توضح هذه المقالة الطرق لفحص الجينات السيطرة على نفاذية plasmodesmal والتدرج بالتالي أوكسين خلال استجابة مدار. وهذا يشمل قياس درجة استجابة استوائية في التحتفلقي من thaliana نبات الأرابيدوبسيس وفحص النفاذية plasmodesmal بواسطة حامض 8 hydroxypyrene-1،3،6-trisulfonic (HPTS) التحميل وتقييم مستوى callose أخيرا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استراتيجية للتحقق من دور بوساطة Callose Plasmodesmal المحاصرة في الاستجابة مدار
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وأوكسين هرمون النبات يلعب دورا هاما في كثير من عمليات النمو والتنموية، بما في ذلك ردود استوائية للضوء والجاذبية. إنشاء التدرج أوكسين هو الحدث الرئيسي مما أدى إلى توجه ضوئي وانتحاء أرضي. سابقا، وقد أظهرت النقل أوكسين القطبي (PAT) لإنشاء التدرج أوكسين في المجالات الخلوية المختلفة من النباتات. ومع ذلك، هان آخرون في الآونة الأخيرة أظهرت أن لتشكيل أوكسين التدرج السليم، plasmodesmal بوساطة callose الاتصال symplasmic بين الخلايا المجاورة هو أيضا عاملا حاسما. في هذه المخطوطة، واستراتيجية لإلقاء الضوء على دور جينات معينة، والتي يمكن أن تؤثر على توجه ضوئي وانتحاء أرضي عن طريق تغيير الربط symplasmic من خلال تحوير تركيب callose plasmodesmal، ومناقشتها. الخطوة الأولى هي لفحص ردود مدار الشاذة من الشتلات etiolated عمرها 3 أيام من المسوخ أو خطوط الإفراط في التعبير عن الجينات جنبا إلى جنب مع نوع البرية. هذا الفرز الأولييمكن أن يؤدي إلى تحديد مجموعة من الجينات تعمل في PAT أو السيطرة على الربط symplasmic. ويشمل الفحص الثاني في فرز المرشحين التي تظهر استجابات استوائية المتغيرة التي تؤثر على الربط symplasmic. للتصدي لهؤلاء المرشحين، تم فحص حركة التتبع symplasmic وترسب callose plasmodesmal. ان هذه الاستراتيجية أن تكون مفيدة لاستكشاف الجينات المرشحة الجديدة التي يمكن أن تنظم الربط symplasmic مباشرة أو بشكل غير مباشر من خلال ردود استوائية والعمليات التنموية الأخرى.
المقدمة
النباتات، والكائنات الحية لاطئة، وضعت شبكة متطورة للغاية من الإشارات من خلية إلى خلية لمعالجة المحفزات البيئية المختلفة. ردود استوائية هي واحدة من الظواهر التي النباتات تستجيب للمؤثرات البيئية. تظهر النباتات ردين مدار الرئيسية، توجه ضوئي وانتحاء أرضي. النباتات الضوئي تنحني باتجاه مصدر الضوء التي توجه ضوئي لحصاد الطاقة القصوى. وبالمثل، انتحاء أرضي يجعل النباتات تنمو في اتجاه مركز الجاذبية. الآلية الأساسية التي تؤدي إلى مثل هذه الردود استوائية تتضمن تشكيل التدرج غير المتماثلة من هرمون نباتي أوكسين 1. فعل تشكيل أوكسين التدرج المحلي يتميز أيضا؛ الجينات التي تشارك في هذه الآلية توفر خارطة طريق لعمل هرمون 2-8. م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. فحص المسوخ مع غيرت موجه ضوئيا وGravitropic الردود
- إعداد 1X Murashige وسكوغ (MS) متوسطة، ودرجة الحموضة 5.7، مع 0.8٪ اجار يوم واحد قبل التجربة.
- إضافة 800 مل من الماء المقطر المزدوج إلى 2 لتر مخروطي قارورة واثارة مع شريط مغناطيسي.
- إضافة 4.4 غرام من الملح MS إلى دورق مخروطي.
- إضافة 0.5 غرام من 2- (N-Morpholino) الإيثان حمض السلفونيك (MES) ويحرك حتى يذوب ك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في الإعداد الحالي، ديكساميثازون (التنفيذ المباشر) -inducible خطوط رني من AtGSL8 [الآخرة dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر / -dex)] استخدمت، كما gsl8 متماثل المسوخ T-DNA الإدراج والشتلات فتكا 18. تعرضت الشتلات etiolated منذ ثلاثة أيام مع dsGSL8 ونوع الشتلات البرية مع التنفيذ المباشر ± للمؤثرات موجه ضوئيا وgravitropic. وجدنا أن dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر) شتلة كانت معيبة في توجه ضوئي وانتحاء أرضي 15.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه المخطوطة، ووضع استراتيجية للكشف خطوط متحولة / الإفراط في التعبير التي هي معيبة في الردود موجه ضوئيا وgravitropic بسبب callose PD تغييرها، وبالتالي يوصف PD SEL في التفاصيل. ويتم إنجاز PD التوليف callose وتدهور بشكل رئيسي من قبل synthases callose وβ-1،3-Glucanases، ولكن يتم التحكم تنظيم هذه الانزيمات من قبل العديد من العوامل المنبع. للبحث عن هذه العوامل المنبع أو المرشحين التي تشارك مباشرة في تنظيم PD، أنشأنا هذه الطريقة لفرزها. وضع هذا الأمر لديه بعض قيود المسوخ بعض الإنزيما.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم الافصاحات.
شكر وتقدير
وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا (جبهة الخلاص الوطني، 2015R1A2A1A10053576)، ومنحة من برنامج الجيل التالي من BioGreen 21 (SSAC، منح PJ01137901)، إدارة التنمية الريفية، وجمهورية كوريا. ودعمت RK، WS، ABB وDK من الدماغ كوريا 21 زائد برنامج (BK21 +).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| HPTS (8-هيدروكسي بيرين -1،3،6-ملح ثلاثي الصوديوم بحمض تري سلفونيك) | Sigma | H1529-1G | صبغة الفلورسنت كمتتبع سمبالي |
| LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | تستخدم لفرن |
| الميكروويف | LG-Goldstar | آلة لغلي هلام الاغاروز | |
| 100 مل قارورة زجاجية مخروطية | الشكل Dong Kwang | A0205 | تستخدم لغلي HPTS agarose طبق بتري جل |
| (35 مم × 10 مم) | SPL10035 | علوم الحياة SPL | تستخدم لصنع كتل HPTS agarose وغسل عينات النباتات ؛ |
| شرائح غطاء المجهر والشرائح الزجاجية (24 مم × 50 مم) | الأواني الزجاجية لمختبر مارينفيلد | 101222 | تستخدم في كتل HPTS agarose وإعداد العينات المجهرية |
| MS المتوسطة 125 مم × 125 مم × 20 مم | علوم الحياة SPL | SPL11125 لصنع MS أجار مقص متوسط | |
| ألمانيا غير القابل للصدأ | HSB 942-11 | تستخدم لاستئصال منطقة الخطاف من عينات النبات | |
| Murashige و Skoog (MS) خليط الملح القاعدي | Duchefa | P10453.01 | MS متوسط بما في ذلك الفيتامينات. |
| (N-morpholino) حمض الإيثان سلفونيك (MES) أحادي الهيدرات | Bioshop | 3G30212 | لصنع وسائط MS. |
| أجار النبات | Duchefa | P1001.1000 | لترسيخ وسائط MS. |
| الأوتوكلاف | ALP | CL-40L | |
| شاكر | وايز ميكس | SHO-1D | لغسل المخزن المؤقت للتلطيخ الأزرق الأنيلين وصبغة HPTS بطريقة هادئة. |
| 1 مل أطراف زرقاء | سورنسون | 10040 | |
| 1 مل ماصة | BioPette | L-1101-2 | |
| شريط جراحي | MIcropore | 1530-0 | لإغلاق لوحة MS |
| أنيلين أزرق (أزرق ميثيل) | Sigma | M5528-25G | يستخدم لتحضير عازلة تلطيخ الأنيلين الأزرق. |
| يستخدم Glycine | Bioshop | GLN001 | لتحضير مخزن تلطيخ الأنيلين الأزرق. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | يستخدم لتثبيط سينسيز الكالوز. |
| المجهر متحد البؤر | أوليمبوس | FV1000MPE SIM | للتحقق من تلطيخ الأنيلين الأزرق ونتيجة تحميل صبغة HPTS. |
| النمام | أنا مختبر | K400 | لخلط حل الوسائط. |
| رقائق الألومنيوم | SW رقائق | لتغليف الأطباق في حالة مظلمة. | |
| هيبوكلوريت الصوديوم | Samjin | للبذور المعقمة على السطح |
المراجع
- Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. Experimental biology monographs. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204(1937).
- Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
- Christe....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
