास 3.0 मिमी के बराबर होती है) PDMS मुखौटा द्वारा सीमांकित विदेश मंत्रालय के क्षेत्र के मध्य भाग हालत।
  8. कोट 0.05 माइक्रोग्राम / पर आसंजन प्रोटीन, laminin और पाली-डी-लाइसिन साथ microbeads मिलीलीटर और एक स्थिर और लंबे समय तक चलने न्यूरोनल नेटवर्क प्राप्त करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर उन्हें छोड़ दें।
  9. विदेश मंत्रालय की कांच की सतह से और कांच microbeads से दोनों आसंजन कारकों निकालें। महाप्राण एक विंदुक के साथ कोटिंग समाधान के लगभग 95% और विदेश मंत्रालय की सतह पर बाँझ पानी की एक छोटी volume- 24μl- लागू होते हैं। महाप्राण फिर से 95 से अधिक पानी का% और चढ़ाना कोशिकाओं से पहले 1 घंटे के लिए लामिना हुड के तहत विदेश मंत्रालय सूखा।
    नोट: बजाय microbeads के मामले में, कोटिंग महाप्राणसमाधान और न्यूरॉन्स चढ़ाया जाएगा, जहां कांच की सतह हालत के क्रम में, निष्फल पानी और बेसल मध्यम और ऐसे B27 के रूप में अपनी पूरक के साथ एक दूसरे से एक के साथ एक पहली धोने करें। Microbeads सूखी मत देना। शीशी के अंदर संस्कृति के माध्यम में निलंबन में उन्हें छोड़ दें।
  10. वे एक समान परत के गठन स्वयं को इकट्ठा करेंगे, जहां झिल्ली डालने (ताकना व्यास 0.4 माइक्रोन) के साथ एक multiwell थाली पर एक पिपेट -200 μl-, इलाज microbeads के निलंबन के बारे में (32,000) के माध्यम से, बांटो।
  11. मध्यम के 0.5 मिलीलीटर के साथ झिल्ली के प्रत्येक अच्छी तरह भरें और इनक्यूबेटर में डाल (टी = 37.0 ओ सी, सीओ 2 = 5%) न्यूरॉन्स (3.2) चढ़ाया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक।

2. भ्रूण के विच्छेदन और ऊतकों की हदबंदी

  1. एक नियमित रूप से प्रकाश अंधेरे अनुसूची के तहत एक निरंतर तापमान (22 ± 1 डिग्री सेल्सियस) और सापेक्ष आर्द्रता (50%) में सभा वयस्क मादा चूहों (200-250 ग्राम) (प्रकाश पर 7:00-19:00) मेंजानवरों की सुविधा। कि भोजन सुनिश्चित करने और पानी आसानी से उपलब्ध हैं।
  2. 3% isoflurane का उपयोग विकास के 18 दिन (E18) के बाद एक गर्भवती महिला चूहे anesthetize। फिर, ग्रीवा अव्यवस्था से पशु बलि।
  3. प्रत्येक चूहे के भ्रूण से hippocampi निकालें और सीए 2 मिलीग्राम और बिना बर्फ के ठंडे हांक संतुलित नमक के घोल 2+ में उन्हें जगह है। दिन में विकास हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था ऊतकों के 18 बहुत नरम हैं और छोटे टुकड़ों में कटौती किए जाने की जरूरत नहीं है। आगे की जानकारी 18,19 पाया जा सकता है।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 18-20 मिनट के लिए DNase का 0.05% से युक्त trypsin / हांक समाधान की 0.125% में ऊतक अलग कर देना।
  5. पाश्चर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ मध्यम जोड़कर enzymatic पाचन बंद करो।
  6. FBS के साथ मध्यम निकालें और इसके पूरक, 1% एल glutamine, जेंटामाइसिन 10 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ मध्यम के साथ एक बार धो लें। एक पाश्चर रंज के साथ फिर से मध्यम निकालेंकैसेट अपने पूरक, 1% एल glutamine, जेंटामाइसिन 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ मध्यम विकास की एक छोटी राशि (500 μl) के साथ फिर से इसे फिर से भरना और।
  7. कोशिकाओं की एक दूधिया निलंबन स्पष्ट है जब तक एक संकीर्ण पाश्चर विंदुक के साथ यंत्रवत् ऊतक गोली अलग कर देना। यह सेल निलंबन अपकेंद्रित्र के लिए आवश्यक नहीं है।
  8. 2.0 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए मध्यम विकास के साथ सेल निलंबन की छोटी मात्रा पतला। एक hemocytometer चैम्बर के साथ प्राप्त सेलुलर एकाग्रता की गणना करें। / Μl 600-700 कोशिकाओं के वांछित सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 5: 1 पर इस एकाग्रता पतला।

3. सेल चढ़ाना

  1. PDMS बाधा से परिभाषित विदेश मंत्रालय के सक्रिय क्षेत्र पर के बारे में 2000 कोशिकाओं / 2 मिमी के घनत्व पर प्लेट कोशिकाओं, एक 2 डी न्यूरोनल नेटवर्क बनाने के लिए।
    नोट: प्रत्येक हिप्पोकैम्पस के बारे में 5 x 10 5 कोशिकाओं में शामिल है, (एक भ्रूण के लिए 1 एक्स 10 6)। 6 एक्स 10 के कुल राशि प्राप्त करने के लिए 6 भ्रूण काटना6 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं, और / μl 3,000 कोशिकाओं के एक अनुमान के अनुसार एकाग्रता। वांछित सेल एकाग्रता प्राप्त और के बारे में 600-700 कोशिकाओं / μl थाली करने के क्रम में 5: 1 पर इस एकाग्रता पतला। PDMS बाधा से सीमांकित विदेश मंत्रालय के क्षेत्र के बारे में 7.065 मिमी 2, और चढ़ाया कोशिकाओं की कुल संख्या है 600 कोशिकाओं / μl एक्स 24 μl = 14,400 कोशिकाओं, / 2 मिमी 2038 कोशिकाओं के अंतिम घनत्व।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर humidified सीओ 2 माहौल (5%) के साथ इनक्यूबेटर में विदेश मंत्रालय के उपकरणों रखें।
  3. तीन आयामी संस्कृति के निर्माण के लिए प्रारंभिक चरण को पूरा करने के लिए multiwell प्लेटों के अंदर तैनात microbeads monolayer की सतह पर / μl 600-700 कोशिकाओं (लगभग 100,000 कोशिकाओं) की एक सेल एकाग्रता के साथ निलंबन के 160 μl बांटो। 37 डिग्री सेल्सियस पर humidified सीओ 2 माहौल (5%) के साथ इनक्यूबेटर में multiwell प्लेटों रखो।

4. 3 डी neuronal नेटवर्क निर्माण

  1. 6-8 घंटे चढ़ाना के बाद, के बारे में 30-40 μl की एक मात्रा के लिए निर्धारित एक पिपेट का उपयोग करके PDMS बाधा से सीमांकित क्षेत्र के अंदर बहुत ध्यान से multiwell प्लेटों से निलंबन (न्यूरॉन्स के साथ microbeads) हस्तांतरण। प्रत्येक हस्तांतरण के बाद, एक हेक्सागोनल कॉम्पैक्ट संरचना में स्वयं को इकट्ठा करने के लिए microbeads अनुमति देने के लिए, के बारे में आधे से एक मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  2. सभी परतों जमा और अनायास इकट्ठा कर रहे हैं एक बार, मध्यम के बारे में 300 μl PDMS बाधा से सीमांकित क्षेत्र के ऊपर से एक बड़ी गिरावट के साथ फिर से भरना।
  3. इनक्यूबेटर में (टी = 37.0 ओ सी, सीओ 2 = 5%) विदेश मंत्रालय के लिए युग्मित 3 डी संरचना रखो 48 घंटे के लिए अपनी पूरक के साथ मध्यम विकास संस्कृति के अंतिम मात्रा (लगभग 1 एमएल) जोड़ने से पहले।
    नोट: झिल्ली डालने (30,000) और विदेश मंत्रालय डिवाइस (6000) पर एक परत पर मोतियों की संख्या के साथ multiwell प्लेटों पर मोतियों की कुल संख्या पर विचार करें। परिणामस्वरूप 3D संरचना मील के 5 परतों से बना हैcrobeads और कोशिकाओं। 3 डी न्यूरोनल नेटवर्क ज्यामितीय सही नहीं है कि खाते में ले रहा है, जिसके परिणामस्वरूप 3D संरचना 5-8 परतों से बना जा सकता है।
  4. दिन चढ़ाना के बाद, ध्यान से विदेश मंत्रालय के रिंग के अंदर मध्यम (लगभग 900 μl) के अंतिम मात्रा में जोड़ें। 4-5 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified सीओ 2 माहौल (5%) में 3 डी संस्कृतियों को बनाए रखें। एक सप्ताह में एक बार मध्यम के आधे बदलें।

5. confocal माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण

  1. एक धारक में माइक्रोस्कोप के मंच को जैविक नमूने को ठीक करें। सही बैंडविड्थ उत्सर्जन फिल्टर और आदेश में कब्जा करने के लिए प्रत्येक छवि के लिए पीएमटी की छवि, लाभ और ऑफसेट (-0.3%) प्राप्त करने के लिए, जिस पर लेजर (आर्गन, 496-555 एनएम), स्कैन गति (400 हर्ट्ज) सेट संतृप्ति से बचने के लिए और शोर अनुपात संकेत बढ़ाने के लिए। परिणाम अनुभाग चित्रा 4 की छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल मूल्यों की रिपोर्ट।
  2. जेड -stack अनुक्रम, देवदार के अधिग्रहण के लिएअनुसूचित जनजाति, ऊपर और नमूना के नीचे की परत के Z स्थिति के मूल्य का चयन करें, और उसके बाद अधिग्रहण करने के लिए कदम आकार का चयन करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

। इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया में, एक प्रासंगिक भूमिका 3 डी neuronal नेटवर्क के विकास के लिए यांत्रिक पाड़ को परिभाषित है कि microbeads द्वारा खेला जाता है 1 ए और बी प्रदर्शन microbeads की व्यवस्था (40 ± 2 माइक्रोन की नाममात्र व्यास आंकड़े की प्रमाणित मतलब व्यास विमान में 42.3 ± 1.1 माइक्रोन)। ऐसी संरचनाओं की ख़ासियत microbeads अनायास एक कॉम्पैक्ट हेक्सागोनल ज्यामिति (चित्रा 1 बी और सी) में परिभाषित करने स्वयं को इकट्ठा करता है। इसलिए उत्पन्न पाड़ neurites और सेल शरीर के चयापचय आदान प्रदान के लिए एक बड़ा पर्याप्त मध्य अंतरिक्ष के लिए एक लगातार वृद्धि सतह की गारंटी देता है। इस microbead आयाम मध्य रिक्ति और अंतिम न्यूरोनल घनत्व के लिए एक उचित समझौता होना साबित करता है। PDMS संरचना एक 'आदर्श' सिलेंडर recreates, और कॉम्पैक्ट हेक्सागोनल संरचना प्रभाव कारक (HPF) के बाद से 40 के मोतियों की अधिकतम संख्या (व्यास, 0.74 के बराबर है कि ध्यान में रखते हुए81; PDMS बाधा के भीतर निहित मीटर) के बारे में 1,00,000, प्रत्येक परत के बारे में प्रति 6,000 microbeads से मेल खाती है, जो है। नयाचार अनुभाग में बताया गया है, इन microbeads पूर्व वातानुकूलित आसंजन कारकों (यानी, laminin और पाली-डी-लाइसिन) के साथ कर रहे हैं। यह प्रक्रिया न्यूरॉन्स microbeads का पालन करना है कि गारंटी देता है। चित्रा -1 तीन न्यूरॉन्स 40 माइक्रोन की एक व्यास के साथ एक microbead करने के लिए मिलकर कर रहे हैं, जहां एक उदाहरण दिखाता है।

चित्र 1
न्यूरोनल नेटवर्क के लिए चबूतरा बनाने के लिए इस्तेमाल microbeads 1. छवियाँ चित्रा। (ए, बी) झिल्ली डालने के साथ एक multiwell थाली की सतह पर microbeads के monolayers के दो उदाहरण हैं। (सी) microbeads गुरुत्वाकर्षण बल के तहत बसे और अनायास 2 डी हेक्सागोनल सरणियों में इकट्ठे हुए। पहली परत पूरी तरह से, अन्य मोती जोड़ रहे हैं पैक किया जाता है एक बार, निर्माणएक ही हेक्सागोनल समरूपता वाले एक दूसरे का आदेश दिया परत हैैं। Microbeads के आगे इसके एक पैक 3 डी विधानसभा के निर्माण में हुई। microbeads के बीच मुक्त अंतरिक्ष न्यूरोनल प्रक्रियाओं और सेल निकायों द्वारा भरा जाता है। (डी) तीन न्यूरॉन्स पहले आसंजन कारकों (Laminin और पाली-डी-लाइसिन) के साथ वातानुकूलित, एक भी microbead की सतह पर लंगर डाले हैं। देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

विदेश मंत्रालय के सक्रिय क्षेत्र के साथ microbeads और न्यूरॉन्स के interfacing आंकड़े 2A और बी में दिखाया गया मोल्ड के साथ महसूस एक elastomeric बाधा (चित्रा -2), की वजह से है। चित्रा 2A लेआउट और चयनित आयामों से पता चलता है। विदेश मंत्रालय के सक्रिय क्षेत्र (चित्रा 2 डी विदेश मंत्रालय सब्सट्रेट करने के लिए चित्रा -2 सी के PDMS संरचना युग्मन द्वारा सीमांकित है)। इस रास्ते में, न्यूरॉन्स विदेश मंत्रालय के सक्रिय इलेक्ट्रोड क्षेत्र का पालन करने के लिए मजबूर कर रहे हैं। बाद में, पक्षपाती न्यूरॉन्स के साथ कांच microbead के ढेर इस पहली परत पर समायोजित किया जाएगा। चित्रा 2 डी PDMS संरचना की भूमिका स्पष्ट रूप से सराहना की जा सकती है, जहां अंतिम विन्यास की एक पार अनुभाग से पता चलता है। PDMS संरचना द्वारा सीमांकित अंतरिक्ष microbeads और न्यूरॉन्स के मिश्रण (चित्रा 2 डी के नीचे पैनल में सफेद पाउडर) शामिल हैं। बाहरी और आंतरिक 22.0 के व्यास और 3.0 मिमी क्रमशः और 650 माइक्रोन की ऊंचाई: PDMS संरचना निम्नलिखित आयामों के साथ चित्रा 2 बी में दिखाया गया आचारण के साथ बनाया गया एक सिलेंडर के आकार की है। ढालना प्रत्येक उपयोग के बाद PDMS कमी का चिपचिपा गुण के बाद से, एक आदर्श चिकनी और प्रतिरोधी सामग्री mask.The PDMS की कमी एक छोटे जीवनकाल प्रदर्शित elastomeric की निकासी की सुविधा के लिए बनाने के लिए जो पॉली कार्बोनेट और PTFE का उपयोग कर बनाया गया था। आमतौर पर , प्रत्येक PDMS संरचना सफलतापूर्वक तीन बार इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्र 2
चित्रा 3 डी न्यूरोनल नेटवर्क के निर्माण के लिए 2. सामग्री। शारीरिक बाधा पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया मोल्ड के (ए) डिजाइन और (बी) के छवि। ग्रे 3 मिमी व्यास सिलेंडर (सी) में दिखाया गया बाधा। (सी) PDMS बाधा एक माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) के सक्रिय क्षेत्र पर रखा के छेद से मेल खाती है। इस तरह के एक शारीरिक बाधा के उपयोग के लक्ष्य क्षेत्र के भीतर microbeads शामिल (लगभग 7 मिमी 2) और 3 डी नेटवर्क के विकास को सीमित करने की अनुमति देता है। (डी) विदेश मंत्रालय प्रणाली और बाधा के पार अनुभाग। (ऊपर दाएं कोने में माइक्रोस्कोप द्वारा दर्शाया) microbeads PDMS बाधा (नीचे के पैनल) द्वारा सीमांकित अंतरिक्ष में भर रहे हैं।080fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3 के पैनल के रूप में दर्शाया PDMS मुखौटा के माध्यम से विदेश मंत्रालय के सक्रिय क्षेत्र के कारावास के बाद, प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स और microbeads की विधानसभा का एहसास करने के लिए मुख्य कदम का वर्णन, जारी है।

पहले प्रारंभिक कदम चढ़ाना पहले आसंजन अणुओं Laminin और पाली-डी-लाइसिन (चित्रा 3) के साथ पहले से लेपित किया गया था, जो विदेश मंत्रालय की सतह पर न्यूरॉन्स अलग में होते हैं। यह 2 डी न्यूरोनल नेटवर्क विदेश मंत्रालय के सक्रिय क्षेत्र के लिए सीधे पालन करता है कि आवश्यक है: केवल इन शर्तों के तहत, electrophysiological संकेतों (यानी, spikes और फटने) की रिकॉर्डिंग संभव है। प्रोटोकॉल के इस पहले भाग 2 डी न्यूरॉन्स थाली करने के लिए प्रयोग किया जाता मानक प्रक्रिया से मेल खाती है। 3 डी प्रणाली के वास्तविक निर्माण आंकड़े 3 बी, सी और डी में दिखाया गया है (चित्रा 3 बी) के साथ multiwell प्लेटों में तैनात कर रहे हैं; बाद में, / μl 600-700 कोशिकाओं (लगभग 100,000 कोशिकाओं) की एक सेल एकाग्रता के साथ एक 160 μl निलंबन microbeads monolayer (चित्रा 3 सी) पर वितरित किया जाता है। कोशिकाओं मनका क्षेत्र के आधे से कब्जा कर सकते हैं, विचार है कि कुल मुक्त सतह 75 मिमी 2 है। microbeads monolayer पर सेल घनत्व / 2 मिमी के बारे में 1500 कोशिकाओं है। झिल्ली डालने के साथ उपयोग किया multiwell प्लेटों 33.6 मिमी 2 की सतह के साथ एक झरझरा झिल्ली प्रस्तुत करते हैं। झरझरा झिल्ली सतह और 40 माइक्रोन (मनका व्यास) की ऊंचाई के बराबर एक आधार क्षेत्र के साथ एक आभासी बेलनाकार आकृति पर विचार करके, 30,000 microbeads से बना एक समान परत झिल्ली डालने के साथ multiwell प्लेटों के लिए युग्मित है। microbeads और न्यूरॉन्स की तो एहसास हुआ कि निलंबन झिल्ली डालने के साथ multiwell प्लेटों के अंदर के बारे में 6-8 घंटे के लिए रहता है। एक बारपूरा कर रहे हैं ऊपर उल्लिखित कदम, 3 डी नेटवर्क का निर्माण शुरू कर सकते हैं। इस समय, न्यूरॉन्स और microbeads का मिश्रण झिल्ली डालने के साथ multiwell प्लेटों से हटा दिया है और पहले से PDMS बाधा (चित्रा 3 डी) द्वारा परिभाषित क्षेत्र पर चढ़ाया 2 डी न्यूरोनल नेटवर्क पर रखा। इस प्रक्रिया के दौरान, न्यूरॉन्स के बारे में 20-30% का नुकसान होता है (मैं) यांत्रिक जोड़तोड़ की वजह से (ii) झिल्ली के बाहर स्थानान्तरण करने के लिए। , जिसके परिणामस्वरूप 3 डी बाधा (7.06 मिमी 2) और 178.56 माइक्रोन (मोतियों की 5 परतों) की ऊंचाई के आधार क्षेत्र पर विचार, और मोतियों की 5 परतों द्वारा गठित आदर्श सिलेंडर की मात्रा से कोशिकाओं की संख्या से भाग दिया न्यूरोनल नेटवर्क सेल घनत्व / मिमी 3 के बारे में 80,000 कोशिकाओं है।

चित्र तीन
बुनियादी कदम की चित्रा 3. स्केच 2 डी और 3 डी neuronal नेटवर्क बनाने के लिए। (ए) चढ़ाना ओविदेश मंत्रालय के सक्रिय क्षेत्र पर च न्यूरॉन्स। न्यूरॉन्स के निलंबन पहले आसंजन कारकों के साथ वातानुकूलित और PDMS बाधा से सीमांकित, विदेश मंत्रालय की सतह पर चढ़ाया जाता है। यह कदम का एहसास करने के लिए अनुमति देता है: i) के विदेश मंत्रालय को मिलकर एक शास्त्रीय 2 डी न्यूरोनल नेटवर्क; द्वितीय) electrophysiological गतिविधि दर्ज किया जाएगा, जिसमें से एक 3 डी नेटवर्क की पहली परत। (बी) microbeads और (सी) न्यूरॉन्स 6-8 घंटे के बाद झिल्ली डालने के साथ multiwell प्लेटों की सतह के लिए दिया जाता है। (डी) निलंबन न्यूरॉन्स और microbeads के 2 डी नेटवर्क से झिल्ली डालने के साथ multiwell प्लेटों से ले जाया जाता है। इस कदम की पुनरावृत्ति कई बार। एक घने बहु परत 3 डी संरचना को परिभाषित करने के लिए 3 डी संरचना पूरा हो गया है, मध्यम की एक बूंद जोड़ा जाता है (ई) की अनुमति देता है, और जिसके परिणामस्वरूप संरचना 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में संग्रहित है। (एफ ) 48 घंटे के बाद, 3 डी संस्कृति पूरी तरह से माध्यम की अंतिम मात्रा के साथ refilled है।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पहली परत तैनात किया गया है, एक ही आपरेशन एक पैक 3 डी पहनावा प्राप्त करने के लिए दोहराया है। परिणामस्वरूप 3D संरचना ही एक कॉम्पैक्ट संरचना में स्वयं assembles microbeads और न्यूरॉन्स (चित्रा 4) के बारे में 5-8 परतों से बना है कि एक कोलाइडयन क्रिस्टल परिभाषित reorganizes। सभी परतों का गठन हो जाने के बाद, 3 डी नेटवर्क के माध्यम से 300 μl (3E चित्रा) की एक बूंद के साथ refilled किया जाना है। इस स्तर पर, MEAS करने के लिए मिलकर 3 डी नेटवर्क 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है। उसके बाद, के माध्यम से 1 मिलीलीटर विदेश मंत्रालय (3F चित्रा) की अंगूठी को भरने के लिए कहा है।

सभी परतों को इकट्ठा किया गया है एक बार, neurites / मिमी 3 के बारे में 80,000 कोशिकाओं के अंतिम सेल घनत्व तक पहुँचने microbead पाड़ खत्म हो जाना। यह notic लायक हैप्राप्त मूल्य 92,000 कोशिकाओं / मिमी 3, माउस मस्तिष्क प्रांतस्था 14 में औसत न्यूरोनल घनत्व से दूर नहीं है कि आईएनजी।

चित्रा 4 दिखाता ईमानदार confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कब्जा कर लिया Meas करने के लिए मिलकर 3 डी नेटवर्क के तीन उदाहरण हैं। चित्रा -4 ए में, डीआईसी (अंतर हस्तक्षेप विपरीत) छवि विदेश मंत्रालय की सतह के लिए मिलकर मोती की एक परत से पता चलता है; माइक्रोस्कोप 20.0 एनए 0.50 पानी उद्देश्य के साथ मिलकर किया गया था और छवियों संचारित पीएमटी माइक्रोस्कोप और एक लेजर आर्गन (488nm) को शामिल के साथ हासिल किया गया। तस्वीरें बहुत स्पष्ट रूप से इलेक्ट्रोड के स्थानिक लेआउट (काले डॉट्स) और microbeads की नियमित स्थानिक संगठन दिखा।

चित्रा 4 बी, मानचित्र -2 (रेड सिग्नल) के लिए एक immunofluorescence धुंधला में सीधे मुझे के इलेक्ट्रोड विमान के लिए युग्मित microbeads के चारों ओर न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान arborizations के वितरण और somata प्रदर्शित करता हैएक काले (संपर्कों की उपस्थिति में मनाया जा सकता है)। 4B चित्रा कदम आकार के साथ एक Z-ढेर अनुक्रम (108 माइक्रोन) की एक अधिकतम प्रक्षेपण है 1.53 माइक्रोन के बराबर होती है। छवियाँ 40.0 एनए 0.80 पानी उद्देश्य से हासिल किया गया; उत्तेजना आर्गन लेजर (488 एनएम), उत्सर्जन बैंडविड्थ 496nm-655nm है।

अंत में, चित्रा 4C एक 3 डी हिप्पोकैम्पस संस्कृति का एक Z -stack अनुक्रम (187.79 मीटर) की अधिकतम प्रक्षेपण को प्रदर्शित करता है (कदम आकार 2.27 माइक्रोन है)। जेड -stack अनुक्रम 25.0 एनए 0.95 पानी उद्देश्य से अधिग्रहण कर लिया था। ग्रीन चैनल के लिए, एक आर्गन लेजर 488nm और एक उत्सर्जन फिल्टर बैंडविड्थ 499nm-551nm इस्तेमाल किया गया। लाल चैनल के लिए, एक 543 एनएम लेजर और एक उत्सर्जन फिल्टर बैंडविड्थ 555nm-645nm इस्तेमाल किया गया। चैनलों के अनुक्रम मोड में हासिल किया गया। NeuN के लिए चिह्नित कर रहे हैं न्यूरॉन्स (रेड सिग्नल) परिपक्व बाद mitotic न्यूरॉन्स में और गाबा (हरी झंडी के लिए व्यक्त की है, जहां एक अत्यधिक परस्पर नेटवर्क Yel उभर) मर्ज में कम। गाबा एंटीबॉडी निरोधात्मक न्यूरॉन्स के लिए दोनों somata और neurites में सकारात्मकता का पता चला।

चित्रा 4
चित्रा 4. confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कब्जा 3 डी नेटवर्क के तीन उदाहरण हैं। विदेश मंत्रालय की सतह के लिए मिलकर मोती की एक परत दिखा (ए) डीआईसी (अंतर हस्तक्षेप विपरीत) छवि; इलेक्ट्रोड (काले डॉट्स) के स्थानिक लेआउट मानचित्र -2 (रेड सिग्नल) (बी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। नमूदार है वृक्ष के समान arborizations के वितरण और सीधे विदेश मंत्रालय के इलेक्ट्रोड विमान के लिए युग्मित microbeads के चारों ओर न्यूरॉन्स के somata प्रदर्शित करता है। ( सी) न्यूरॉन्स NeuN के लिए चिह्नित कर रहे हैं, जहां एक अत्यधिक परस्पर नेटवर्क को प्रदर्शित करने के लिए एक 3 डी संस्कृति का एक Z -stack अनुक्रम (187.79 मीटर) की अधिकतम प्रक्षेपण, हरी झंडी (रेड सिग्नल (परिपक्व बाद mitotic न्यूरॉन्स में) और गाबा के लिए व्यक्त मर्ज में पीले )। गाबा एंटीबॉडी फिरनाsomata और neurites में दोनों निरोधात्मक न्यूरॉन्स के लिए एक सकारात्मकता ealed। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक 3 डी संरचना की उपस्थिति नेटवर्क गतिशीलता modulates कि क्या समझते हैं, इसलिए उत्पन्न electrophysiological गतिविधि संदर्भ मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं जो Meas से अधिक हो पारंपरिक 2D neuronal नेटवर्क, की तुलना में था।

चित्रा 5
3 डी (बाएं स्तंभ) और 2 डी (सही कॉलम) हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों द्वारा प्रदर्शित नेटवर्क गतिशीलता के बीच चित्रा 5. तुलना प्रत्येक समय के पैमाने पर (ए: 1,200 सेकंड, बी: 300 सेकंड, सी: 60 सेकंड, डी: 10 सेकंड)।, 3 डी विधानसभाओं गतिविधि के हस्ताक्षर की एक किस्म प्रदर्शित (यानी, छोटी और लंबी नेटवर्क फटने, यादृच्छिक spiking2 डी लोगों को केवल उच्च सिंक्रनाइज़ फटने के साथ एक और अधिक स्पष्ट टकसाली गतिविधि प्रदर्शित जबकि गतिविधि सिंक्रनाइज़ फटने),। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 इन विट्रो में चौथे सप्ताह के दौरान एक 3 डी (बाएं पैनल) और 2 डी (सही पैनल) हिप्पोकैम्पस संस्कृति पर प्रदर्शन दो प्रतिनिधि प्रयोगों के दो रास्टर भूखंडों से पता चलता है। इन भूखंडों के सभी सक्रिय इलेक्ट्रोड पर दर्ज नेटवर्क की विद्युतीय गतिविधि को दिखाने (यानी।, एक फायरिंग दर से अधिक 0.1 के spikes / एस के साथ इलेक्ट्रोड)।

2 डी नेटवर्क की गतिशीलता मुख्य रूप से नेटवर्क फटने से बना एक अर्ध-तुल्यकालिक गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। इस गतिशील के हस्ताक्षर लगभग कोई गतिविधि दर्ज की गई है, जिसमें अवधि द्वारा बीच-बीच में रिकॉर्डिंग चैनलों का सबसे शामिल है जो सिंक्रनाइज़ घटनाओं की उपस्थिति है (की सही पैनल देखेंगेचित्रा 5 डी)। यह व्यवहार बढ़ाई रेखांकन के विभिन्न स्तरों के रूप में, अलग-अलग समय के तराजू पर सराहना की जा सकती।

एक 3 डी नेटवर्क के मामले में, नेटवर्क गतिशीलता के हस्ताक्षर के द्वारा होती गतिविधियों की एक व्यापक प्रदर्शनों की सूची में शामिल हैं: (i) के कम वैश्विक synchrony, (द्वितीय) और अधिक यादृच्छिक spiking गतिविधि (iii) की अवधि में जो उप-नेटवर्क (यानी , microelectrodes के एक सबसेट) नेटवर्क फटने की घटना के साथ एक अधिक तुल्यकालिक गतिविधि प्रस्तुत करते हैं। 2 डी नेटवर्क में मनाया एक के समान अवधि के साथ नेटवर्क फटने की उपस्थिति है, लेकिन लंबे समय तक नेटवर्क फटने भी कर रहे हैं: इसके अलावा, नेटवर्क फटने की अवधि अधिक चर के रूप में अच्छी तरह से है। इस तरह के एक तरीकों का उपयोग करके प्राप्त की आकस्मिक 3 डी गतिशीलता का एक पूर्ण और मात्रात्मक लक्षण वर्णन 16 में पाया जा सकता है। प्रत्याशित रूप में, यह भी 3 डी न्यूरोनल नेटवर्क दर्शाती एक महत्वपूर्ण 'यादृच्छिक spiking' और गैर-तुल्यकालिक फोड़ एकctivity। इन 3 डी संरचनाओं के द्वारा उत्पन्न की गतिशीलता की दिखावट के रूप में, कुछ नियंत्रण-प्रयोगों (जैसे, एक नंगे विदेश मंत्रालय के साथ microbeads पर इकट्ठे नंगे microbeads और 3 डी नेटवर्क के एक ढेर के साथ एक विदेश मंत्रालय मिलकर 2 डी नेटवर्क की उपस्थिति) के साथ proofed कर दिया गया है 16 में सूचना दी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस काम में, 3 डी से बना विट्रो मंच में एक उपन्यास प्रयोगात्मक नेटवर्क इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए Meas प्रस्तुत किया गया है करने के लिए मिलकर neuronal संस्कृतियों इंजीनियर। Z धुरी साथ neuritic परिणाम अनुमति देने के लिए पाड़ के रूप में microbeads का उपयोग तलीय विदेश मंत्रालय के साथ एकीकृत किया जा अनुरूप किया गया है। इस तरह, एक वैध और विश्वसनीय इन विट्रो 3 डी मॉडल में प्राप्त सूक्ष्म प्रणाली परिणामों आकस्मिक electrophysiological गतिशीलता 16 अध्ययन करने के लिए।

विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग सेट-अप

विदेश मंत्रालय के उपकरणों विद्युत सक्रिय ऊतकों से कोशिकी संकेतों को मापने में सक्षम सब्सट्रेट एम्बेडेड सूक्ष्म इलेक्ट्रोड का एक एकीकृत सरणी के साथ एक संस्कृति कक्ष से मिलकर बनता है। ठेठ दर्ज की गई संकेतों (यानी, एकल सुप्रा दहलीज वोल्टेज एक या एक से अधिक न्यूरॉन्स की विद्युतीय गतिविधि का प्रतिनिधित्व भिन्नता) और फटने (यानी, अत्यधिक पैक spikes के अनुक्रम अक्सर occurrin के spikes से मिलकर बनता हैएक साथ कई चैनलों पर छ)। विदेश मंत्रालय आधारित प्रणाली के साथ neuronal नेटवर्क गतिविधि की रिकॉर्डिंग डेटा (जैसे, एक 60 चैनलों के विदेश मंत्रालय के साथ एक 4 घंटा प्रयोग के बारे में 15 जीबी का एक रिकार्ड उत्पादन) का भारी मात्रा में उत्पादन होता है। इस प्रक्रिया को और विशेष रूप से लंबे समय रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है कि पढ़ाई के मामले में, डेटा का विश्लेषण करने के लिए कुशल उपकरणों की आवश्यकता निकलता है। सामान्य तौर पर, electrophysiological संकेतों की रिकॉर्डिंग neuronal संस्कृतियों के साथ एक सीधा बाह्य पारगमन, और एक वोल्टेज संकेत के अधिग्रहण के द्वारा प्राप्त की है। एक प्रवर्धन और छानने के चरण के बाद, संकेतों 10-50 किलोहर्ट्ज़ जांचा और जमा हो जाती है। कच्चे संकेत तो चोटी का पता चला एक कस्टम विकसित सॉफ्टवेयर उपकरण के द्वारा कर रहे हैं। रिकॉर्डिंग प्रणाली (1) विदेश मंत्रालय एम्पलीफायर के शामिल है, (2) ए / डी अधिग्रहण बोर्ड (3) रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर, (घ) हीटिंग सिस्टम और तापमान नियंत्रक, के साथ सुसज्जित पर्सनल कंप्यूटर वाष्पीकरण को रोकने (4) सीओ 2 माहौल बनाए रखने और सिस्टम।

3 डी neuronal नेटवर्क के निर्माण के लिए दो महत्वपूर्ण कदम के माध्यम से चला जाता है: पहले एक झिल्ली डालने की सतह के साथ multiwell प्लेटों पर मोतियों की सही राशि का वितरण होता है, दूसरा एक multiwell से पक्षपाती न्यूरॉन्स के साथ microbeads के निलंबन के हस्तांतरण है झिल्ली डालने के साथ प्लेटों (i) 2 डी न्यूरोनल नेटवर्क विदेश मंत्रालय (पहली परत) के सक्रिय क्षेत्र पर चढ़ाया; (Ii) पहले से ही तय हो चुका परतें। इस आपरेशन के लिए आवश्यक परतों की संख्या के रूप में कई बार दोहराया जाना चाहिए। संस्कृति के पहले सप्ताह के दौरान, neuritic एक्सटेंशन की एक तेजी से विकास के विभिन्न परतों पर संबंधित microbeads के चारों ओर जगह लेता है। न्यूरॉन्स और microbeads के बीच घनिष्ठ संबंध जैविक नमूने स्थिर और / बदलने मध्यम जगह है और यह हानिकारक के बारे में चिंता किए बिना विदेश मंत्रालय एम्पलीफायर के साथ बिजली की गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए इनक्यूबेटर से इसे स्थानांतरित करने की अनुमति देते हैं।

पूरे शुद्ध के electrophysiological गतिविधि के बाद सेकाम ही (यानी, सीधे विदेश मंत्रालय के लिए युग्मित एक), सक्रिय क्षेत्र में एक पारंपरिक 2D नेटवर्क में शामिल किया जाना चाहिए नीचे की परत से दर्ज की गई है। अन्य परतों 2D एक पर कदम से कदम जोड़ दिया जाएगा, और लंबी दूरी से कनेक्शन परतों के बीच फैल जाएगा। व्यावहारिक रूप से, अन्य परतों न्यूरॉन्स और microbeads का मिश्रण गवाही से 6-8 घंटे बाद में 2 डी एक से जोड़ रहे हैं। इस अस्थायी खिड़की के चुनाव 2 डी परत में कुछ synaptic कनेक्शन के गठन के लिए अनुमति देता है, और भी ऊपरी परतों से कनेक्शन स्थापित करने की संभावना की गारंटी देता है।

दो कारकों झिल्ली के साथ multiwell प्लेटों का उपयोग 3 डी नेटवर्क का एहसास करने के लिए आवश्यक डालने बनाने: (i) न्यूरॉन्स और microbeads उपस्थित विभिन्न अवसादन गति के बाद से, झिल्ली डालने के साथ multiwell प्लेटों का उपयोग microbeads के शीर्ष पर न्यूरॉन्स का एक समान वितरण की गारंटी : औसत पर, प्रत्येक microbead न्यूरॉन्स की एक ही नंबर से घिरा हुआ जा सकता है। (Ii) बीY झिल्ली डालने के साथ multiwell प्लेटों की लोचदार संपत्तियों का शोषण, न्यूरॉन्स के लिए युग्मित microbeads के समाधान की लहर पॉली कार्बोनेट बहु कुओं की तरह ठोस सतहों का उपयोग कर की तुलना में आसान है।

प्रस्तुत काम Pautot द्वारा प्रस्तावित दृष्टिकोण के बाद और 15 सहकर्मियों: है कि अध्ययन में सिलिका मोती के उपयोग के पालन करने के लिए neuronal सेल निकायों के लिए काफी बड़े और उनकी प्रक्रियाओं को विकसित करने के लिए, परिपक्व और पूर्व और बाद synaptic विशेषज्ञताओं का उत्पादन एक वृद्धि की सतह प्रदान की । मोती पाड़ के उपयोग के लिए एक मान्य विकल्प हाइड्रोजेल मेट्रिसेस या बायोएक्टिव और chitosan जैसी प्राकृतिक biopolymer से बना है biodegradable मोतियों से आता है। काइटिन और उसके deacetylated व्युत्पन्न, chitosan, गैर विषैले, जीवाणुरोधी, biocompatible और biodegradable biopolymers हैं। ऐसे बायो़डीग्रेडेशन प्रक्रिया के समय लगातार 20,21 विकसित हो जाना नेटवर्क के साथ संगत है।

इस अध्ययन के लिए एक संदर्भ wor गठन हो सकता हैव्यवस्थित नेटवर्क गतिशीलता और संरचना के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए उन्नत 3 डी न्यूरोनल मॉडल प्रणाली के भविष्य के विकास के लिए कश्मीर। एक कम समय में, हम उपकरणों 22 की एक नई पीढ़ी पर 3 डी नेटवर्क का निर्माण हस्तांतरण करने में सक्षम होने की उम्मीद है। निर्माण तकनीक 50 और 350 माइक्रोन के बीच एक चर हाइट्स में सूक्ष्म स्तंभों के रूप में इलेक्ट्रोड का उत्पादन शामिल है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

लेखकों कारावास संरचना और डी ओ टी टी को विकसित करने में तकनीकी सहायता के लिए जियोर्जियो Carlini धन्यवाद। पांडुलिपि की पूरी तरह से संशोधन के लिए Ornella LoBrutto। इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान के लिए यूरोपीय संघ के 7 वें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है (आईसीटी FET के FP7 / 2007-2013, FET के युवा खोजकर्ता योजना) अनुदान समझौते 284,772 मस्तिष्क धनुष के तहत (www.brainbowproject.eu)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminin Sigma-Aldrich L2020 0.05 µg/ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 0.05 µg/ml
Trypsin Gibco 25050-014 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase Sigma-Aldrich D5025 0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal Gibco Invitrogen 21103049 culture medium
B27 Gibco Invitrogen 17504044 2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-2442 10%
Glutamax-I  Gibco 35050038 0.5 mM
gentamicin Sigma-Aldrich G.1272 5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) Corning Sigma 481939 curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays Multi Channel Systems (MCS) 60MEA200/30-Ti-pr MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead Distrilab-Duke Scientific 9040  1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
Transwell Costar Sigma CLS 3413 multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++  Gibco Invitrogen 14175-052
Hanks Buffer Solution  Sigma  H8264
Teflon Sigma 430935-5G polytetrafluoroethylene
Rat Sprague Dawley Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright Leica TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
40.0x0.80 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
25.0x0.95 WATER objective Leica HCX IRAPO L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
  2. Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
  3. Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
  4. Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
  5. Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
  6. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
  7. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
  8. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
  9. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
  10. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
  11. Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
  12. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
  13. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
  14. Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
  15. Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
  16. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
  17. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
  18. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
  19. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
  20. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
  21. Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
  22. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 104 3 डी नेटवर्क इंजीनियर नेटवर्क neuronal संस्कृतियों माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों (meas) नेटवर्क गतिशीलता electrophysiological संकेतों
माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों के लिए 3 डी इंजीनियर Neuronal संस्कृति Interfacing: एक अभिनव<em&gt; इन विट्रो</em&gt; प्रयोगात्मक मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tedesco, M., Frega, M., Martinoia,… More

Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model. J. Vis. Exp. (104), e53080, doi:10.3791/53080 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter