Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

استراتيجية للتحقق من دور بوساطة Callose Plasmodesmal المحاصرة في الاستجابة مدار

Published: April 17, 2016 doi: 10.3791/53513
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1
1Division of Applied Life Science (BK21 plus program), Plant Molecular Biology and Biotechnology Research Center, Gyeongsang National University, 2Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

توضح هذه المقالة الطرق لفحص الجينات السيطرة على نفاذية plasmodesmal والتدرج بالتالي أوكسين خلال استجابة مدار. وهذا يشمل قياس درجة استجابة استوائية في التحتفلقي من thaliana نبات الأرابيدوبسيس وفحص النفاذية plasmodesmal بواسطة حامض 8 hydroxypyrene-1،3،6-trisulfonic (HPTS) التحميل وتقييم مستوى callose أخيرا.

Abstract

وأوكسين هرمون النبات يلعب دورا هاما في كثير من عمليات النمو والتنموية، بما في ذلك ردود استوائية للضوء والجاذبية. إنشاء التدرج أوكسين هو الحدث الرئيسي مما أدى إلى توجه ضوئي وانتحاء أرضي. سابقا، وقد أظهرت النقل أوكسين القطبي (PAT) لإنشاء التدرج أوكسين في المجالات الخلوية المختلفة من النباتات. ومع ذلك، هان آخرون في الآونة الأخيرة أظهرت أن لتشكيل أوكسين التدرج السليم، plasmodesmal بوساطة callose الاتصال symplasmic بين الخلايا المجاورة هو أيضا عاملا حاسما. في هذه المخطوطة، واستراتيجية لإلقاء الضوء على دور جينات معينة، والتي يمكن أن تؤثر على توجه ضوئي وانتحاء أرضي عن طريق تغيير الربط symplasmic من خلال تحوير تركيب callose plasmodesmal، ومناقشتها. الخطوة الأولى هي لفحص ردود مدار الشاذة من الشتلات etiolated عمرها 3 أيام من المسوخ أو خطوط الإفراط في التعبير عن الجينات جنبا إلى جنب مع نوع البرية. هذا الفرز الأولييمكن أن يؤدي إلى تحديد مجموعة من الجينات تعمل في PAT أو السيطرة على الربط symplasmic. ويشمل الفحص الثاني في فرز المرشحين التي تظهر استجابات استوائية المتغيرة التي تؤثر على الربط symplasmic. للتصدي لهؤلاء المرشحين، تم فحص حركة التتبع symplasmic وترسب callose plasmodesmal. ان هذه الاستراتيجية أن تكون مفيدة لاستكشاف الجينات المرشحة الجديدة التي يمكن أن تنظم الربط symplasmic مباشرة أو بشكل غير مباشر من خلال ردود استوائية والعمليات التنموية الأخرى.

Introduction

النباتات، والكائنات الحية لاطئة، وضعت شبكة متطورة للغاية من الإشارات من خلية إلى خلية لمعالجة المحفزات البيئية المختلفة. ردود استوائية هي واحدة من الظواهر التي النباتات تستجيب للمؤثرات البيئية. تظهر النباتات ردين مدار الرئيسية، توجه ضوئي وانتحاء أرضي. النباتات الضوئي تنحني باتجاه مصدر الضوء التي توجه ضوئي لحصاد الطاقة القصوى. وبالمثل، انتحاء أرضي يجعل النباتات تنمو في اتجاه مركز الجاذبية. الآلية الأساسية التي تؤدي إلى مثل هذه الردود استوائية تتضمن تشكيل التدرج غير المتماثلة من هرمون نباتي أوكسين 1. فعل تشكيل أوكسين التدرج المحلي يتميز أيضا؛ الجينات التي تشارك في هذه الآلية توفر خارطة طريق لعمل هرمون 2-8. موقف محدد من الناقلات أوكسين هروب رأس المال، مثل تشكيل PIN (PIN) و ف بروتينات سكرية، ينفذ حركة أوكسين من السيتوبلازم إلى جدار الخلية من الخلايا المانحة 9،10. Furthermore، من قبل H + / IAA النشاط symport نشط من حاملات تدفق أوكسين، مثل AUX1 / البروتينات الأسرة التراخي، يتم تسليم أوكسين في النهاية إلى خلايا استقبال المجاورة 2،11،12. وتعرف هذه الحركة الاتجاه من أوكسين وسائل النقل أوكسين القطبي (PAT). بات يؤدي إلى توزيع التفاضلية أوكسين خلال مراحل النمو المختلفة، واستجابة لمختلف المحفزات البيئية 13،14. وعلاوة على ذلك، واضطراب في توطين أو التعبير عن أي من هذه الناقلات تدفق أو هروب رأس المال أوكسين يؤدي إلى تغيير حاد في PAT، الذي يؤدي إلى اختلال التدرج أوكسين، مما يؤدي إلى عيوب التنموية. في الآونة الأخيرة، وهان وآخرون. وذكرت أن تنظيم plasmodesmal ضروري أيضا للحفاظ على التدرج أوكسين 15. حتى الآن، وقد تم تحديد أكثر من 30 البروتينات plasmodesmal 16. ومن بين هذه البروتينات، تم الإبلاغ عن AtGSL8 كما إنزيم أساسي لتخليق callose في رابطات هيولية (PD)، وبالتالي تلعب دورا حيويا في صيانة العامةaining الحد PD حجم الاستبعاد (SEL). وأدى قمع التعبير AtGSL8 في نمط أوكسين التدرج مشوهة مما يؤدي إلى أي رد مدار على النقيض من الشتلات نوع البرية 15.

في هذه المخطوطة، وأساليب لاستكشاف الجينات المرشحة الجديدة التي تشارك في تنظيم PD يتم توفيرها. وقد استخدم AtGSL8 كما بروتين نموذج لاختبار هذه الطرق، كما هو الأنزيم الرئيسي المساهمة في PD الحيوي callose. ويرجع ذلك إلى الشتلات الفتك من المسوخ gsl8 خروج المغلوب 17، واستخدمت ديكساميثازون (التنفيذ المباشر) -inducible خطوط رني وفقا لتقرير نشر في وقت سابق 15. الاستراتيجية المقدمة هنا يمكن تكييفها لفحص الجينات المسئولة ردا التحتفلقي مدار تسيطر عليها PD SEL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. فحص المسوخ مع غيرت موجه ضوئيا وGravitropic الردود

  1. إعداد 1X Murashige وسكوغ (MS) متوسطة، ودرجة الحموضة 5.7، مع 0.8٪ اجار يوم واحد قبل التجربة.
    1. إضافة 800 مل من الماء المقطر المزدوج إلى 2 لتر مخروطي قارورة واثارة مع شريط مغناطيسي.
    2. إضافة 4.4 غرام من الملح MS إلى دورق مخروطي.
    3. إضافة 0.5 غرام من 2- (N-Morpholino) الإيثان حمض السلفونيك (MES) ويحرك حتى يذوب كل من الأملاح تماما.
    4. ضبط درجة الحموضة في المتوسط ​​إلى 5.7 مع 1 M KOH.
    5. نقل متوسطة إلى اسطوانة الإعلام وجلب الحجم النهائي إلى 1 لتر مع DDH 2 O.
    6. صب العودة المتوسط ​​إلى 2 لتر مخروطي قارورة وإضافة 8 غراما من أجار النبات.
    7. التفاف فم القارورة المخروطية بإحكام بورق الألمنيوم.
    8. الأوتوكلاف المتوسطة التصلب العصبي المتعدد وده 2 O لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية، و 15 رطل، وبعد التعقيم، والحفاظ على المتوسط ​​في 60 درجة مئوية الحاضنة وده 2 O في RT.
    9. بعد التبريد إلى 60 درجة مئوية، صب المتوسطة إلى 125 × 125 × 20 مم 3 لوحات مربع على مقاعد البدلاء تدفق الصفحي (50 مل في كل لوحة).
    10. السماح للأجار ليصلب في RT لمدة 1 ساعة عن طريق الحفاظ على لوحات مفتوحة جزئيا. إذا لم يتم استخدام لوحات على الفور، وختم عليها باستخدام غلاف بلاستيكي وتخزينها في 4 درجات مئوية في الثلاجة.
  2. السطح تعقيم البذور مع 1.1٪ هيبوكلوريت الصوديوم وتنتشر البذور على لوحات أجار 1X MS التي تم إعدادها في القسم 1.1.
    ملاحظة: هنا، نبات الأرابيدوبسيس thaliana {العقيد-0 البذور، dsGSL8 (كو-0)} تستخدم 15 للاستجابة مدار، وتلطيخ callose وHPTS تحميل thaliana نبات الأرابيدوبسيس {العقيد-0 وdsGSL8 (كو-0) EMS متحولة} البذور (. غير منشورة) تستخدم للاستجابة مدار في الشكل 2.
    1. الأوتوكلاف 300 مل من ده 2 O في زجاجة.
    2. إضافة ما يقرب من مائة البذور لكل الخلفية، أيمتحولة / خط الإفراط في التعبير والنوع البري (كو-0) والبذور، وإلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    3. تأخذ بها لوحات 1X MS أجار من 4 درجات مئوية الثلاجة وتجفيفها على مقاعد البدلاء تدفق الصفحي في وضع مفتوح جزئيا.
    4. السطح تعقيم البذور عن طريق إضافة 1 مل من محلول التبييض 0.2x (1.1٪ هيبوكلوريت الصوديوم) والحفاظ على أنابيب microcentrifuge على شاكر في 250 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
    5. لندع البذور تترسب في القاع بفعل الجاذبية ثم قم بإزالة محلول التبييض من قبل micropipette.
    6. إضافة 1 مل من ده الطازجة 2 O (تعقيمها) إلى البذور وتخلط جيدا للقلب أنبوب microcentrifuge عدة مرات. لندع البذور تستقر مرة أخرى ثم قم بإزالة الماء.
    7. كرر الخطوة 1.2.6 5-6 مرات.
    8. إضافة مضاعفة كمية المياه لحجم البذور التي تركت بعد غسل النهائي.
    9. نقطة بذور معقمة على طبق أجار 1X MS-المجففة شبه باستخدام تلميح 1 مل micropipette تحتوي على 200 ميكرولتر من البذور (فيالمياه بغرض اختتامها).
      1. إبقاء حوالي مسافة 0.1 سم بين اثنين من البذور والحد الأدنى من 1.8 سم بين صفين البذور. تنتشر البذور في خمسة صفوف أفقية في لوحة مربعة (125 × 125 × 20 مم 3). اسمحوا المياه لتجف قليلا قبل وضع غطاء على طبق من ذهب.
    10. ختم لوحات مع الشريط الجراحية، كومة جميع لوحات عموديا، والتفاف مع رقائق الألومنيوم.
    11. نقل لوحات ملفوفة إلى مربع الظلام (الذين لا يحصلون على الضوء). ثم، والحفاظ على مربع الظلام في 4 ° C / غرفة الثلاجة لمدة 3 أيام.
    12. بدءا من هذه الخطوة، والحفاظ على اتجاه لوحات دون تغيير. بعد 3 أيام من العلاج الباردة، والحفاظ على مربع مظلم في غرفة ثقافة النباتات عند 22 درجة مئوية لمدة 3 أيام القادمة. بعد 3 أيام، تحقق من حالة إنبات البذور تحت الضوء الاخضر في غرفة مظلمة.
      ملاحظة: يمكن عادة القديمة يوم 3 العقيد-0 شتلات etiolated تنمو لتصل إلى 1.6 سم في الطول.
  3. تحليل وموجه ضوئيا تغييرالثانية استجابة gravitropic في المسوخ أو الإفراط في التعبير خطوط جين معين. اختيار الشتلات على التوالي الحجم فقط بالمثل، وتنمو عموديا تحت الضوء الاخضر في غرفة مظلمة. نقل الشتلات المحدد إلى لوحة أجار 1X MS جديدة باستخدام غيض من المسواك تعقيمها.
    1. اختيار برفق الشتلات من أدنى جزء من التحتفلقي من دون لمس أي أجزاء أخرى. تأكد من أن جميع الشتلات لها نفس التوجه فلقة / هوك، وبعد نقل، أن التوجه من السنانير الشتلات لا تزال هي نفسها. استخدام ما لا يقل عن 20 شتلة من كل خلفية في كل صف والحد الأدنى من اثنين من لوحات لكل نقطة من الوقت لمزيد من التحليل.
      ملاحظة: يمكن مقارنة أربع خلفيات مختلفة في كل لوحة (4 صفوف).
      اختياري: في حين تستخدم ديكساميثازون (التنفيذ المباشر) رني / الإفراط في التعبير خطوط -inducible، ونقل شتلات المذكورة أعلاه إلى 1X MS وحة جنبا إلى جنب مع لوحة MS + التنفيذ المباشر (لوحة تحتوي على 1X MS، 0.8٪ أجار المتوسطة تستكمل مع التنفيذ المباشر 20 ميكرومتر) FOص 3 ساعات والحفاظ على لوحات عموديا في مربع مظلم.
    2. للتحقق استجابة موجه ضوئيا، ونقل لوحات أعلاه عموديا إلى مربع أسود مع جانب واحد فقط فتح. نقل الصندوق الأسود يحتوي على لوحات لغرفة نمو النباتات مع الضوء الأبيض من جانب واحد. لضمان ضوء من جانب واحد، ضع حافة صفيحة نحو مصدر الضوء (وليس الجانب الأمامي). الرجوع إلى الإعداد في الشكل 1.
    3. وبالمثل، للتحقق من استجابة gravitropic، والحفاظ على لوحات مع الشتلات نقل عمودية، ويغطى بورق الألومنيوم. بعد ذلك، تغيير اتجاه لوحة عموديا إلى 90 درجة والاحتفاظ بها داخل الصندوق الأسود تغطيتها من جميع الجوانب. الرجوع إلى الإعداد في الشكل 1.
    4. بعد نقطة زمنية معينة، (عادة 1.5 ساعة، 3 ساعات، 6 ساعة، و 12 ساعة) مسح لوحات مع الماسح الضوئي، وحفظ الصور في شكل JPEG.
    5. قياس زاوية الانحناء من الشتلات باستخدام برنامج ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (الشكللدى عودتهم 2).
      1. بدء برنامج يماغيج عن طريق النقر المزدوج (الشكل 2A).
        ملاحظة: يتم عرض الأدوات الرئيسية التي تم استخدامها في قياس زاوية في الشكل 2B.
      2. انقر فوق الخيار "ملف"، يليه الخيار الفرعي "فتح" في شريط الأدوات يماغيج، والصور مفتوحة حفظها في تنسيق ملف JPEG لقياس مدار زاوية الانحناء (الشكل 2C).
      3. انقر فوق الأداة مكبرة لتكبير أو تصغير الصورة عن طريق النقر على زر الماوس الأيسر أو الأيمن، على التوالي كما هو مبين في الشكل 2B.
      4. انقر فوق الأداة التمرير لسحب ووضع الصورة (الشكل 2D) .Next، انقر فوق الأداة زاوية لقياس زاوية الانحناء (الشكل 2E).
        1. جعل النقر المزدوج على اليسار التحتفلقي الأصلي متزايد نقطة الاتجاه "أ"، اسحب الماوس إلى الانحناء نقطة البدء "ب" (الشكل 2F)، ثم انقر بعقب غادرعلى رسم السطر الأول (الشكل 2G).
        2. اسحب الماوس من نقطة ب إلى نقطة النهاية الانحناء "ج"، وانقر على الزر الأيسر لرسم الخط الثاني (الشكل 2H) وتشكيل ثابتة زاوية ألف ملاحظة: زاوية الانحناء الحقيقية هي زاوية B، والتي تساوي 180 ° - زاوية A. (الشكل 2F).
        3. قياس وسجل زاوية A عن طريق الضغط على 'M' على لوحة المفاتيح. سيتم فتح الملف نتيجة على حدة كما هو مبين في الشكل 2I. قياس وتسجيل جميع الشتلات واحدا تلو الآخر. على سبيل المثال، لأول مرة قياس زاوية الانحناء لجميع hypocotyls من العقيد-0 ثم لخطوط متحولة.
    6. نقل بيانات من يماغيج إلى ملف جدول لجعل مركباتerage من الانحناء زوايا كل الخلفية.
    7. للتحليل الكمي، وجعل الرسم البياني شريط الرسم البياني مع نتائج الاختبارات الإحصائية، بما في ذلك أشرطة الخطأ القياسية والقيم الاحتمالية (انظر الشكل 2).
      1. حساب الانحناء الصحيح زاوية B، وتصميم صيغة باستخدام جداول البيانات، أي زاوية B = 180 ° - زاوية ملاحظة: زاوية (أ) هو القيمة التي كانت مستمدة من تحليل يماغيج.
      2. قياس متوسط ​​زاوية الانحناء زاوية B لكل الخلفية باستخدام أدوات جدول (الشكل 2J).
      3. تحليل الانحراف المعياري بين مكررات لكل قياس باستخدام جدول "صيغ" أداة (الشكل 2J).
      4. اختبار سيجnificance النتائج من خلال تطبيق اختبار (ت) لمتوسط ​​زاوية الانحناء والقيم الانحراف المعياري يحسب على النحو المذكور أعلاه.
      5. رسم تخطيطي الشريط باستخدام القيم أعلاه لتمثيل بياني الفرق الكمي في زاوية الانحناء بين اثنين من خلفيات مختلفة باستخدام جدول "إدراج" أداة (الشكل 2K).
        ملاحظة: سوف المسخ / الإفراط في التعبير خطوط جينات مرشحة قوية تظهر اختلافات واضحة فيما يتعلق النوع البري، مثل عدم وجود الانحناء، وبسرعة الانحناء أو الانحناء بطيئة.

2. خطوط النبات الشاشة مع الردود عيب مدار نظرا للتغيرات في PD SEL مع ... تغيير PD Callose مستوى

  1. إجراء التحتفلقي تحميل الفحص بنسبة 8-hydroxypyrene-1،3،6-trisulfonic حمض (HPTS) صبغ تحميل على الجزء العلوي من الشتلات مع HPTS الاغاروز كتل وقارن حركة صبغ بين المسخ / الإفراط في التعبير خطوط والعقيد-0.
    1. إعداد HPTS agaroبنات حد ذاتها لفحص التحتفلقي التحميل.
      1. يستغرق 10 مل من ده 2 O في 50 مل قارورة مخروطي الشكل وإضافة 0.1 غرام من الاغاروز لإعداد agarose هلام 1٪. غلي الاغاروز في فرن الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة مع اهتزاز متقطعة، والسماح لتبرد لمدة 5 دقائق.
      2. إضافة 50 ملغ من HPTS إلى 10 مل من محلول 1٪ الاغاروز، وتخلط جيدا حتى يتحول الحل الأخضر.
      3. يصب الخليط المذكور أعلاه إلى 10 مم طبق بيتري، والسماح لها لترسيخ لمدة 15 دقيقة.
      4. قطع HPTS طدت الاغاروز بشفرة حادة تشريح لجعل كتل الاغاروز صغيرة (0.5 × 2 سم 2).
    2. تحضير عينات مصنع لHPTS فحص صبغ التحميل.
      1. وضع منصة للمقايسة HPTS صبغ تحميل. وضع شريحة غطاء المجهر (24 × 50 مم 2) في مرض التصلب العصبي المتعدد لوحة متوسطة جديدة كما هو موضح في الشكل 3A.
      2. المكوس الشتلات etiolated القديمة يوم 3 من قاعدة هوك باستخدام مقص جراحي حادة.
      3. فورانقل الشتلات أعلاه (لا تقل عن 5 شتلات من كل خلفية) على سطح غطاء زجاجي المجهري في مثل هذه الطريقة التي يجب أن تبقى فقط 0.5 سم من التحتفلقي من موقع الختان على غطاء الشرائح، وبقية التحتفلقي يجب أن تلمس المتوسط ​​كما هو مبين في الشكل 3B.
      4. وضع كتلة HPTS الاغاروز على رأس التحتفلقي (مع هوك رفعه) لمدة 5 دقائق في مثل هذه الطريقة أن المنطقة رفعه تلامس كتلة الاغاروز HPTS.
      5. بعد 5 دقائق من التحميل، وإزالة كتلة agarose من سطح التحتفلقي، ونقل hypocotyls إلى 10 مم طبق بتري تحتوي ده 2 O وغسل hypocotyls في ده 2 O لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز مستمر.
    3. تحضير عينات للمتحد البؤر المجهري.
      1. تحديد الحد الأدنى من 5 شتلات من كل خلفية للمراقبة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر.
      2. في قناة الليزر، وتعيين الطول الموجي إلى 488 نانومتر للمريض بالحب محددitation و500-550 نانومتر لانبعاث الفرقة تمرير.
      3. الشتلات نقل في 2 مجموعات (واحد العقيد-0 + واحد متحولة) إلى شريحة مجهرية جديدة بعد غسل مع ده 2 O. إضافة 100-150 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج إلى الشريحة، وتغطي مع شريحة الغطاء. تحويل الشريحة إلى مرحلة المجهر متحد البؤر.
      4. التركيز على منطقة التحتفلقي (مع 20X أو 40X عدسة الهدف) باستخدام مشرق الميدان (الضوء الأبيض) إضاءة. ثم، مسح الشرائح لمضان.
      5. التقاط صور لمدة لا تقل عن 10 مجموعات، ومقارنة الخلفيات اثنين عن طريق التحقق من مدى الحركة صبغة من وجهة التحميل.
        ملاحظة: سوف المسخ / الإفراط في التعبير خطوط مع حركة symplasmic المتغيرة تظهر أنماط مختلفة من الصبغة تحميل بالمقارنة مع النوع البري العقيد-0.
  2. تحليل مستوى Callose في المسخ / الإفراط في التعبير خطوط عرض غيرت موجه ضوئيا وGravitropic الاستجابة وعرض مميز HPTS صبغ حركة Comparإد إلى العقيد-0.
    1. إعداد الأنيلين الأزرق callose تلطيخ صبغ.
      1. جعل 1 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 9.5 و 0.1٪ (W / V) الأزرق الأنيلين في تعقيمها ده 2 O.
      2. جعل عازلة تلطيخ عن طريق خلط 0.1٪ الأنيلين الأزرق و 1 M الجلايسين في 2: 3 نسب حجم. على سبيل المثال، لمدة 50 مل من العازلة تلطيخ، يستغرق 20 مل من 0.1٪ الأنيلين الأزرق و 30 مل من 1 M الجلايسين. ملاحظة: تأكد من تلطيخ العازلة ما لا يقل عن 48 ساعة قبل استخدامها وتخزينها في الظلام.
    2. وصمة عار محني أو الشتلات مع callose محددة الأنيلين صبغة زرقاء غير محني.
      1. لكبح دي نوفو callose التخليق خلال عملية التلوين، إضافة الحجم النهائي من 1.5 ملم 2-ديوكسي-D-الجلوكوز (نائب المدير العام) إلى 50 مل من العازلة تلطيخ.
      2. أخذ شتلات etiolated القديمة لمدة 3 أيام لتلطيخ callose (مع أو بدون استجابة مدار).
      3. قطع شتلة من المنطقة هوك وذلك باستخدام مقص جراحي رقيقة.
      4. نقل الشتلات في طبق بيتري صغير يحتوي علىجي 2 مل من العازلة تلطيخ باستخدام غيض من المسواك.
      5. احتضان الشتلات مع العازلة تلطيخ في الظلام لمدة 2 ساعة مع الهز المستمر في 30 دورة في الدقيقة.
      6. بعد تلطيخ، وغسل الشتلات مع ده 2 O لمدة 2 دقيقة لإزالة العازلة تلطيخ الزائد.
      7. تحديد الحد الأدنى من 5 شتلة لكل خلفية مصنع للمراقبة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر.
    3. تحضير عينات للفحص المجهري متحد البؤر:
      1. نقل الشتلات في مجموعة (واحد العقيد-0 + واحد متحولة) لتنظيف المجهر الشرائح بعد غسل ده 2 O.
      2. إضافة 100-150 ميكرولتر من ده 2 O، وتغطي مع شريحة الغطاء. تحويل الشريحة إلى مرحلة المجهر متحد البؤر.
      3. في قناة الليزر، وتعيين الطول الموجي إلى 405 نانومتر لإثارة محددة و500-550 نانومتر الانبعاثات للتصوير من الأنيلين مضان الأزرق.
      4. جلب المنطقة التحتفلقي إلى التركيز، لأول مرة مع 10X وفي وقت متأخرص مع 20X أو 40X العدسات الهدف باستخدام مشرق الميدان (الضوء الأبيض) إضاءة.
      5. ثم، والتبديل على ضوء تصفيتها، مسح الشرائح لمضان، وحفظ الصور.
      6. قياس كثافة إشارة callose مع برنامج ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (انظر الشكل 4).
        1. تغيير شكل الصور المجهري مبائر من أوليمبوس صورة شكل ثنائي (* .oib) إلى تنسيق ملف JPEG. ملاحظة: يتم اعتماد صيغة JPEG فقط من خلال برنامج ImageJ.
        2. بدء برنامج يماغيج عن طريق النقر المزدوج (الشكل 4A). ملاحظة: تشير الأسهم إلى أداة المستطيل لاستخدامها في قياس كثافة callose (الشكل 4B).
        3. انقر فوق الخيار "ملف" متبوعة-الخيار الفرعية "فتح" في شريط الأدوات يماغيج، والصور المجهر المفتوحة التي تم حفظها في تنسيق ملف JPEG لقياس كثافة callose (الشكل 4C).
        4. انقر فوق رمز مستطيل على إيماgeJ شريط الأدوات (الشكل 4D).
        5. لتحليل كثافة إشارة، اسحب المؤشر فوق الصورة وتحديد المنطقة المراد فحصها (الشكل 4E)
        6. قياس وتسجيل القيم العددية لكثافة إشارة عن طريق الضغط على 'م' على لوحة المفاتيح (الشكل 4E). ملاحظة: الملف نتيجة فتح بشكل منفصل (الشكل 4F).
        7. قياس وتسجيل كثافة تقدر واحدا تلو الآخر لجميع شتلات من كل خلفية النبات.
          ملاحظة: في يماغيج، الملف نتيجة "يعني" يشير إلى كثافة إشارة من "المنطقة" المختارة.
      7. نسخ القيم المتوسطة من الملف نتيجة يماغيج، ولصق في ملف جدول بيانات للتحليل الكمي.
      8. للتحليل الكمي، وجعل الرسم البياني شريط الرسم البياني مع الاختبارات الإحصائية، بما في ذلك أشرطة الخطأ القياسية والقيم الاحتمالية (الشكل 4).
        1. قياس متوسط ​​كثافة إشارة(يعني من يماغيج) لكل الخلفية باستخدام جدول البيانات "الصيغ" أداة (الشكل 4G).
        2. تحليل الانحراف المعياري بين مكررات لكل قياس باستخدام جدول "صيغ" أداة (الشكل 4G).
        3. حساب الخطأ المعياري (SE) باستخدام thespreadsheet "الصيغ" أداة.
          ملاحظة: SE = ق / ن √، حيث (ق) هو الانحراف المعياري من السكان، و (ن) هو حجم (عدد من الملاحظات) من العينة.
        4. اختبار أهمية النتائج من خلال تطبيق اختبار (ت) لمتوسط ​​كثافة إشارة وقيم الخطأ القياسية تحسب على النحو المذكور أعلاه.
        5. رسم تخطيطي شريط الرسم البياني باستخدام القيم أعلاه لتمثيل بياني الفرق الكمي في مستوى callose بين اثنين من خلفيات مختلفة باستخدام جدول "إدراج" أداة (الشكل 4H).
          ملاحظة: المسخ / الإفراط في التعبير خطوط مرشح قوي والصورةكيف مستويات callose بالمقارنة مع نوع البرية، مثل عدم وجود callose، callose قليلا أو فرط تراكم PD callose مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الإعداد الحالي، ديكساميثازون (التنفيذ المباشر) -inducible خطوط رني من AtGSL8 [الآخرة dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر / -dex)] استخدمت، كما gsl8 متماثل المسوخ T-DNA الإدراج والشتلات فتكا 18. تعرضت الشتلات etiolated منذ ثلاثة أيام مع dsGSL8 ونوع الشتلات البرية مع التنفيذ المباشر ± للمؤثرات موجه ضوئيا وgravitropic. وجدنا أن dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) شتلة كانت معيبة في توجه ضوئي وانتحاء أرضي 15 الشكل 5 يبين بوضوح أن dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) يسلك لا الانحناء تحت تأثير كل من توجه ضوئي وانتحاء أرضي. وعلاوة على ذلك، تم تحليل تغيير في حركة symplasmic في dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) وdsGSL8 (-dex) أو العقيد-0 عن طريق فحص تحميل HPTS. وتمشيا مع ما توصلت السابق، كانت حركة HPTS الصبغة في dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) إلى حد كبير أكثر اتساعا مما كان عليه في dsGSL8 (-dex) أو العقيد-0، الشكل 6. Callose هي واحدة من المنظمين الرئيسيين للPD SEL، وكما هو معروف AtGSL8 باعتباره PD callose سينسيز 16. وعلاوة على ذلك، تم تنفيذ callose الأنيلين تلطيخ الأزرق خارج، وdsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) وقد أظهرت باستمرار مستوى callose PD منخفض قبل وبعد ردود استوائية، كما هو مبين في الشكل (7).

الشكل 1
الشكل 1. مخطط تدفق الخطوات التي تشارك في تحفيز استجابات موجه ضوئيا وgravitropic. (A) نقل نمت عموديا شتلة من الخلفيات النباتية المختلفة على لوحة واحدة ولكن في خطوط منفصلة. (ب) لتوجه ضوئي، والحفاظ على لوحات التوجه نحو الضوء الأبيض من جانب واحد في مربع الظلام التي يتم فتحها على جانب واحد. لانتحاء أرضي، أول التفاف على لوحات مع رقائق الألومنيوم، وتناوب 90 درجة مئوية، ونقل إلى مربع الظلام (covereد من جميع الجهات). (C) باستخدام الماسح الضوئي والمسح الضوئي لوحات بعد فترات مختلفة من الزمن، مثل 1.5 ساعة، 3 ساعات، 6 ساعة و 12 ساعة. (D و E) تظهر هذه اللوحات توليد البيانات من يماغيج وتحليل البيانات باستخدام ملفات جداول البيانات، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. قياس زاوية الانحناء عن طريق يماغيج. (A) عرض برنامج J صورة عن طريق النقر المزدوج. (ب) الأدوات الرئيسية التي تم استخدامها في قياس زاوية. (C) فتح خيار "ملف" متبوعة-الخيار الفرعية "فتح" في صورة J شريط الأدوات لفتح الصور المجهري التي تم حفظها في تنسيق ملف JPEG. (D (F) الخطوط العريضة للقياس زاوية: زاوية يعرف اي بي سي ثابت زاوية A، ويتم حساب زاوية الانحناء الحقيقية كما زاوية B، والتي تساوي 180 ° - زاوية A. (G) خط يمثل المسافة من النقطة ألف إلى النقطة ب. (H) استمرارية خط أساسها أن نشير صنع ج زاوية A. (I) ملف النتيجة من صورة J الاداء زاوية قيمة. (J) الممثل ملف جدول عرض متوسط ​​القياسات زاوية الانحناء، ستانالانحرافات المعيارية، والأخطاء القياسية والحسابات اختبار (ت). (K) بار الرسم البياني الرسم البياني يعرض القياسات زاوية الانحناء بين خلفيتين النباتية المختلفة العقيد-0 وdsGSL8 EMS متحولة. أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة (الخطأ المعياري للمتوسط ​​+) و*** تمثل أهمية التي كتبها T-اختبار (قيمة P> 0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الخطوط العريضة للخطوات التي تشارك في فحص تحميل HPTS. (A) لوحة تبين إعداد كتل الاغاروز HPTS. (ب) لوحة تمثل الختان ونقل الشتلات والتحميل من كتل الاغاروز HPTS. (C) لوحة عرض الخطوات التي تشارك في عينةالتحضير لتصوير متحد البؤر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. قياس كثافة callose التي كتبها يماغيج. (A) عرض برنامج يماغيج عن طريق النقر المزدوج. (ب) الأدوات الرئيسية التي تم استخدامها في قياس كثافة callose. (C) فتح خيار "ملف" متبوعة-الخيار الفرعية "فتح" في شريط الأدوات يماغيج لفتح الصور المجهري التي تم حفظها في تنسيق ملف JPEG. (D) رمز مستطيل على يماغيج شريط الأدوات. (E) المنطقة المحددة من الصورة لتحليل كثافة callose. (F) يماغيج نتيجة ملف عرض قيمة كثافة callose باسم "يعني". (G)ملف جدول تمثيلي عرض متوسط ​​قياسات كثافة callose والانحرافات المعيارية والأخطاء المعيارية وحسابات اختبار (ت). (H) بار الرسم البياني رسم بياني يمثل الفرق كثافة callose بين الخلفيات مصنع اثنين. أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة (الخطأ المعياري للمتوسط ​​+) و*** تمثل أهمية التي كتبها T-اختبار (قيمة P> 0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. الحد من التعبير AtGSL8 يؤدي إلى خلل أو تلف الردود استوائية. (A) أظهرت استجابة موجه ضوئيا من قبل dsGSL8 (± التنفيذ المباشر) جنبا إلى جنب مع العقيد-0. (ب) استجابة Gravitropic أبداه dsGSL8 (± التنفيذ المباشر) آل أونج مع العقيد-0. dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) لا يظهر أي ردود موجه ضوئيا أو gravitropic. dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) وdsGSL8 (-dex) ترمز المعالجة ديكساميثازون وغير المعالجة dsGSL8 خطوط رني -inducible، على التوالي. يمثل شريط نطاق 0.2 سم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. زادت حركة symplasmic بعد قمع AtGSL8. تم اتخاذها بعد HPTS تحميل لdsGSL8 ± قطع التنفيذ المباشر التحتفلقي السطوح جنبا إلى جنب مع نوع البرية العقيد-0 صور الإسفار، وأظهر dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) حركة أوسع من HPTS صبغ، مما يدل على زيادة حركة symplasmic. يمثل شريط مقياس 0.2 مم.كوم / ملفات / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
أظهر الرقم 7. AtGSL8 خطوط قمعت توزيع PD callose متماثل بين الجانبين مضيئة ومظللة من التحتفلقي. (أ) صورة الإسفار تظهر الأنيلين تلطيخ callose الأزرق للdsGSL8 (-dex) في 0 ساعة. (ب) الإسفار صورة تظهر الأنيلين تلطيخ callose الأزرق للdsGSL8 (-dex) بعد 6 ساعات من توجه ضوئي. (C) الإسفار صورة تظهر الأنيلين تلطيخ callose الأزرق للdsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) بعد 6 ساعات من توجه ضوئي. وتشير الأسهم الصفراء تراكم callose على المنطقة المظللة من التحتفلقي. يمثل مقياس شريط 50 ميكرون. (D) بار الرسم البياني رسم بياني يمثل صباحاount من callose PD التي تراكمت في dsGSL8 (± التنفيذ المباشر) hypocotyls قبل وبعد 3 ساعات و 6 ساعة من توجه ضوئي. تم قياس كثافة البؤر مضان من عشرة hypocotyls المستقلة (البيانات يعني ± SD؛ ر الطالب اختبار، * ف <0.01). تم تعديل هذا الرقم من (هان وآخرون، 2014) 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المخطوطة، ووضع استراتيجية للكشف خطوط متحولة / الإفراط في التعبير التي هي معيبة في الردود موجه ضوئيا وgravitropic بسبب callose PD تغييرها، وبالتالي يوصف PD SEL في التفاصيل. ويتم إنجاز PD التوليف callose وتدهور بشكل رئيسي من قبل synthases callose وβ-1،3-Glucanases، ولكن يتم التحكم تنظيم هذه الانزيمات من قبل العديد من العوامل المنبع. للبحث عن هذه العوامل المنبع أو المرشحين التي تشارك مباشرة في تنظيم PD، أنشأنا هذه الطريقة لفرزها. وضع هذا الأمر لديه بعض قيود المسوخ بعض الإنزيمات الرئيسية التي تنظم الحيوي PD callose (gsl8) هي قاتلة 15 ولفرز ستقتصر هذا انشاء مثل هذه المسوخ. أيضا، إذا كان الجين مرشح يظهر بشكل أسرع أو أبطأ استجابة مدار جنبا إلى جنب مع PD مفتوحة أو مغلقة، ولكن لا يزال مستوى callose دون تغيير، ثم هناك حاجة إلى تحليل مفصل لمزيد من تميز هؤلاء المرشحين. العوامل الحاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها صناعة تجالمؤسسات الصغيرة الحجم في كل خطوة هي أيضا بالتفصيل. أولا، في إعداد المتوسط، عاملا حاسما يمكن أن تؤثر على نمو النبات هو الرقم الهيدروجيني من وسائل الإعلام، والتي ينبغي أن تتراوح 5،7-5،8. ثانيا، تجفيف السطح المناسب لوحات أجار مهم. سيكون من الصعب رفع الشتلات القديمة يوم 3 بدون أي ضرر من لوحات أجار مع نسبة عالية من المياه. ومع ذلك، الكثير من تجفيف لوحات أجار قد يسبب بعض الشقوق في وسائل الإعلام أثناء الحضانة ويؤدي إلى نمو البادرات غير المتماثلة. خلال تعقيم سطح البذور باستخدام الصوديوم محلول هيبوكلوريت، يجب الحرص على إزالة هيبوكلوريت الصوديوم تماما عن طريق الغسيل المتكرر مع ده تعقيمها 2 O، كما هو وكيل تبيض قوي. يجب أن تكون مستعدة تعقيمها ده 2 O الطازجة والتعامل معها جو معقم و مطهر، والمخزونات القديمة قد تسبب التلوث الفطري في لوحات MS. بعد التعقيم، والطبقية البذور عن طريق العلاج الباردة لمزامنة الإنبات. هذه العملية لا يمكن أن يؤديها إما عن طريق ترانسفيرينز تعقيم البذور الرطبة مباشرة إلى غرفة باردة في الظروف المظلمة أو أولا تنقيط البذور على لوحات MS ثم نقل لوحات لغرفة باردة في الظروف المظلمة. ومع ذلك، ونحن نفضل هذا الأخير لأنه يعطي المزيد من النمو موحد من الشتلات. في حين تنقيط البذور، ويجب أن تكون المسافة بين اثنين من البذور المجاورة على الأقل من 0.1 سم لأن بذور تنتشر بشكل وثيق للغاية من شأنه أن يؤدي في نمو تداخل الشتلات، والتي يصعب جدا لنقل في تجارب لاحقة.

لاستجابات موجه ضوئيا وgravitropic المناسبة، لا ينبغي أن يتعرض الشتلات للضوء ويجب أن تظل غير التالفة. لتجنب الآثار خلفية الضوء الأبيض، وتحديد دقيق لالشتلات تحت مصدر الضوء الأخضر في غرفة مظلمة عن محطات لا تستجيب للضوء الأخضر. يمكن أن تتولد مصدر الضوء الأخضر من خلال تغطية مصدر الضوء الأبيض باستخدام أوراق الفينيل خضراء شفافة. لاختيار الشتلات، مسواك تعقيمها هو الخيار الأفضل. لمس عشره الجزء السفلي جدا من التحتفلقي مع المسواك لرفع الشتلات بحيث يمكن نقلها بسهولة إلى لوحة جديدة. يجب أن يكون كل من الشتلات مماثل في حجم واتجاه هوك. خلال تجاربنا، رأينا أنه إذا كان الاتجاه هوك على الجانب الآخر من مصدر الضوء، وسوف النباتات تظهر استجابة أسرع استوائية من النباتات ذات نفس الاتجاه هوك كمصدر للضوء. عادة، في حالة توجه ضوئي، يمكن للمرء أن يرى فرقا واضحا في زاوية الانحناء بين المرشحين الحقيقي والعقيد-0 خلال 3 ساعة، بينما في حالة انتحاء أرضي، فإنه عادة ما يستغرق 6-12 ساعة. وأخيرا، الحصول على بيانات ذات صلة إحصائيا، لا تقل عن ثلاث مكررات البيولوجية وهناك حاجة في كل مرة 20 شتلة.

لاختبار مدى حركة symplasmic بين الخلفيات النباتية المختلفة، HPTS صبغ تحميل هي تقنية مريحة، لأنها لا تحتاج إلى أدوات متطورة وأجهزة القياس. للمقايسة تحميل HPTS، نسبة زايل في كتل الاغاروز HPTS له أهمية كبيرة، كما أن جل هش جدا أو صلبة لا يعطي أفضل النتائج. فمن الأفضل لاستخدام 50 مل دورق مخروطي مع المطاط فضفاضة وعدم استخدام قارورة حجم كبير لغلي الاغاروز مع 10 مل من الماء. كتل الاغاروز HPTS يمكن استخدامها لمدة أسبوع واحد بعد إعداد إذا أبقى ملفوفة بورق الألمنيوم في 4 درجات مئوية. عامل رئيسي آخر في مقايسة تحميل HPTS هو استئصال المنطقة التحتفلقي هوك. يجب أن يتم تنفيذ الختان مع مقص تشريح حادة وفي موقف مماثل لجميع من الشتلات. الختان مع مقص حادة يمكن أن تسبب أضرارا غير المرغوب فيها إلى الشتلات ويمكن أن تعيق HPTS التحميل. بالإضافة إلى ذلك، فإن ظروف نمو البادرات ومراحل النمو قد تلعب دورا حاسما في حركة صبغ، وتراكم callose هو أكثر عرضة للرد على مثل هذه التغييرات، التي تشكل في نهاية المطاف للإعاقة في حركة صبغ. وهكذا، وتزايد الشتلات تحت الظروف المثلى من الضروري. Callose في PD يلعب دورا رئيسيا فيردود مدار الشتلات etiolated من خلال تنظيم PD SEL، وهو أمر مهم لأوكسين تشكيل التدرج 15. ويمكن الكشف عن مستويات Callose بواسطة تلطيخ مع الأنيلين وضع العلامات الزرقاء أو immunogold. تلطيخ مع الأنيلين الأزرق هو أسلوب بسيط وسريع للكشف عن مستوى callose. لأن الخلايا التحتفلقي يعانون من ارتفاع ضغط الامتلاء وطبقة برنامج التحصين الموسع، بشرة، فإنه ليس من السهل على الصبغة لاختراق الخلايا. لذلك، قمنا بتطوير طريقة قطع تلطيخ للسماح الأنيلين صبغة زرقاء لاختراق بسهولة. ومع ذلك، هناك خطر من توليف callose الجديدة التي يمكن أن تؤثر على النتائج تلطيخ، وهو وجود قيود على طريقة callose تلطيخ العادي. لتجنب مثل هذه الآثار، ويتم تعديل بروتوكول تلطيخ بإضافة callose سينسيز المانع الجلوكوز 2-D-ديوكسي (نائب المدير العام) إلى المخزن المؤقت تلطيخ. وهكذا، ويشمل هذا البروتوكول قياس callose موجودة من قبل فقط في المنطقة السفلى من التحتفلقي هذا هو بالضبط ما تحت موقع قطع. تجنب استخدام prepar طازجةإد الأنيلين الأزرق، والحفاظ على حل أزرق الأنيلين في RT مدة لا تقل عن 48 ساعة قبل استخدامها. لاحظنا أن تلطيخ مع الأنيلين النقي حل الأزرق لا يعطي أفضل النتائج callose تلطيخ.

وعموما، قدمنا ​​مجموعة من الاستراتيجيات التي يمكن استخدامها لفحص السريع للالمسوخ / الإفراط في التعبير خطوط مع استجابة مدار المعيبة أو تعززها تغيير PD SEL عن طريق تحوير مباشر أو غير مباشر callose PD. حقيقة في وقت سابق عن ردود استوائية اقتصر مجورلي لعمل شركات أوكسين واللاعبين يشير، مثل PINIOD 2-14. وبالإضافة إلى ذلك، أنشأنا أيضا دورا حاسما في حركة symplasmic من أوكسين في الحفاظ على التدرج أوكسين في النظام التحتفلقي 15. البساطة وبراعة هذا الأسلوب بلا شك يعزز فائدتها في التحقيق في الجينات المرشحة لتنظيمها من PD SEL، وبالتالي تلعب دورا حيويا في تطوير المصنع، بما في ذلك ردود استوائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم الافصاحات.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا (جبهة الخلاص الوطني، 2015R1A2A1A10053576)، ومنحة من برنامج الجيل التالي من BioGreen 21 (SSAC، منح PJ01137901)، إدارة التنمية الريفية، وجمهورية كوريا. ودعمت RK، WS، ABB وDK من الدماغ كوريا 21 زائد برنامج (BK21 +).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) Sigma H1529-1G Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose Dongin-Genomic GEL001-500G Used for HPTS agarose block
Microwave oven LG-Goldstar Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask Dong Kwang A0205 Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm) SPL life sciences SPL10035 Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples 
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm) Marienfeld Laboratory Glassware 101222 Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm SPL life sciences SPL11125 Plates to make MS agar medium
Scissors Germany Stainless HSB 942-11 Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture Duchefa P10453.01 MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Bioshop 3G30212 To make MS media.
Plant agar Duchefa P1001.1000 To solidify MS media.
Autoclave ALP CL-40L
Shaker Wise Mix SHO-1D To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips Sorenson 10040
1 ml pipette BioPette L-1101-2
Surgical tape MIcropore 1530-0 To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue) Sigma M5528-25G Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine Bioshop GLN001 Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG Sigma D8375-1G Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope Olympus FV1000MPE SIM To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer  I lab  K400 To mix media solution.
Aluminium foil SW cooking foil To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite Samjin Industry To surface-sterilized seeds

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. Experimental biology monographs. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204 (1937).
  2. Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
  3. Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
  4. Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
  5. Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
  6. Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
  7. Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
  8. Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883 (2006).
  9. Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
  10. Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
  11. Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
  12. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
  13. Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
  14. Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
  15. Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
  16. Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
  17. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 110،
استراتيجية للتحقق من دور بوساطة Callose Plasmodesmal المحاصرة في الاستجابة مدار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, R., Wu, S. W., Iswanto, A. B. … More

Kumar, R., Wu, S. W., Iswanto, A. B. B., Kumar, D., Han, X., Kim, J. Y. A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response. J. Vis. Exp. (110), e53513, doi:10.3791/53513 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter