Introduction
In vitro zweidimensionale (2D) neuronale Netze zu Micro-Elektroden-Arrays (MEAs) gekoppelt arethe Goldstandard angenommen, um das Zusammenspiel von neuronaler Dynamik und der zugrunde liegenden Konnektivität studieren experimentellen Modell. Bei der Entwicklung, Nervenzellen neu zu komplexen Netzwerken, die auch angezeigt werden definedspatio-temporalpatternsof Tätigkeit 1,2 (dh platzt, Netzwerk-Bursts, zufällige spiking Aktivität). MEAs erfassen die elektrophysiologische Aktivität von vielen Websites (von zehn bis Tausende von Mikroelektroden), so dass eine detaillierte Untersuchung der Dynamik zum Ausdruck auf Netzwerkebene. Darüber hinaus ist die Verwendung von dissoziierten Kulturen macht possibile, um technisch-Netzwerke zu entwerfen. Es ist einfacher, auf diese Weise zu verstehen, die funktionalen Beziehungen zwischen dem aufgezeichneten elektrophysiologische Aktivität und die Parameter der Netzwerkorganisation, wie Zelldichte 3 Grad an Modularität 4,5, Gegenwart heterogener neuronalen populations 6 usw. Aber alle in vitro-Studien auf distanzierte kultivierten Zellen werden auf 2D neuronale Netze. Dieser Ansatz führt zu Vereinfachungen in Bezug auf die in vivo (eigen 3-dimensional, 3D-System): (i) in einem 2D-Modell, Somata und Wachstumskegeln sind abgeflacht und die Axone-Dendriten Auswuchs kann nicht in allen Richtungen 7 verbreiten. (ii) 2D-in-vitro-Netzwerke weisen stereoelektrophysiologischen Dynamik durch Platzen Tätigkeit, die die meisten Neuronen des Netzes 8 dominiert.
In jüngster Zeit verschiedene Lösungen entwickelt worden, um die Konstruktion von in-vitro-3D dissoziierten neuronalen Netzen zu ermöglichen. Die gemeinsame Idee besteht in der Schaffung eines Gerüsts, wo Nervenzellen können in einer 3D-Mode wachsen. Ein solches Gerüst kann mit Polymer-Gelen und festen porösen Matrizen 9-13 realisiert werden. Durch Ausnutzung der mechanischen Eigenschaften der Polymere ist es möglich, Zellen in thes einbettene Strukturen durch einen einheitlichen Block von 3D-Kulturen von Neurosphären 11 definieren. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die starre mechanische Eigenschaft der Neurosphären 9,12. Jedoch haben diese Materialien beschränkt Porosität, und sie garantieren nicht die Zellmigration in der Matrix. Um diesen Nachteil zu überwinden, ist eine mögliche Lösung besteht im Trennen der Matrix in "Einheit" Modulen. Leider konnte die Größe und Form der Partikel Vielfalt Packung in regulären Schichtstrukturen zu behindern. In 7, Cullen und Mitarbeiter entwickelt einen 3D-neuronalen Konstrukt up von Neuronen und / oder Astrozyten innerhalb eines bioaktiven extrazellulären Matrix-basierten Gerüst gemacht. Eine solche konstruiert Nervengewebe in vitro Untersuchungen erlaubt, zu studieren und zu manipulieren neurobiologischen Reaktionen innerhalb von 3D-Mikro-Umgebungen. Dieses Modell besteht aus Neuronen und Gliazellen im gesamten extrazellulären Matrix (ECM) und / oder Hydrogel Gerüste (500-600 & mgr; m dick) verteilt. In dieser Co5000 Zellen / mm 3 - ndition eine optimale Zelllebensfähigkeit (mehr als 90%) wurde durch Ausplattieren Zellen bei einer endgültigen Dichte von ungefähr 3,750 gefunden. Es ist zu beachten, dass eine solche Dichtewert ist viel niedriger als die in der in-vivo-Zustand, in dem die Zelldichte der Maus Hirnrinde als etwa 90000 Zellen / mm 3 14 werden. Um diese Einschränkung zu überwinden und Mitarbeiter Pautot 15 realisiert ein 3D in vitro System, in dem die Zelldichte und die Netzwerkverbindung gesteuert werden, um in vivo-Bedingungen ähnlich und ermöglichen eine Echtzeitabbildung des Netzwerks. In der Praxis wird diese Methode auf dem Konzept, das dissoziiert kultivierten Neuronen können auf Siliciumdioxid-Mikroperlen wachsen basiert. Diese Kügelchen eine Wachstumsoberfläche groß genug für neuronalen Zellkörpern zu haften und ihre Verzweigungen zu wachsen, reifen, zu erweitern und zu definieren synaptische Kontakte zu anderen Neuronen. Diese Methode nutzt die spontane Versammlung Eigenschaften von monodispersen Perlen form 3D-Schichten-hexagonalen Arrays mit verschiedenen Untergruppen von Neuronen auf verschiedenen Ebenen mit eingeschränkter Konnektivität zwischen Nervenzellen auf verschiedenen Perlen. Die erzielte Zelldichte bei diesem Verfahren betrug etwa 75.000 Zellen / mm 3.
Vor kurzem haben wir Pautot Methode angepasst MEAs 16: Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die 3D-elektrophysiologische Aktivität stellt einen größeren Repertoire von Aktivitäten als die von 2D-Netze ausgedrückt. 3D reife Kulturen weisen eine verbesserte Dynamik in der sowohl Netzwerk-Burst und zufällige Spike-Aktivität koexistieren. Ähnlich Tang-Schomer und Mitarbeiter 17 realisiert eine Seidenproteinbasis poröse Gerüst, das eine primäre kortikale Kultur in vitro für einige Monate beibehält, und nahm die elektrophysiologische Aktivität mittels einer Wolfram-Elektrode.
In dieser Arbeit wurden die experimentellen Verfahren, um 3D-neuronalen Netzen, um MEAs gekoppelt bauen beschrieben.
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Protocol
Das experimentelle Protokoll wurde von der Europäischen Animal Care Gesetzgebung (2010/63 / EU), von der italienischen Gesundheitsministerium in Übereinstimmung mit dem DL 116/1992 von den Richtlinien der Universität Genua (Prot genehmigt. N. 13130, Mai 2011). Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Zahl der Tiere, für das Projekt zu reduzieren und ihr Leiden zu minimieren.
1. Herstellung von Materialien und Unterstützungen
- Konstruieren Sie die Form, um die PDMS (Poly-Dimethyl-Siloxan) Einschränkung mit Hilfe einer CNC (Computer Numerical Control) Fräsmaschine zu bauen. Eine solche Form ist aus Polycarbonat mit dem zentralen Zylinder in Polytetrafluorethylen (PTFE) realisiert. Dieses Material ermöglicht eine einfachere Entnahme der Maske, sobald das PDMS ausgehärtet ist.
HINWEIS: Das Design der Form wurde von Computer-Aided-Design (CAD) durchgeführt und dann an die CNC-Fräsmaschine ausgeliefert. - Bereiten Sie die PDMS-Elastomer. PDMS ist ein organisches Polymer. Er besteht aus zwei Elementen zusammengesetzt istEin Härtungsmittel und ein Polymer. Mischen sie von einem Volumenverhältnis von 1:10, wobei ein Teil des Härtungsmittels und neun Teile Polymer. Setzen Sie die beiden Komponenten in einer Petrischale, schütteln und legen Sie die Mischung in der Vakuumkammer für 10 Minuten, um Luftblasen zu beseitigen. 3 g PDMS ausreichend sind für eine Einschränkung.
- Konstruieren Sie die PDMS-Einschränkung. Legen Sie die PDMS-Material in den Formgeber und legen Sie sie in den Ofen für 30 Minuten bei 120 ° C. Die PDMS-Einschränkung die Form eines idealen Zylinders mit einem äußeren und inneren Durchmesser von 22,0 und 3,0 mm betragen und einer Höhe von 650 um.
- Am Tag vor dem Plattieren Paar der Maske auf den aktiven Bereich der Mikroelektrodenanordnungen (MEAs) mittels einer Pinzette unter einem Stereomikroskop und Sterilisieren der PDMS-Maske in einem Ofen bei 120 ° C.
- Sterilisation der Mikroglaskugeln (Nenndurchmesser von 40 ± 2 um; zertifiziert mittleren Durchmesser von 42,3 ± 1,1 & mgr; m) in 70% Ethanol für 2 h in einem konischen Röhrchen und drehen every 30 Minuten, um alle Mikrokügelchen freizulegen.
- Entfernen Sie die Ethanol-Lösung aus dem Fläschchen und spülen Sie die Mikroperlen zweimal mit sterilem Wasser.
- Konditionieren des zentralen Teils der MEA Bereich begrenzt durch die PDMS Maske (Durchmesser gleich 3,0 mm) mit 24 & mgr; l der gemischten Lösung von Poly-D-Lysin und Laminin bei 0,05 ug / ml.
- Beschichtung der Mikrokügelchen mit Adhäsionsproteine, Laminin und Poly-D-Lysin bei 0,05 ug / ml und lassen Sie sie über Nacht in den Inkubator bei 37 ° C, um eine stabile und langanhaltende neuronale Netz zu erhalten.
- Entfernen der Haftfaktoren sowohl von der Glasoberfläche der MEA und den Mikroglaskugeln. Aspirat etwa 95% der Beschichtungslösung mit einer Pipette und eine kleine Volumen- 24μl- sterilem Wasser auf der Oberfläche MEA. Saugen Sie wieder mehr als 95% des Wassers und lassen Sie die MEA trocken unter der laminaren Haube 1 Stunde vor dem Ausplattieren der Zellen.
HINWEIS: Im Fall von Mikrokügelchen statt absaugen BeschichtungLösung und eine erste Wäsche mit sterilisiertem Wasser und ein zweiter mit dem Grundmedium und seine Ergänzung wie B27, um die Glasoberfläche, wo Neuronen plattierenden konditionieren. Lassen Sie sich nicht die Mikroperlen trocken. Lassen sie in Suspension in dem Kulturmedium im Inneren der Ampulle. - Verteilen, mittels einer Pipette -200 μl- die Suspension der behandelten Mikrokügelchen (ca. 32.000) auf einer Multiwellplatte mit Membraneinsatz (Porendurchmesser 0,4 um), wo sie selbstorganisieren Bildung einer gleichförmigen Schicht.
- Füllen Sie jede auch der Membran mit 0,5 ml Medium, und steckte es in den Inkubator (T = 37,0 o C, CO 2 = 5%), bis die Neuronen sind bereit, plattiert werden (3.2).
2. Dissection von Embryonen und Dissoziation von Tissue
- Haus erwachsene weibliche Ratten (200-250 g) bei einer konstanten Temperatur (22 ± 1 ° C) und die relative Luftfeuchtigkeit (50%) im Rahmen eines regelmäßigen Hell-Dunkel-Zeitplan (licht auf 7.00 Uhr bis 19.00 Uhr) in derTierhaltung. Stellen Sie sicher, dass Lebensmittel und Wasser sind frei verfügbar.
- Anesthetize eine schwangere weibliche Ratten nach 18 Tagen Entwicklung (E18) unter Verwendung von 3% Isofluran. Dann, zu opfern das Tier durch Genickbruch.
- Entfernen hippocampi voneinander Rattenembryo und legen Sie sie in eiskaltes Hanks ausgewogener Salzlösung ohne Ca 2+ und Mg 2+. An Tag 18 der Entwicklung Hippocampus und Cortex Geweben sind sehr weich und müssen nicht in kleine Stücke geschnitten werden. Weitere Details können gefunden 18,19 werden.
- Dissoziation des Gewebes in 0,125% Trypsin / Hanks-Lösung, die 0,05% DNAse für 18-20 min bei 37 ° C.
- Entfernen der überstehenden Lösung mit einer Pasteurpipette und Stoppen der enzymatischen Verdau durch Zugabe von Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) für 5 min.
- Entfernen Sie das Medium mit FBS und einmal mit dem Medium mit seiner zu ergänzen, zu 1% L-Glutamin, Gentamycin 10 ug / ml zu waschen. Entfernen Sie wieder das Medium mit einer Pasteur-pipette und füllen es wieder mit einer kleinen Menge (500 ul) des Wachstumsmediums mit seiner Ergänzung, 1% L-Glutamin, Gentamycin 10 ug / ml.
- Dissoziieren die Gewebepellet mechanisch mit einem schmalen Pasteurpipette bis eine milchige Suspension von Zellen ist offensichtlich. Es ist nicht notwendig, die Zellsuspension zentrifugiert.
- Verdünnen des geringen Volumens der Zellsuspension mit dem Wachstumsmedium, um ein Endvolumen von 2,0 ml zu erhalten. Zählen Sie die erhaltenen Zellkonzentration mit einem Hämocytometer Kammer. Verdünnte diese Konzentration in einer 1: 5, um die gewünschte Zellkonzentration von 600-700 Zellen / & mgr; l zu erhalten.
3. Zell Plating
- Platten Zellen in einer Dichte von etwa 2000 Zellen / mm 2 auf die aktive Fläche der MEA von der PDMS Einschränkung definiert, um eine 2D neuronalen Netzwerks.
Hinweis: Jeder Hippocampus etwa 5 x 10 5 Zellen enthält, (1 x 10 6 für einen einzigen Embryo). Sezieren 6 Embryonen auf einen Gesamtbetrag von 6 x 10 bekommen6 Zellen in 2 ml, und einer geschätzten Konzentration von 3.000 Zellen / & mgr; l. Verdünnen Sie diese Konzentration bei 1: 5, um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten und die Platte ca. 600-700 Zellen / ul. Wenn die MEA Bereich durch die PDMS-Einschränkung begrenzt ist etwa 7.065 mm 2, und die Gesamtzahl der plattierten Zellen 600 Zellen / ul x 24 & mgr; l = 14.400 Zellen, die endgültige Dichte 2.038 Zellen / mm 2. - Platzieren der MEA Vorrichtungen in den Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre CO 2 (5%) bei 37 ° C.
- Verteilen 160 ul der Suspension mit einer Zellkonzentration von 600-700 Zellen / ul (etwa 100.000 Zellen) auf die Oberfläche der Monoschicht Mikrokugeln im Inneren der Multiwell-Platten angeordnet, um die Vorstufe für den Aufbau von dreidimensionalen Kultur abzuschließen. Setzen die Multiwell-Platten im Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre CO 2 (5%) bei 37 ° C.
4. 3D-Neuronal Network Construction
- 6-8 Stunden nach der Plattierung, übertragen Sie die Suspension (Mikroperlen mit Neuronen) von den Multiwell-Platten sehr sorgfältig in den durch die PDMS-Einschränkung begrenzt durch die mit einer Pipette für ein Volumen von etwa 30-40 & mgr; l eingestellt. Nach jeder Übertragung, warten Sie etwa eine halbe Minute, um die Mikroperlen zur Selbstorganisation in einem sechseckigen kompakten Aufbau zu ermöglichen.
- Nachdem alle Schichten abgeschieden werden und sich spontan zusammengebaut, füllen Sie mit einem großen Tropfen von etwa 300 ul Medium die Spitze des von der PDMS-Einschränkung begrenzt.
- Setzen die 3D-Struktur an die MEA gekoppelt im Inkubator (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) für 48 Stunden, bevor eine endgültige Volumen (etwa 1 ml) des Wachstumsmediums Kultur mit Ergänzung.
HINWEIS: Beachten Sie die Gesamtzahl der Perlen auf der Multiwell-Platten mit Membraneinsatz (30.000) und die Anzahl der Perlen auf einer einzigen Schicht auf die MEA-Gerät (6000). Die resultierende 3D-Struktur besteht aus 5 Schichten zusammengesetzt microbeads und Zellen. Unter Berücksichtigung, dass die 3D neuronalen Netzwerk nicht geometrisch vollkommen, könnte das resultierende 3D-Struktur von 5-8 Schichten bestehen. - Am Tag nach der Beschichtung, sorgfältig fügen Sie das endgültige Volumen des Mediums (etwa 900 ul) in der MEA-Ring. Aufrechterhaltung der 3D-Kulturen in einem befeuchteten CO 2 -Atmosphäre (5%) bei 37 ° C für 4-5 Wochen. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums einmal pro Woche.
5. konfokale Mikroskopie Acquisition
- Fixierung der biologischen Proben auf der Bühne des Mikroskops in einer Halterung. Stellen Sie den Laser (Argon, 496 bis 555 nm), der Abtastgeschwindigkeit (400 Hz), bei dem, um das Bild, das Gain und Offset (-0,3%) der PMT für jedes Bild zu erwerben, um die richtige Bandbreite Emissionsfilter und um zu erfassen um eine Sättigung zu vermeiden und um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Ergebnisteil meldet die verwendet werden, um die Bilder von 4 zu erwerben Werte.
- Für den Erwerb der z -stack Sequenz, Tannest wählen, den Wert der z-Position der oberen und der unteren Schicht der Probe, und wählen Sie dann die Schrittweite auf die Übernahme vorzunehmen.
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Representative Results
. In diesem experimentellen Verfahren wird eine relevante Rolle der Mikrokügelchen, die die mechanische Gerüst für das Wachstum des 3D neuronales Netzwerk definieren gespielt 1A und B-Anzeige, die die Anordnung der Mikrokügelchen (Nenndurchmesser von 40 ± 2 um; zertifiziert mittlere Durchmesser 42,3 ± 1,1 & mgr; m) in der Ebene. Die Besonderheit solcher Strukturen besteht darin, daß Mikrokügelchen spontan selbst zusammensetzen, die einen kompakten hexagonalen Geometrie (1B und C). Das so erzeugte Gerüst gewährleistet eine konsistente Wachstumsoberfläche für Neuriten und ausreichend großer Zwischenraum für den Stoffaustausch von den Zellkörpern. Diese Mikrokügelchen Dimension erweist sich als ein vernünftiger Kompromiss für die interstitielle Abstände und endgültigen neuronalen Dichte. Bedenkt, dass die PDMS Struktur nachbildet eine "ideale" Zylinder und da die kompakte Wölbstruktur Stoßfaktor (HPF) gleich 0,74, die maximale Anzahl der Kugeln (Durchmesser von 4081; m) innerhalb des PDMS-Integritäts ist etwa 100.000, welches bis etwa 6000 Mikroperlen pro jeder Schicht entspricht. Entsprechend dem Protokoll Abschnitt erläutert wurde, sind diese Mikrokugeln vorbehandelt mit Adhäsionsfaktoren (dh, Laminin und Poly-D-Lysin). Dieses Verfahren garantiert, dass Neuronen zu den Mikrokügelchen anhaften. 1D zeigt ein Beispiel, wo drei Neuronen sind mit einem Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 40 um verbunden.
Abbildung 1. Bilder der verwendet wird, um das Gerüst für das neuronale Netzwerk zu schaffen Mikroperlen. (A, B) Zwei Beispiele für Monoschichten aus Mikrokügelchen auf der Oberfläche einer Multiwellplatte mit Membraneinsatz. (C) Mikroperlen unter Gravitationskraft angesiedelt und spontan in 2D-hexagonalen Arrays zusammengesetzt. Wenn die erste Schicht voll gepackt, andere Perlen hinzugefügt werden, zu bauening eine zweite geordnete Schicht mit der gleichen hexagonalen Symmetrie. Weitere Zugabe von Mikrokügelchen führte zur Konstruktion einer 3D-Baugruppe verpackt. Der Freiraum zwischen den Mikrokügelchen wird durch neuronale Prozesse und Zellkörpern gefüllt. (D) Drei Neuronen sind auf der Oberfläche eines einzelnen Mikrokügelchen verankert, die zuvor mit Haftfaktoren (Laminin und Poly-D-Lysin) konditioniert. Bitte klicken Sie hier, um zu sehen eine größere Version dieser Figur.
Die Anbindung der Mikrokügelchen und Neuronen mit der aktiven Fläche der MEA infolge eines elastomeren Bedingung (2C), wobei der in den 2A und B dargestellte Form realisiert ist. 2A zeigt die Gestaltung und die gewählten Abmessungen. Die aktive Fläche der MEA wird durch Koppeln des PDMS Struktur 2C an die MEA Substrat (2D abgegrenzt). Auf diese Weise werden Neuronen, gezwungen, in die aktive Fläche der MEA zu haften. Anschließend wird die Glasmikrokugel Stapel mit anhaftenden Neuronen auf dieser ersten Schicht untergebracht werden. 2D zeigt einen Querschnitt der Endform, wobei die Rolle des PDMS Struktur eindeutig erkannt werden. Der von dem PDMS-Struktur begrenzt enthält die Mischung von Mikroperlen und Neuronen (weißes Pulver in der Bodenplatte 2D). Die PDMS-Struktur hat die Form eines Zylinders mit der in 2B mit den folgenden Dimensionen dargestellten Form aufgebaut: Außen- und Innendurchmesser von 22,0 und 3,0 mm und einer Höhe von jeweils 650 & mgr; m. Die Form wurde unter Verwendung von Polycarbonat und PTFE, die einer ideal glatten und widerstandsfähigen Material, um die Extraktion des elastomeren Maske.Der PDMS Einschränkungen zeigen eine kürzere Lebensdauer zu erleichtern gebaut, da die klebrigen Eigenschaften des PDMS Abnahme nach jedem Gebrauch. Typischerweise Jeweils PDMS Struktur dreimal erfolgreich verwendet werden.
Abbildung 2. Materialien für den Aufbau der 3D-neuronales Netz. (A) Entwurf und (B) Bild der verwendet wird, um die physische Einschränkung erstellen Form. Die Grau 3 mm Durchmesser Zylinder entspricht das Loch des in (C) dargestellt Einschränkung. (C) PDMS Einschränkung für den aktiven Bereich eines Mikroelektrodenarray (MEA) angeordnet ist. Die Verwendung von solchen physikalischen Barriere ermöglicht es, die Mikrokugeln in einem Zielbereich enthalten (etwa 7 mm 2) und die Entwicklung des 3D-Netzwerk einzuschränken. (D) Querschnitt der MEA System und Einschränkung. Microbeads (durch das Mikroskop in der oberen rechten Ecke dargestellt) in dem von dem PDMS-Einschränkung (unteres Feld) begrenzt gefüllt.080fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Nach der Entbindung der aktiven Fläche der MEA durch die PDMS Maske, fährt das Protokoll, wie in den Tafeln von Figur 3 dargestellt ist, beschreibt die Hauptschritte, um die Anordnung der Neuronen und Mikrokügelchen zu realisieren.
Der erste Schritt besteht in der vorläufigen Überzug dissoziierten Neuronen auf die MEA Oberfläche, die zuvor mit der Adhäsionsmoleküle Laminin und Poly-D-Lysin (3A) vorbeschichtet wurde. Es ist wesentlich, dass die 2D-neuronales Netzwerk wird direkt auf dem aktiven Bereich der MEA: Nur unter diesen Bedingungen ist die Erfassung von elektrophysiologischen Signalen (dh Spikes und Bursts) durchführbar ist. Dieser erste Teil des Protokolls entspricht dem Standardverfahren verwendet werden, um 2D-Neuronen zu plattieren. Der tatsächliche Aufbau des 3D-System ist in den Figuren 3B, C und D dargestellt (3B) angeordnet ist; Danach wird ein 160 ul-Suspension mit einer Zellkonzentration von 600-700 Zellen / ul (etwa 100.000 Zellen) auf die Mikrokügelchen-Monoschicht (3C) verteilt sind. In Anbetracht, dass Zellen die Hälfte des Wulstbereichs schlafen und die gesamte freie Oberfläche beträgt 75 mm 2. Die Zelldichte auf die Monoschicht Mikrokugeln beträgt etwa 1500 Zellen / mm 2. Die verwendeten Mikrotiterplatten mit Membraneinsatzes stellen eine poröse Membran mit einer Oberfläche von 33,6 mm 2. Durch Betrachtung einer virtuellen zylindrischen Form mit einer Grundfläche gleich der porösen Membranoberfläche und einer Höhe von 40 & mgr; m (Partikeldurchmesser), wird eine gleichförmige Schicht von 30.000 Mikrokügelchen zusammengesetzt, um die Multiwell-Platten mit Membraneinsatzes verbunden ist. Die so realisierten Suspension von Mikrokügelchen und Neuronen bleibt für ca. 6-8 Stunden im Inneren der Multiwell-Platten mit Membraneinlage. Einmaldie oben genannten Schritte abgeschlossen sind, kann die Konstruktion des 3D-Netzwerk zu beginnen. Zu diesem Zeitpunkt wird das Gemisch aus Nervenzellen und Mikrokügelchen aus den Multiwellplatten mit Folieneinlage entfernt und auf dem 2D neuronale Netz zuvor auf die von der PDMS Bedingung (3D) definierten Fläche plattiert platziert. Während dieses Verfahrens tritt ein Verlust von etwa 20-30% der Neuronen aufgrund von (i) mechanische Manipulationen und (ii) für die Übertragung außerhalb der Membran. Durch Berücksichtigung der Grundfläche der Nebenbedingung (7,06 mm 2) und einer Höhe von 178,56 & mgr; m (5 Schichten von Kugeln), und indem die Anzahl der Zellen, die durch das Volumen des idealen Zylinders durch die 5 Schichten von Perlen gebildet ist, die sich ergebende 3D- neuronale Netzwerkzellendichte beträgt 80.000 Zellen / mm 3.
Abbildung 3. Skizze der grundlegenden Schritte, um 2D- und 3D-neuronaler Netzwerke zu erstellen. (A) Plating of Neuronen auf der aktiven Fläche der MEA. Die Aussetzung der Neuronen auf die MEA Oberfläche überzogen, die vorher mit Adhäsionsfaktoren konditioniert und durch die PDMS-Einschränkung begrenzt. Dieser Schritt ermöglicht es, zu verwirklichen: i) eine klassische 2D neuronale Netzwerk MEA verbunden ist; ii) die erste Schicht aus einem 3D-Netz, aus dem die elektrophysiologische Aktivität wird aufgezeichnet. (B) Mikrokügelchen, und (C) Neuronen werden auf die Oberfläche der Multiwell-Platten mit Membraneinsatzes nach 6-8 h geliefert. (D) die Suspension von Neuronen und Mikroperlen aus den Multiwell-Platten mit Membraneinsatz in den 2D-Netzwerk bewegt. Die Wiederholung dieses Schrittes mehrere Zeiten ermöglicht eine dichte mehrschichtige 3D-Struktur zu definieren. (E), wenn die 3D-Struktur abgeschlossen ist, wird ein Tropfen des Mediums zugegeben, und die resultierende Struktur ist in den Inkubator für 48 h gelagert. (F ) Nach 48 Stunden wird das 3D Kultur völlig mit dem endgültigen Volumen des Mediums gefüllt.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Wenn die erste Schicht positioniert worden ist, wird derselbe Vorgang wiederholt, um eine gepackte 3D Ensemble zu erhalten. Die resultierende 3D-Struktur organisiert sich die eine Kolloidkristall, dass Selbstorganisation in einer kompakten Struktur aus etwa 5-8 Lagen von Mikroperlen und Neuronen (Abbildung 4) vorgenommen. Sobald alle Schichten gebildet sind, weist der 3D-Netzwerk, mit einem Tropfen 300 ul Medium (3E) nachgefüllt werden. In diesem Stadium können 3D-Netzwerken gekoppelt MEAs in dem Inkubator für 48 Stunden gelagert werden. Danach wird 1 ml Medium zugegeben, um den Ring aus der MEA (3F) zu füllen.
Sobald alle Schichten zusammengefügt worden sind, Neuriten wachsen über die Mikrokügelchen Gerüst vor einer endgültigen Zelldichte von etwa 80.000 Zellen / mm 3. Es ist notic werting, dass der erhaltene Wert ist nicht weit von 92.000 Zellen / mm 3, die durchschnittliche neuronalen Dichte im Maushirn Cortex 14.
Abbildung 4 zeigt drei Beispiele von 3D-Netzwerke MEAs mittels Konfokalmikroskopie aufrechten erfasst gekoppelt. In 4A ist die DIC (Differential-Interferenz-Kontrast) Bild zeigt eine Einzelschicht aus Kügelchen an die MEA Fläche gekoppelt ist; Das Mikroskop war mit 20,0 NA 0,50 Wasser Ziel verbunden und die Bilder erworben wurden mit Transmitted PMT an das Mikroskop und Laser Argon (488 nm) enthalten. Die Bilder zeigen sehr deutlich die räumliche Anordnung der Elektroden (schwarze Punkte) und die regelmäßige räumliche Organisation der Mikrokügelchen.
In 4B eine Immunfluoreszenzfärbung für Map-2 (Rot-Signal) zeigt die Verteilung der dendritischen Verzweigungen und somata der Neuronen herum Mikrobeads direkt auf der Elektrodenebene ME gekoppeltA (das Vorhandensein der schwarzen Kontakte beobachtet werden kann). 4B ist eine maximale Projektion eines z- Stapelfolge (108 um) mit der Schrittweite ist gleich 1,53 um. Die Bilder wurden mit 40,0 NA 0.80 Wasser Ziel erworben; die Anregung Argon-Laser (488 nm), der Emissionsbandbreite 496nm-655nm.
Schließlich zeigt 4C die maximale Projektion eines z -stack Sequenz (187,79 & mgr; m) eines 3D-Hippocampus-Kultur (Schrittgröße 2,27 um). Die z -stack Sequenz wurde mit 25,0 NA 0,95 Wasser Ziel erworben. Für grünen Kanal, wurden einem Argon-Laser 488 nm und einer Emissionsfilterbandbreite 499nm-551 nm verwendet. Für Rot-Kanal wurde eine 543 nm-Laser und ein Emissionsfilterbandbreite 555nm-645nm verwendet. Die Kanäle wurden im Sequenzmodus erworben. Ein hochVerbundNetz austritt, wo Neuronen für NeuN markierte in reife post-mitotischen Neuronen (rote Signal) und für Gaba (grünes Signal, ausgedrückt yelniedrig in merge). Gaba-Antikörper ergab eine Positivität für hemmende Neurone sowohl in der Zellkörper und Neuriten.
Abbildung 4. Drei Beispiele von 3D-Netze durch konfokale Mikroskopie erfasst. (A) DIC (Differential-Interferenz-Kontrast) Bild, das eine einzelne Schicht aus Kügelchen auf der MEA Oberfläche gekoppelt ist; Die räumliche Anordnung der Elektroden (schwarze Punkte) zu beobachten ist. (B) Immunfluoreszenzfärbung für Map-2 (Rot-Signal) zeigt die Verteilung der dendritischen Verzweigungen und somata der Neuronen herum Mikrobeads direkt auf der Elektrodenebene der MEA verbunden ist. ( C) Maximale Projektion eines z -stack Sequenz (187,79 & mgr; m) eines 3D-Kultur Anzeigen einer hochgradig vernetzten Netzwerk, wo Neuronen für NeuN markierten ausgedrückt in reife post-mitotischen Neuronen (rote Signal) und für Gaba (grünes Signal, gelb in merge ). Gaba Antikörper revealed eine Positivität für hemmende Neurone sowohl in der Zellkörper und Neuriten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Um zu verstehen, ob die Anwesenheit einer 3D-Struktur moduliert die Netzwerk-Dynamik, wurde das so erzeugte elektrophysiologische Aktivität zu herkömmlichen 2D neuronalen Netzwerken über MEAs gezüchtet, die das Referenzmodell darstellen, verglichen.
Abbildung 5. Vergleich zwischen den Netzwerk-Dynamik von 3D (linke Spalte) und 2D (rechte Spalte) Hippocampus-Kulturen zeigten Bei jeder Zeitskala (A: 1.200 sec, B: 300 s; C: 60 s; D: 10 sec)., 3D-Baugruppen-Anzeige eine Vielzahl von Signaturen der Tätigkeit (dh kurz- und lang Netzwerk-Bursts, zufällige spikingAktivität synchronisiert Bursts), während diejenigen, 2D zeigen eine stärkere stereotypen Aktivität mit nur Hoch synchronisiert platzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5 zeigt zwei Rastergrundstücke von zwei repräsentativen Experimenten in der vierten Woche in vitro auf einem 3D (links Platten) und 2D (rechte Bilder) Hippocampus-Kultur durchgeführt. Diese Diagramme zeigen, die elektrische Aktivität des Netzwerks für alle aktiven Elektroden aufgezeichnet (dh., Elektroden mit einer Befeuerungsrate von mehr als 0,1 Spikes / s).
Die Dynamik der 2D-Netzwerke weisen eine quasi-synchrone Aktivität hauptsächlich von Netzwerk-Bursts zusammen. Die Unterzeichnung dieser Dynamik ist die Anwesenheit von synchronisierten Ereignisse, die die meisten der Aufzeichnungskanäle durch Zeitraum durchsetzt, in denen fast keine Aktivität aufgezeichnet beinhalten (siehe rechte PanelFigur 5D). Dieses Verhalten kann in unterschiedlichen Zeitskalen zu erkennen ist, wie die verschiedenen Ebenen der Vergrßerung zu unterstreichen.
Im Fall eines 3D-Netzwerk, die Signatur der Netzwerk-Dynamik aus einer größeren Repertoire von Aktivitäten, gekennzeichnet durch: (i) weniger globale Synchronisation, (ii) mehrere Zufallsspikeaktivität, (iii) Zeit, in der Sub-Netzwerke (dh eine Untergruppe von Mikroelektroden) stellen eine weitere synchrone Aktivität mit dem Auftreten des Netzwerk-Bursts. Weiterhin ist die Dauer der Netzwerkbursts variabler sowie: Es ist das Vorhandensein von Netz-Bursts mit einer Länge ähnlich zu der in den 2D-Netzwerke beobachtet, aber es gibt auch mehr Netzwerkbursts. Eine vollständige und quantitative Charakterisierung der emergent 3D Dynamik unter Verwendung eines solchen Verfahren erhalten wird, kann in 16 gefunden werden. Wie erwartet, werden die 3D-neuronales Netz zeigt auch eine signifikante "Zufalls spiking 'und nicht-synchronen Platzen activity. Die Plausibilität der von diesen 3D-Strukturen erzeugt Dynamik mit einigen Kontrollexperimenten (zB Gegenwart eines 2D-Netzwerks mit einem Stapel von nackten Mikrobeads und 3D-Netzwerke auf die Mikrokügelchen mit einem bloßen MEA zusammengebaut, um eine MEA gekoppelt) geprüft worden ist, wie in 16 angegeben.
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Discussion
In dieser Arbeit wird eine neuartige experimentelle in vitro-Plattform aus 3D gemacht entwickelt neuronalen Kulturen auf MEAs für Netzwerk-Elektrophysiologie wurde vorgestellt gekoppelt. Die Verwendung von Mikrokügelchen als Gerüst, um das Auswachsen neuritischen entlang der z-Achse zu ermöglichen wurde maßgeschneidert, um mit der planaren MEA integriert werden. Auf diese Weise können die erhaltenen Mikrosystem ergibt eine gültige und zuverlässige in vitro- 3D-Modells, um die austretenden elektroDynamik 16 zu studieren.
MEA Aufnahme Aufbau
MEA Geräte bestehen aus einem Kulturraum mit einer integrierten Anordnung von Substrat eingebetteten Mikroelektroden für die Messung von extrazellulären Signalen von elektroaktiven Geweben. Die typischen zeichneten Signale aus Spikes (dh Einzelsupraschwellenspannungsvariation, die die elektrische Aktivität von einem oder mehreren Neuronen) und platzt (dh Folge von dicht gepackten Spitzen oft Occurring gleichzeitig auf mehreren Kanälen). Die Aufnahmen von neuronalen Netzwerken Aktivität mit MEA-basierte Systeme erzeugen große Datenmengen (zB eine 4 h Versuch mit einer 60 Kanäle MEA erzeugt einen Rekord von über 15 GB). Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, effiziente Werkzeuge zur Verarbeitung und Analyse der Daten, vor allem im Fall von Studien, die lange Aufnahmen erfordern. Im Allgemeinen wird die Erfassung der elektrophysiologischen Signale durch eine direkte extrazelluläre Transduktion mit den neuronalen Kulturen, und die Akquisition eines Spannungssignals erhalten wird. Nach einer Verstärkung und Filterstufe werden die Signale abgetastet 10-50 kHz und gespeichert. Die Ausgangssignale werden dann von Spitze detektiert durch eine speziell entwickelte Software-Tool. Das Aufzeichnungssystem bestand aus (1) MEA Verstärker (2) Personal-Computer mit A / D-Erfassungskarte, (3) Aufnahme-Software, (d) Heizungsanlage und Temperaturregler, (4) ausgestattet CO2 Atmosphäre erhalt und Verdunstung verhindernden Systemen.
DasAufbau des 3D neuronales Netzwerk durchläuft zwei kritischen Schritten: der erste ist die Verteilung der richtigen Menge von Perlen auf die Multiwell-Platten mit Membraneinsatzoberfläche, die zweite ist die Überführung der Suspension von Mikrokügelchen mit anhaftenden Neuronen aus dem Multiwell Platten mit Membraneinsatzes an: (i) die 2D-neuronales Netz plattiert auf die aktive Fläche der MEA (erste Schicht); (ii) die bereits abgerechnet Schichten. Dieser Betrieb sollte so oft wie die Anzahl der benötigten Schichten wiederholt werden. Während der ersten Woche der Kultur, ein schnelles Wachstum der neuritischen Erweiterungen erfolgt rund um die Mikrokugeln in den verschiedenen Schichten gehören. Die enge Verbindung zwischen Neuronen und Mikroperlen stabilisiert die biologischen Proben und lassen Sie es aus dem Inkubator bewegen zu ändern / das Medium zu ersetzen und mit der MEA-Verstärker der elektrischen Aktivität, ohne sich um ihn zu beschädigen aufzeichnen.
Da die elektrophysiologische Aktivität des gesamten NettoArbeit wird nur von der Bodenschicht (dh die direkt mit der MEA verbunden), der aktive Bereich ist durch eine herkömmliche 2D-Netz abgedeckt werden aufgezeichnet. Die anderen Schichten werden Schritt für Schritt über die 2D hinzugefügt werden soll, und Langstreckenverbindungen werden zwischen den Schichten verteilt werden. Praktisch werden die anderen Schichten 6-8 Stunden später als der 2D eine nach Absetzung der Mischung von Neuronen und Mikroperlen. Die Wahl dieser Zeitfenster ermöglicht die Bildung von einigen synaptischen Verbindungen in der 2D-Ebene, und gewährleistet die Möglichkeit, Verbindungen zu den oberen Schichten zu etablieren.
Zwei Faktoren machen die Verwendung von Multiwell-Platten mit Membraneinsatz notwendig, um die 3D-Netzwerke zu realisieren: (i) Da Neuronen und Mikroperlen vorliegenden unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeiten, die Verwendung von Multiwell-Platten mit Membraneinsatzes gewährleistet eine gleichmäßige Verteilung der Neuronen auf der Oberseite der Mikrokügelchen : Im Durchschnitt kann jedes Mikrokügelchen durch die gleiche Anzahl von Neuronen umgeben sein. (ii) By Ausnutzung der elastischen Eigenschaften der Multiwell-Platten mit Membraneinlage ist die Rückspülung der Lösung von Mikroperlen zu Neuronen gekoppelt ist einfacher als mit festen Oberflächen, wie Polycarbonat Multi-Brunnen.
Die vorliegende Arbeit wurde nach dem von Pautot vorgeschlagene Konzept und Mitarbeiter 15: in dieser Studie die Verwendung von Silica-Kügelchen ein Wachstumsoberfläche groß genug für neuronalen Zellkörpern zu haften und für ihre Prozesse zu wachsen, reifen und produzieren prä- und postsynaptischen Spezialisierungen . Eine Alternative zu der Verwendung von Kügelchen Gerüst stammt aus Hydrogelen Matrizen oder bioaktive und biologisch abbaubare Perlen aus natürlichen Biopolymeren wie Chitosan hergestellt. Chitin und dessen desacetyliertes Derivat Chitosan, sind nicht toxisch, antibakteriell, biokompatiblen und bioabbaubaren Biopolymeren. Die Zeitkonstante eines solchen biologischen Abbauverfahrens ist mit dem Netzwerk outgrow 20,21 kompatibel.
Diese Studie kann einen Verweis wor bildenk für die zukünftige Entwicklung von fortschrittlichen 3D neuronalen Modellsysteme, um das Zusammenspiel von Netzwerkdynamik und Struktur systematisch zu studieren. In kurzer Zeit, hoffen wir, in der Lage, um die 3D-Netzwerk-Konstrukt an einer neuen Generation von Geräten 22 zu übertragen. Das Herstellungsverfahren umfasst die Herstellung von Elektroden in Form von Mikro-Säulen in einer variablen Höhe zwischen 50 und 350 um.
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Acknowledgments
Die Autoren danken Giorgio Carlini für die technische Unterstützung bei der Entwicklung der Begrenzungsstruktur und Dott. Ornella LoBrutto für die gründliche Überarbeitung des Manuskripts. Die Forschung, die diese Ergebnisse hat die Finanzierung von 7. Rahmenprogramm der Europäischen Union erhalten (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers Schema) unter Finanzhilfevereinbarung 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS w\o Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0x0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0x0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0x0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).
