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Neuroscience

Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante Published: October 18, 2015 doi: 10.3791/53080
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 1
1Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering (DIBRIS), University of Genova, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Department of Cognitive Neuroscience, Radboud University Medical Center, 3Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia (IIT)

Introduction

In vitro en deux dimensions (2D), les réseaux de neurones couplés à micro-électrodes (AME) Arrays arethe modèle expérimental étalon-or adoptée pour étudier l'interaction entre les dynamiques neuronales et de la connectivité sous-jacente. Lors du développement, les neurones de recréer des réseaux complexes qui affichent ainsi l'activité definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (ie, des éclats, des éclats de réseau, l'activité de dopage aléatoire). AME enregistrent l'activité électrophysiologique de nombreux sites (de quelques dizaines à des milliers de microélectrodes), permettant une étude détaillée de la dynamique exprimées au niveau du réseau. En outre, l'utilisation de cultures dissociées rend possibile de concevoir-réseaux d'ingénierie. Il est plus facile de comprendre de cette manière les relations fonctionnelles entre l'activité électrophysiologique enregistrées et les paramètres de l'organisation de réseau comme la densité cellulaire 3, degré de modularité 4,5, la présence de la pop neuronale hétérogèneglement 6, etc. Cependant, toutes les études in vitro sur des cellules en culture dissociés sont basés sur des réseaux neuronaux 2D. Cette approche conduit à des simplifications excessives par rapport à la (intrinsèquement 3 dimensions 3D) système in vivo: (i) dans un modèle 2D, Somata et de croissance cônes sont aplaties et l'excroissance des axones-dendrites peut pas se propager dans toutes les directions 7. (ii) 2D in vitro réseaux exposition stéréotypé dynamique électrophysiologiques dominés par l'éclatement activité impliquant la plupart des neurones du réseau 8.

Récemment, différentes solutions ont été développées pour permettre la construction d'dissocié in vitro 3D réseaux neuronaux. L'idée commune consiste à créer un échafaudage où les neurones peuvent se développer dans un mode 3D. Un tel échafaudage peut être réalisé avec des gels de polymères et de matrices poreuses solides 9-13. En exploitant les propriétés mécaniques des polymères, il est possible d'incorporer des cellules à l'intérieur thesstructures de e en définissant un bloc uniforme des cultures 3D de neurosphères 11. La principale caractéristique de cette approche est la propriété mécanique rigide des neurosphères 9,12. Cependant, ces matériaux ont une porosité limitée, et ils ne garantissent pas la migration des cellules à l'intérieur de la matrice. Pour pallier cet inconvénient, une solution possible consiste à découper la matrice en modules de «base». Malheureusement, la taille et la forme de la diversité des particules pourrait entraver l'emballage dans des structures en couches régulières. Dans 7, Cullen et ses collègues ont conçu une construction neuronale 3D constitué de neurones et / ou des astrocytes dans un extracellulaire échafaudage à base de matrice bioactive. Un tel tissu neural conçu permis dans les enquêtes in vitro pour étudier et manipuler les réponses neurobiologiques dans des micro-environnements 3D. Ce modèle est composée de neurones et de cellules gliales distribuées dans toute la matrice extracellulaire (ECM) et / ou des échafaudages d'hydrogel (500 à 600 pm d'épaisseur). Dans ce condition, une viabilité cellulaire optimale (supérieur à 90%) a été trouvée en étalant les cellules à une densité finale d'environ 3750 - 5000 cellules / mm 3. Il est à noter qu'une telle valeur de densité est beaucoup plus faible que celle de la condition in vivo, où la densité de cellules du cortex cérébral de souris est d'environ 90 000 cellules / mm 3 14. Pour surmonter cette limitation Pautot et ses collaborateurs 15 réalisé un système 3D in vitro où la densité cellulaire et la connectivité réseau sont contrôlés à ressembler à des conditions in vivo, tout en permettant l'imagerie en temps réel du réseau. En pratique, ce procédé est basé sur le concept que dissociées sont des neurones en culture capable de croître sur des microbilles de silice. Ces perles offrent une surface assez grande pour les corps cellulaires neuronaux à respecter et pour leurs arborisations à grandir, mûrir, étendre, et de définir des contacts synaptiques avec d'autres neurones croissance. Cette méthode exploite les propriétés d'assemblage spontané de perles mono-dispersées à form 3D couches réseaux hexagonaux contenant des sous-ensembles distincts de neurones sur des couches différentes avec la connectivité entre les neurones contraint sur différentes perles. La densité cellulaire obtenue avec cette méthode était d'environ 75 000 cellules / mm 3.

Récemment, nous avons adapté la méthode de Pautot aux AME 16: les résultats obtenus montrent que l'activité électrophysiologique 3D présente un répertoire plus large d'activités que celui exprimé par des réseaux 2D. Cultures matures 3D présentent une dynamique améliorée dans laquelle les deux rafale de réseau et aléatoire l'activité de pointe coexistent. De même, Tang-Schomer et ses collaborateurs ont réalisé 17 un échafaudage poreux à base de protéine de soie qui maintient une culture corticale primaire in vitro pour plusieurs mois, et enregistré l'activité électrophysiologique à l'aide d'une électrode en tungstène.

Dans ce travail, les procédures expérimentales de construire des réseaux neuronaux 3D couplés à AME sera décrite.

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Protocol

Le protocole expérimental a été approuvé par la législation européenne de protection des animaux (2010/63 / UE), par le ministère italien de la Santé, conformément à la DL 116/1992 et par les lignes directrices de l'Université de Gênes (Prot. N. 13130, mai 2011). Tous les efforts ont été faits pour réduire le nombre d'animaux pour le projet et pour minimiser leur souffrance.

1. Préparation des matériaux et supports

  1. Construire le moule pour construire les PDMS (Poly-diméthyl-siloxane) contrainte au moyen d'un CNC (commande numérique par ordinateur) fraiseuse. Un tel moule est réalisé en polycarbonate avec le cylindre central en polytétrafluoroéthylène (PTFE). Ce matériau permet une extraction plus facile du masque une fois que le PDMS a durci.
    REMARQUE: La conception du moule a été réalisé par Computer-Aided-Design (CAD), puis livré à la fraiseuse CNC.
  2. Préparer l'élastomère PDMS. PDMS est un polymère organique. Il est composé de deux éléments, Un agent de durcissement et un polymère. Mélangez par un rapport en volume de 1:10, une partie d'agent de durcissement et neuf parties de polymère. Mettez les deux composants dans une boîte de Pétri, secouez et insérez le mélange dans la chambre à vide pendant 10 min pour éliminer les bulles d'air. 3 g de PDMS sont suffisantes pour une contrainte.
  3. Construire la contrainte PDMS. Insérez le matériau PDMS dans le mouleur et le mettre dans le four pendant 30 min à 120 ° C. La contrainte PDMS a la forme d'un cylindre idéal avec un diamètre externe et interne de 22,0 mm et 3,0, respectivement, et une hauteur de 650 pm.
  4. Le jour avant le placage, coupler le masque à la zone active des réseaux de micro-électrodes (AME) à l'aide d'une pince à épiler sous un stéréomicroscope et stériliser le masque PDMS dans le four à 120 ° C.
  5. Stériliser les microbilles de verre (diamètre nominal de 40 ± 2 um; diamètre moyen de 42,3 ± certifié 1,1 pm) dans 70% d'éthanol pendant 2 heures dans un flacon conique et tourner evEry 30 min pour exposer tous les microbilles.
  6. Retirer la solution d'éthanol à partir de la fiole et les microbilles rincer deux fois avec de l'eau stérilisée.
  7. Conditionner la partie centrale de la zone délimitée par la MEA masque PDMS (diamètre égal à 3,0 mm) avec 24 ul d'une solution mixte de Poly-D-Lysine et laminine à 0,05 ug / ml.
  8. Enduire les microbilles avec des protéines d'adhérence, de la laminine et de poly-D-lysine à 0,05 ug / ml et de les laisser pendant une nuit à l'étuve à 37 ° C, pour obtenir un réseau neuronal stable et de longue durée.
  9. Retirer les facteurs d'adhésion à la fois à partir de la surface du verre de la MEA et de microbilles de verre. Aspirer environ 95% de la solution de revêtement avec une pipette et appliquer une petite 24μl- en volume d'eau stérile à la surface du MEA. Aspirer à nouveau plus de 95% de l'eau et laissez la MEA à sec sous le capot laminaire pendant 1 h avant l'ensemencement des cellules.
    NOTE: Dans le cas de microbilles place, aspirer le revêtementsolution et faire un premier lavage avec de l'eau stérilisée et un second avec le milieu de base et son supplément comme B27, afin de conditionner la surface de verre où les neurones seront étalées. Ne laissez pas les microbilles sec. Les laisser en suspension dans le milieu de culture à l'intérieur du flacon.
  10. Distribuer, au moyen d'une pipette -200 μl-, la suspension de microbilles traités (environ 32 000) sur une plaque à puits multiples avec insert de membrane (diamètre des pores 0,4 pm), où ils auto-assemblage formant une couche uniforme.
  11. Remplir chaque puits de la membrane avec 0,5 ml de milieu et le mettre dans l'incubateur (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) jusqu'à ce que les neurones sont prêts à être plaqué (3.2).

2. Dissection d'embryons et de la dissociation des tissus

  1. Maison rats femelles adultes (200-250 g) à une température constante (22 ± 1 ° C) et l'humidité relative (50%) selon un calendrier clair-obscur régulière (la lumière sur les sept heures-19 heures) dans leanimalerie. Veiller à ce que la nourriture et l'eau sont disponibles gratuitement.
  2. Anesthésier un rat femelle enceinte après 18 jours de développement (E18) en utilisant 3% d'isoflurane. Ensuite, sacrifier l'animal par dislocation cervicale.
  3. Retirer hippocampes de l'embryon de rat et les placer dans une solution saline équilibrée de la glace froide de Hank sans Ca 2+ et Mg 2+. Au jour 18 de l'hippocampe de développement et de tissus de cortex sont très doux et ne nécessitent pas d'être coupé en petits morceaux. De plus amples détails peuvent être trouvés 18,19.
  4. Dissocier le tissu à 0,125% de solution de trypsine / 0,05% de Hank contenant de 18 à 20 pour la DNAse min à 37 ° C.
  5. Retirer la solution de surnageant avec une pipette Pasteur et arrêter la digestion enzymatique par addition de milieu avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) pendant 5 min.
  6. Retirer le moyen de FBS et laver une fois avec du milieu avec son complément, 1% de L-glutamine, la gentamicine 10 ug / ml. Retirer à nouveau le milieu avec un pip Pasteurette et remplir à nouveau avec une petite quantité (500 pi) de milieu de croissance avec son complément, 1% de L-glutamine, la gentamicine 10 ug / ml.
  7. Dissocier le culot tissulaire mécaniquement avec une pipette Pasteur étroite jusqu'à une suspension laiteuse de cellules est apparent. Il est pas nécessaire de centrifuger la suspension cellulaire.
  8. Diluer le faible volume de suspension de cellules avec le milieu de croissance pour obtenir un volume final de 2,0 ml. Compter le concentration cellulaire obtenue avec une chambre de hémocytomètre. Diluer cette concentration à 1: 5 pour obtenir la concentration souhaitée de cellules de 600-700 cellules / ul.

3. Cellule Placage

  1. Cellules de la plaque à une densité d'environ 2000 cellules / mm 2 sur la zone active de la MEA, définis par la contrainte de PDMS pour créer un réseau neuronal 2D.
    NOTE: Chaque hippocampe contient environ 5 x 10 5 cellules, (1 x 10 6 pour un seul embryon). Disséquer 6 embryons pour obtenir un montant total de 6 x 106 cellules dans 2 ml, et une concentration d'environ 3.000 cellules / ul. Diluer cette concentration à 1: 5 pour obtenir la concentration souhaitée de la cellule et la plaque environ 600-700 cellules / ul. Si la zone de MEA délimitée par la contrainte est d'environ 7,065 PDMS mm 2, et le nombre total de cellules étalées à 600 cellules / ul ul x 24 = 14.400 cellules, la densité finale de 2.038 cellules / mm 2.
  2. Placez les dispositifs de MEA dans l'incubateur humidifié avec atmosphère de CO 2 (5%) à 37 ° C.
  3. Distribuer 160 pl de la suspension à une concentration cellulaire de 600-700 cellules / ul (environ 100 000 cellules) sur la surface de la monocouche de microbilles placée à l'intérieur des plaques multipuits pour terminer l'étape préliminaire à la construction de culture en trois dimensions. Mettre les plaques à puits multiples dans l'incubateur humidifié avec atmosphère de CO 2 (5%) à 37 ° C.

4. Construction 3D Neuronal réseau

  1. 6-8 heures après le placage, transférer la suspension (microbilles avec les neurones) des plaques à puits multiples très soigneusement l'intérieur de la zone délimitée par la contrainte PDMS en utilisant une pipette fixé pour un volume d'environ 30-40 ul. Après chaque transfert, attendez pendant environ une demi-minute, pour permettre aux microbilles se auto-assembler dans une structure hexagonale compacte.
  2. Une fois toutes les couches sont déposées et spontanément assemblés, remplir avec une forte baisse d'environ 300 pi de milieu du haut de la zone délimitée par la contrainte PDMS.
  3. Mettre la structure 3D couplée à la MEA dans l'incubateur (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) pendant 48 heures avant d'ajouter un volume final (environ 1 ml) de milieu de croissance avec la culture de son complément.
    NOTE: Considérons le nombre total de perles sur les plaques à puits multiples avec insert de membrane (30 000) et le nombre de perles sur une seule couche sur le dispositif de MEA (6000). La structure 3D résultante se compose de 5 couches de microbeads et des cellules. Tenant compte du fait que le réseau neuronal 3D est pas géométriquement parfaite, la structure 3D qui en résulte pourrait être composé de 5-8 couches.
  4. Le jour après l'étalement, ajouter soigneusement le volume final du milieu (environ 900 pi) à l'intérieur de l'anneau de MEA. Maintenir les cultures 3D dans une atmosphère humidifiée de CO2 (5%) à 37 ° C pendant 4-5 semaines. Remplacer la moitié du milieu une fois par semaine.

5. microscopie confocale Acquisition

  1. Fixer les échantillons biologiques à l'étape du microscope dans un support. Réglez le laser (Argon, de 496 à 555 nm), la vitesse de balayage (400 Hz) à laquelle d'acquérir l'image, le gain et l'offset (-0,3%) de PMT pour chaque image pour capturer le filtre bande passante d'émission correcte et dans l'ordre pour éviter la saturation et à augmenter le rapport signal à bruit. La section Résultats rapporte les valeurs utilisées pour acquérir les images de la figure 4.
  2. Pour l'acquisition de la séquence z -stack, sapinst sélectionner, la valeur de z position de la partie supérieure et la couche inférieure de l'échantillon, puis sélectionnez la taille de l'étape pour faire l'acquisition.

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Representative Results

. Dans ce mode opératoire, un rôle important est joué par les microbilles qui définissent l'échafaudage mécanique pour la croissance du réseau neuronal 3D figures affichage 1A et B la disposition des microbilles (diamètre nominal de 40 ± 2 um; diamètre moyen certifiée de 42,3 ± 1,1 pm) dans le plan. La particularité de ces structures est que microbilles auto assembler spontanément définissant une géométrie hexagonale compacte (figure 1B et C). L'échafaudage ainsi généré garantit une surface de croissance cohérente pour neurites et un assez grand espace interstitiel pour l'échange métabolique de corps cellulaires. Cette dimension de microbilles se révèle être un compromis raisonnable pour l'espacement interstitielle et la densité neuronale finale. Considérant que la structure PDMS recrée un cylindre «idéal», et depuis l'hexagonale facteur d'impact de la structure compacte (HPF) est égal à 0,74, le nombre maximum de perles (diamètre de 4081; m) contenu dans le PDMS contrainte est d'environ 100 000, ce qui correspond à environ 6000 microbilles par chaque couche. Comme expliqué dans la section Protocole, ces microbilles sont pré-conditionnés avec les facteurs d'adhésion (à savoir, la laminine et la Poly-D-lysine). Cette procédure garantit que les neurones adhèrent aux microbilles. Figure 1D montre un exemple où trois neurones sont couplés à une microbille d'un diamètre de 40 um.

Figure 1
Figure 1. Les images des microbilles utilisées pour créer l'échafaudage pour le réseau neuronal. (A, B) Deux exemples de monocouches de microbilles à la surface de plaque multi-puits avec un insert de membrane. (C) réglé microbilles sous la force de gravité et spontanément assemblés en 2D matrices hexagonales. Une fois la première couche est entièrement emballé, d'autres perles sont ajoutés, de construireing une deuxième couche ordonnée ayant la même symétrie hexagonale. Une nouvelle addition de microbilles donné lieu à la construction d'un ensemble emballé 3D. L'espace libre entre les microbilles est rempli par les processus neuronaux et les corps cellulaires. (D) de trois neurones sont ancrées sur la surface d'une seule microbille, préalablement conditionné avec des facteurs d'adhésion (laminine et Poly-D-lysine). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L'interfaçage et les microbilles de neurones avec la zone active d'un MEA est due à une contrainte en élastomère (figure 2C), réalisé avec le moule représenté sur les figures 2A et B. La figure 2A montre la disposition et les dimensions sélectionnées. La zone active de la MEA est délimitée par la structure de couplage de la figure 2C PDMS au substrat de la MEA (Figure 2D). De cette manière, les neurones sont forcées d'adhérer à la surface d'électrode active de la MEA. Par la suite, les piles de microbilles de verre avec des neurones adhérentes seront logés sur cette première couche. La figure 2D représente une vue en coupe de la configuration finale, où le rôle de la structure PDMS peut être clairement appréciée. L'espace délimité par la structure PDMS contient le mélange de microbilles et les neurones (poudre blanche dans le panneau inférieur de la figure 2D). La structure PDMS a la forme d'un cylindre intégré avec le moule représenté sur la figure 2B avec les dimensions suivantes: diamètre extérieur et intérieur de 22,0 mm et 3,0 respectivement et la hauteur de 650 pm. Le moule a été construit en utilisant le polycarbonate et le PTFE qui en font un matériau lisse et résistant idéal pour faciliter l'extraction de l'élastomère des contraintes masque.Procédé PDMS présentent une durée de vie plus courte, étant donné que les propriétés collantes de la diminution PDMS après chaque utilisation. Typiquement , Chaque structure PDMS peut être utilisé avec succès trois fois.

Figure 2
Figure 2. Les matériaux pour la construction du réseau neuronal 3D. Image (A) Conception et (B) du moule utilisé pour créer la contrainte physique. Le cylindre gris de 3 mm de diamètre correspond au trou de la contrainte représentée en (C). (C) PDMS contrainte placée sur la zone active d'un réseau de micro-électrodes (MEA). L'utilisation d'une telle barrière physique permet de contenir les microbilles au sein d'une zone cible (environ 7 mm 2) et limiter le développement du réseau 3D. (D) Vue en coupe du système de la MEA et de la contrainte. Microbilles (représentés par le microscope dans le coin en haut à droite) sont remplis dans l'espace délimité par la contrainte PDMS (panneau du bas).080fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Après le confinement de la zone active du MEA par l'intermédiaire du masque de PDMS, le protocole continue comme représenté sur les panneaux de la figure 3, en décrivant les principales étapes pour réaliser l'ensemble des neurones et des microbilles.

La première étape préliminaire consiste à dissocier les neurones placage sur la surface du MEA qui a été préalablement pré-revêtu avec les molécules d'adhésion laminine et Poly-D-lysine (figure 3A). Il est essentiel que le réseau neuronal 2D adhère directement à la zone active de la MEA: que dans ces conditions, l'enregistrement des signaux électrophysiologiques (c.-à pointes et des éclats) est réalisable. Cette première partie du protocole correspond à la procédure standard utilisée pour plaquer neurones 2D. La construction réelle du système 3D est représenté sur les figures 3B, C, D et (figure 3b); par la suite, une suspension de 160 ul avec une concentration cellulaire de 600-700 cellules / ul (environ 100 000 cellules) est distribué sur la microbilles monocouche (figure 3C). Étant donné que les cellules peuvent occuper la moitié de la zone du talon, la surface libre totale est de 75 mm 2. La densité cellulaire des microbilles sur la monocouche est à environ 1500 cellules / mm 2. Les plaques multi-puits utilisés avec insert de membrane présentent une membrane poreuse avec une surface de 33,6 mm 2. En considérant une forme cylindrique virtuelle avec une surface de base égale à la surface de la membrane poreuse et une hauteur de 40 um (diamètre des billes), une couche uniforme composée de 30.000 microbilles est couplée aux plaques multipuits avec insert de membrane. La suspension ainsi réalisé de microbilles et les neurones reste pendant environ 6-8 h à l'intérieur des plaques à puits multiples avec insert de membrane. Une foisles étapes mentionnées ci-dessus sont achevés, la construction du réseau de 3D peuvent commencer. A ce moment, le mélange des neurones et des microbilles est retiré des plaques à puits multiples avec insert de membrane et mis sur le réseau neuronal précédemment 2D plaqué sur la zone définie par la contrainte PDMS (figure 3D). Pendant cette procédure, une perte d'environ 20 à 30% des neurones est due à (i) les manipulations mécaniques et (ii) le transfert à l'extérieur de la membrane. En tenant compte de la superficie de base de la contrainte (7,06 mm 2) et une hauteur de 178,56 um (5 couches de perles), et en divisant le nombre de cellules par le volume du cylindre idéal formé par les 5 couches de billes, le 3D résultant densité de cellules de réseau neuronal est d'environ 80 000 cellules / mm 3.

Figure 3
Figure 3. Croquis des étapes fondamentales pour créer des réseaux neuronaux en 2D et 3D. (A) Placage oneurones f sur la zone active d'un MEA. La suspension de neurones est plaqué sur la surface du MEA, préalablement conditionnée avec des facteurs d'adhésion et délimitée par la contrainte PDMS. Cette étape permet de réaliser: i) un réseau neuronal 2D classique couplé à MEA; ii) la première couche d'un réseau de 3D ​​à partir de laquelle l'activité électrophysiologique est enregistré. (B) des microbilles et (c) les neurones sont délivrés à la surface des plaques à puits multiples avec insert de membrane après 8/6 h. (D) La suspension des neurones et des microbilles est déplacé à partir des plaques à puits multiples avec insert de membrane au réseau 2D. La répétition de cette étape plusieurs fois permet de définir une structure multicouche 3D dense. (E) Lorsque la structure 3D est terminée, une goutte de milieu est ajouté, et la structure résultante est stockée dans l'incubateur pendant 48 heures. (F ) Après 48 h, la culture 3D est complètement rempli avec le volume final du milieu.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Une fois que la première couche a été positionné, la même opération est répétée pour obtenir un ensemble de 3D emballé. La structure 3D résultante se réorganise définissant un cristal colloïdal qui auto-assemble en une structure compacte constituées d'environ 8/5 couches de microbilles et les neurones (Figure 4). Une fois que toutes les couches sont formées, le réseau 3D doit être rempli à nouveau avec une goutte de 300 pl de milieu (figure 3E). A ce stade, les réseaux 3D couplés à des AME peuvent être stockés dans l'incubateur pendant 48 heures. Après cela, 1 ml de milieu est ajouté pour remplir l'anneau de la MEA (figure 3F).

Une fois que toutes les couches ont été assemblées, les neurites se développent sur ​​l'échafaudage de microbilles atteindre une densité cellulaire finale d'environ 80 000 cellules / mm 3. Il est intéressant de noticING, qui la valeur obtenue est pas loin de 92.000 cellules / mm 3, la densité neuronale moyenne chez la souris cortex cérébral 14.

Figure 4 affiche trois exemples de réseaux 3D couplés à AME capturés au moyen de la microscopie confocale verticaux. Sur la figure 4A, le DIC (contraste interférentiel différentiel) image montre une seule couche de billes couplées à la surface du MEA; le microscope a été couplé avec 20,0 0,50 NA objectif de l'eau et les images ont été acquises avec PMT transmises inclus au microscope et un laser argon (488 nm de). Les images montrent très clairement la disposition spatiale des électrodes (points noirs) et l'organisation spatiale régulière des microbilles.

Sur la figure 4B, une coloration par immunofluorescence de la carte-2 (signal rouge) affiche la distribution de arborisations dendritiques et soma des neurones directement autour de microbilles couplées à l'électrode de plan de MEA (la présence des contacts noir peut être observée). La figure 4B est une projection maximale d'une séquence d'empilement Z- (108 pm) avec la taille de pas est égale à 1,53 um. Les images ont été acquises à l'objectif de 40,0 NA 0,80 de l'eau; l'excitation est de l'argon laser (488 nm), la largeur de bande d'émission de 496nm 655nm-.

Enfin, la figure 4C affiche la projection maximale d'une séquence z -stack (187,79 um) d'une culture de l'hippocampe 3D (taille d'étape est de 2,27 um). Le z -stack séquence a été acquis avec l'objectif de 25,0 NA 0,95 d'eau. Pour le canal vert, un 488nm laser Argon et une émission bande passante du filtre 499nm-551nm ont été utilisés. Pour le canal rouge, un laser 543 nm et une émission bande passante du filtre 555nm-645nm ont été utilisés. Les canaux ont été acquises en mode séquence. Un réseau fortement interconnecté émerge où les neurones sont étiquetés pour NeuN exprimé dans les neurones post-mitotiques matures (feu rouge) et pour Gaba (signal vert, yelfaible en fusion). Anticorps Gaba a révélé une positivité pour les neurones inhibiteurs à la fois dans le soma et neurites.

Figure 4
Figure 4. Trois exemples de réseaux 3D capturées par microscopie confocale. (A) DIC (contraste d'interférence différentiel) image montrant une seule couche de billes couplées à la surface de la MEA; la disposition spatiale des électrodes (points noirs) est observable. (B) la coloration par immunofluorescence de la carte-2 (signal rouge) affiche la distribution de arborisations dendritiques et soma des neurones autour de microbilles directement couplés au plan d'électrode de la MEA. ( C) maximum de la projection d'un z -stack séquence (187,79 um) d'une culture 3D affichant un réseau fortement interconnecté où les neurones sont étiquetés pour NeuN exprimé dans les neurones post-mitotiques matures (feu rouge) et pour Gaba (signal vert, jaune en fusion ). Gaba anticorps revealed une positivité pour les neurones inhibiteurs à la fois dans le soma et neurites. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Pour comprendre si la présence d'une structure 3D module la dynamique du réseau, l'activité électrophysiologique ainsi généré a été comparé à des réseaux neuronaux 2D classiques cultivés sur les AME, qui représentent le modèle de référence.

Figure 5
Figure 5. Comparaison entre la dynamique de réseau présentés par 3D (colonne de gauche) et 2D (colonne de droite) des cultures hippocampiques A chaque échelle de temps (A: 1200 s, B: 300 s; C: 60 sec; D: 10 sec)., assemblages 3D affichent une variété de signatures d'activité (par exemple, courtes et longues rafales de réseau, dopage aléatoireactivité, rafales synchronisées), tandis que ceux en 2D affichent une activité stéréotypée plus prononcée avec des éclats seulement haute synchronisés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La figure 5 montre deux parcelles de trame de deux expériences représentatives effectuées sur un 3D (panneaux de gauche) et 2D (panneaux à droite) la culture de l'hippocampe au cours de la quatrième semaine in vitro. Ces courbes montrent l'activité électrique du réseau enregistrée sur toutes les électrodes actives (ie., Électrodes avec une cadence de tir supérieure à 0,1 pointes / s).

La dynamique des réseaux 2D afficher une activité quasi-synchrone composée principalement de rafales de réseau. La signature de cette dynamique est la présence d'événements synchronisés qui impliquent la plupart des canaux d'enregistrement entrecoupées de période où presque aucune activité est enregistrée (voir le panneau droit deFigure 5D). Ce comportement peut être apprécié à différentes échelles de temps, que les différents niveaux de grossissement de soulignement.

Dans le cas d'un réseau 3D, la signature de la dynamique de réseau est constitué d'un plus large répertoire d'activités caractérisé par: (i) de synchronie moins global, (ii) l'activité de dopage plus aléatoire, (iii) les périodes au cours desquelles les sous-réseaux (c.-à- , un sous-ensemble de microélectrodes) présentent une activité plus synchrone avec l'apparition de paquets de réseau. En outre, la durée des salves de réseau est plus variable ainsi: il y a la présence de rafales de réseau d'une durée similaire à celle observée dans les réseaux 2D, mais il existe également de plus longues salves du réseau. Une caractérisation complète et quantitative de la dynamique émergente 3D obtenue en utilisant une de ces méthodes peut être trouvée dans 16. Comme prévu, les expositions de réseaux neuronaux 3D aussi un 'de dopage aléatoire «significatif et non synchrone un éclatementctivité. La plausibilité de la dynamique générée par ces structures 3D ont été vérifiés avec des contrôle-expériences (par exemple, la présence d'un réseau de 2D couplée à un MEA avec une pile de microbilles nus et des réseaux 3D assemblés sur les microbilles avec une MEA nue), comme rapportée dans 16.

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Discussion

Dans ce travail, un roman expérimental dans la plateforme vitro constitué de 3D ​​conçu cultures de neurones couplés à AME pour électrophysiologie de réseau a été présenté. L'utilisation des microbilles comme échafaudage pour permettre au long de l'excroissance neuritique axe des z a été adapté pour être intégré avec le MEA plane. De cette façon, les résultats micro-système obtenus dans un modèle in vitro 3D valide et fiable pour étudier la dynamique électrophysiologiques émergents 16.

MEA enregistrement set-up

MEA dispositifs sont constitués d'une chambre de culture avec un réseau intégré de micro-électrodes de substrat enrobé capables de mesurer des signaux extracellulaires à partir de tissus de l'électro-actif. Les signaux enregistrés sont constitués de pointes typiques (par exemple, seul supra-seuil de variation de tension représentant l'activité électrique d'un ou plusieurs neurones) et rafales (par exemple, une séquence de pics très souvent emballés occurring simultanément sur plusieurs canaux). Les enregistrements de l'activité des réseaux de neurones avec des systèmes basés AME produisent énorme quantité de données (par exemple, une expérience de 4 heures avec une MEA 60 canaux produit un record d'environ 15 Go). Cela implique la nécessité de disposer d'outils efficaces pour traiter et analyser les données, en particulier dans le cas des études qui nécessitent de longs enregistrements. En général, l'enregistrement des signaux électrophysiologiques est obtenu par une transduction extracellulaire direct avec les cultures neuronales, et l'acquisition d'un signal de tension. Après un étage d'amplification et de filtrage, des signaux sont échantillonnés et stockés 10 à 50 kHz. Les signaux bruts sont alors crête détectée par un outil logiciel personnalisé développé. Le système d'enregistrement est composée de (1) amplificateur de MEA, (2) un ordinateur personnel équipé d'A / D carte d'acquisition, (3) le logiciel d'enregistrement, (d) le système de chauffage et le régulateur de température, (4) CO2 atmosphère maintien et l'évaporation de prévention systèmes.

Laconstruction du réseau neuronal 3D passe par deux étapes essentielles: la première est la distribution de la quantité correcte de perles sur les plaques multi-puits avec surface de l'insert de membrane, la seconde est le transfert de la suspension de microbilles avec les neurones adhérentes du multipuits plaques avec insert de membrane à: (i) le réseau neuronal 2D étalées sur la surface active de la MEA (première couche); (ii) les couches déjà installés. Cette opération doit être répétée autant de fois que le nombre de couches requises. Pendant la première semaine de la culture, une croissance rapide des extensions neuritiques prend place autour des microbilles appartenant à différentes couches. Le lien étroit entre les neurones et les microbilles stabilise les échantillons biologiques et permettent de le déplacer de l'incubateur de changer / remplacer le milieu et d'enregistrer avec l'amplificateur de MEA l'activité électrique sans se soucier de l'endommager.

Puisque l'activité électrophysiologique de l'ensemble du nettravail est enregistrée uniquement à partir de la couche inférieure (à savoir, celui qui est directement couplé à la MEA), la zone active doit être couvert par un réseau 2D classique. Les autres couches seront ajoutés étape par étape au cours de la 2D un, et les connexions à longue portée seront répartis entre les couches. Pratiquement, les autres couches sont ajoutées 6-8 heures plus tard que la 2D en déposant un mélange de neurones et les microbilles. Le choix de cette fenêtre temporelle permet la formation de quelques connexions synaptiques dans la couche en 2D, et garantit la possibilité d'établir des connexions vers les couches supérieures aussi.

Deux facteurs rendent l'utilisation de plaques multipuits avec membrane insérer nécessaire, pour réaliser les réseaux 3D: (i) depuis les neurones et les microbilles présentent des vitesses de sédimentation différentes, l'utilisation de plaques multipuits avec insert de membrane garantit une répartition uniforme des neurones sur la partie supérieure des microbilles : en moyenne, chaque microbille peut être entourée par le même nombre de neurones. (ii) By exploitant les propriétés élastiques des plaques multipuits avec insert de membrane, le lavage de la solution de microbilles couplées à des neurones est plus facile d'utiliser des surfaces solides comme des multi-puits polycarbonate.

Le travail présenté suit l'approche proposée par Pautot et ses collaborateurs 15: dans cette étude l'utilisation de billes de silice fourni une surface assez grande pour les corps cellulaires neuronaux à respecter et pour leurs processus pour grandir, mûrir et produire des spécialisations pré- et post-synaptiques croissance . Une alternative valable à l'utilisation de billes échafaudage vient d'hydrogels matrices ou bioactif et des billes biodégradables composés de biopolymère naturel comme le chitosan. La chitine désacétylée et de ses dérivés, le chitosane, sont non toxiques, antibactérien, biocompatible et biopolymères biodégradables. La constante de temps de tels processus de biodégradation est compatible avec le réseau Outgrow 20,21.

Cette étude peut constituer un wor de référencek pour le développement futur des systèmes de modèle neuronal 3D de pointe pour étudier systématiquement l'interaction entre la dynamique des réseaux et de la structure. En peu de temps, nous espérons être en mesure de transférer la construction du réseau 3D sur une nouvelle génération de dispositifs 22. La technique de fabrication consiste en la production d'électrodes sous la forme de micro-piliers dans une hauteur variable comprise entre 50 et 350 um.

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Acknowledgments

Les auteurs remercient Giorgio Carlini pour le soutien technique dans l'élaboration de la structure de confinement et Dott. Ornella LoBrutto pour la révision approfondie du manuscrit. La recherche menant à ces résultats a reçu un financement de 7 ème programme-cadre de l'Union européenne (TIC-FET FP7 / 2007-2013, FET Jeunes Explorateurs régime) sous convention de subvention 284772 CERVEAU BOW (www.brainbowproject.eu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminin Sigma-Aldrich L2020 0.05 µg/ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 0.05 µg/ml
Trypsin Gibco 25050-014 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase Sigma-Aldrich D5025 0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal Gibco Invitrogen 21103049 culture medium
B27 Gibco Invitrogen 17504044 2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-2442 10%
Glutamax-I  Gibco 35050038 0.5 mM
gentamicin Sigma-Aldrich G.1272 5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) Corning Sigma 481939 curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays Multi Channel Systems (MCS) 60MEA200/30-Ti-pr MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead Distrilab-Duke Scientific 9040  1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
Transwell Costar Sigma CLS 3413 multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++  Gibco Invitrogen 14175-052
Hanks Buffer Solution  Sigma  H8264
Teflon Sigma 430935-5G polytetrafluoroethylene
Rat Sprague Dawley Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright Leica TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
40.0x0.80 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
25.0x0.95 WATER objective Leica HCX IRAPO L

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References

  1. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
  2. Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
  3. Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
  4. Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
  5. Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
  6. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
  7. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
  8. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
  9. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
  10. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
  11. Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
  12. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
  13. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
  14. Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
  15. Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
  16. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
  17. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
  18. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
  19. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
  20. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
  21. Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
  22. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).

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Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model. J. Vis. Exp. (104), e53080, doi:10.3791/53080 (2015).

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