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Biology

एक रणनीति रेखा प्रतिक्रिया में callose की मध्यस्थता Plasmodesmal गेटिंग की भूमिका को मान्य करने के लिए

Published: April 17, 2016 doi: 10.3791/53513
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1
1Division of Applied Life Science (BK21 plus program), Plant Molecular Biology and Biotechnology Research Center, Gyeongsang National University, 2Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख जीन रेखा प्रतिक्रिया के दौरान plasmodesmal पारगम्यता और इसलिए auxin ढाल को नियंत्रित करने के लिए स्क्रीनिंग तरीकों का वर्णन है। इस hypocotyl में रेखा प्रतिक्रिया की डिग्री के माप शामिल Arabidopsis thaliana और से 8 hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic एसिड (HPTS) लोड हो रहा है और अंत में callose स्तर का आकलन plasmodesmal पारगम्यता की जाँच की।

Abstract

संयंत्र हार्मोन auxin कई विकास और विकास की प्रक्रिया, प्रकाश और गुरुत्वाकर्षण के लिए रेखा प्रतिक्रियाओं सहित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक auxin ढाल की स्थापना एक महत्वपूर्ण घटना phototropism और Gravitropism के लिए अग्रणी है। इससे पहले, ध्रुवीय auxin परिवहन (पीएटी) पौधों की विभिन्न सेलुलर डोमेन में एक auxin ढाल स्थापित करने के लिए दिखाया गया था। हालांकि, हान एट अल। हाल ही में प्रदर्शन किया है कि उचित auxin ढाल गठन के लिए, plasmodesmal callose की मध्यस्थता सन्निकट कक्षों के बीच symplasmic कनेक्टिविटी भी एक महत्वपूर्ण कारक है। इस पांडुलिपि में, रणनीति विशेष जीन है, जो plasmodesmal callose संश्लेषण के माध्यम से नियमन symplasmic कनेक्टिविटी बदलकर phototropism और Gravitropism प्रभावित कर सकते हैं की भूमिका स्पष्ट करने के लिए, चर्चा में है। पहले कदम के जंगली प्रकार के साथ म्यूटेंट या एक जीन की अधिक अभिव्यक्ति लाइनों के 3 दिन पुरानी पौध etiolated से न्यायपालिका रेखा प्रतिक्रियाओं स्क्रीन है। यह प्रारंभिक जांचपीएटी में कार्य कर या symplasmic कनेक्टिविटी को नियंत्रित करने के जीन की एक श्रृंखला की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। दूसरी स्क्रीनिंग के उम्मीदवारों कि symplasmic कनेक्टिविटी को प्रभावित करने से बदल रेखा प्रतिक्रियाओं को दिखाने की छँटाई शामिल है। ऐसे उम्मीदवारों को संबोधित करने के लिए, एक symplasmic दरियाफ्त की आवाजाही और plasmodesmal callose के बयान की जांच की गई। इस रणनीति के नए उम्मीदवार जीन है कि रेखा के हिमायती और अन्य विकास की प्रक्रिया के दौरान प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप symplasmic कनेक्टिविटी विनियमित कर सकते हैं पता लगाने के लिए उपयोगी होगा।

Introduction

पौधों, बिना डंठल रहने वाले जीवों के रूप में, सेल करने वाली कोशिका संकेतन के एक उच्च परिष्कृत नेटवर्क विभिन्न पर्यावरण उत्तेजनाओं को संबोधित करने के लिए विकसित किया है। रेखा की प्रतिक्रियाएं घटना है जिसके द्वारा पौधों पर्यावरण उत्तेजनाओं का जवाब में से एक हैं। पौधों दो मुख्य रेखा प्रतिक्रियाएं, phototropism और Gravitropism दिखा। संश्लेषक पौधों phototropism द्वारा प्रकाश स्रोत की ओर मोड़ अधिकतम ऊर्जा फसल के लिए। इसी तरह, Gravitropism गुरुत्वाकर्षण केंद्र की ओर बढ़ने के लिए पौधों बनाता है। मौलिक तंत्र ऐसी रेखा प्रतिक्रियाओं के लिए अग्रणी phytohormone auxin 1 की विषम ढाल गठन शामिल है। स्थानीय auxin ढाल गठन का कार्य अच्छी तरह से होती है; जीन है कि इस तंत्र में शामिल हैं हार्मोन कार्रवाई 2-8 के लिए एक रूपरेखा प्रदान करते हैं। ऐसे पिन का गठन (पिन) के रूप में auxin तपका वाहक, और पी ग्लाइकोप्रोटीन की विशिष्ट स्थिति है, दाता कोशिकाओं 9,10 के सेल की दीवार को कोशिका द्रव्य से auxin के आंदोलन को कार्यान्वित। एफurthermore, सक्रिय एच + / आई ए ए symport ऐसे AUX1 / लक्ष्मण परिवार प्रोटीन के रूप में auxin तांता वाहक, की गतिविधि के द्वारा, auxin अंत में आसन्न रिसीवर कोशिकाओं 2,11,12 के लिए दिया जाता है। auxin के इस दिशात्मक आंदोलन ध्रुवीय auxin परिवहन (पीएटी) के रूप में जाना जाता है। पैट विभिन्न विकास के चरणों के दौरान और विभिन्न पर्यावरण उत्तेजनाओं 13,14 के जवाब में एक अंतर है auxin वितरण होता है। इसके अलावा, स्थानीयकरण या इन auxin तांता या तपका वाहक से किसी की अभिव्यक्ति में व्यवधान पीएटी में गंभीर परिवर्तन, जो auxin ढाल के विघटन का कारण बनता है, विकास दोष के लिए अग्रणी की ओर जाता है। हाल ही में, हान एट अल। खबर दी है कि plasmodesmal विनियमन भी auxin ढाल 15 बनाए रखने के लिए आवश्यक है। तिथि करने के लिए, 30 से अधिक plasmodesmal प्रोटीन 16 की पहचान की गई है। इन प्रोटीनों के बीच, AtGSL8 plasmodesmata (पीडी) पर callose संश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण एंजाइम के रूप में सूचित किया गया है और इसलिए Maint में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता हैपीडी आकार अपवर्जन सीमा (एसईएल) aining। दमित AtGSL8 अभिव्यक्ति एक विकृत auxin ढाल पैटर्न जंगली प्रकार पौध 15 के विपरीत कोई रेखा प्रतिक्रिया के लिए अग्रणी में हुई।

इस पांडुलिपि में, तरीकों नए उम्मीदवार जीन है कि पीडी नियमन में शामिल कर रहे हैं प्रदान की जाती हैं पता लगाने के लिए। AtGSL8 के रूप में यह एक महत्वपूर्ण एंजाइम callose जैवसंश्लेषण पीडी के लिए योगदान है, इन तरीकों का परीक्षण करने के लिए एक मॉडल के रूप में प्रोटीन का इस्तेमाल किया गया था। Gsl8 नाक आउट म्यूटेंट 17 के अंकुर-मारक के कारण, dexamethasone (डेक्स) -inducible आरएनएआई लाइनों एक पूर्व प्रकाशित रिपोर्ट के अनुसार 15 में इस्तेमाल किया गया। यहाँ प्रदान की रणनीति जीन है कि hypocotyl रेखा प्रतिक्रिया पीडी एसईएल द्वारा नियंत्रित में फंसा रहे हैं स्क्रीन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

बदल Phototropic और Gravitropic प्रतिक्रियाओं के साथ म्यूटेंट की स्क्रीनिंग 1.

  1. प्रयोग से पहले 0.8% अगर एक दिन के साथ 1x Murashige और Skoog (एमएस) मध्यम, पीएच 5.7, तैयार करें।
    1. एक 2 एल शंक्वाकार फ्लास्क को दोहरा आसुत जल के 800 मिलीलीटर जोड़ें और एक चुंबकीय पट्टी के साथ हलचल।
    2. एमएस नमक की 4.4 ग्राम शंक्वाकार फ्लास्क में जोड़े।
    3. 2- (एन morpholino) ईथेन sulphonic एसिड (एमईएस) के 0.5 ग्राम जोड़ें और हलचल जब तक नमक के सभी पूरी तरह से भंग कर रहे हैं।
    4. 1 एम KOH के साथ 5.7 के लिए माध्यम की पीएच को समायोजित करें।
    5. एक जन सिलेंडर के लिए माध्यम के स्थानांतरण और DDH 2 ओ के साथ 1 एल के लिए अंतिम मात्रा लाने
    6. एक 2 एल शंक्वाकार फ्लास्क में मध्यम वापस डालो और संयंत्र अगर की 8 ग्राम जोड़ें।
    7. कसकर शंक्वाकार कुप्पी के मुंह लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ।
    8. 121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई में एमएस मध्यम और DDH 2 हे 15 मिनट के लिए आटोक्लेव, और autoclaving के बाद, एक 60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और DDH 2 हे आरटी पर रखने में मध्यम।
    9. 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के बाद, 125 x 125 x 20 मिमी 3 वर्ग प्लेटों में मध्यम एक लामिना का प्रवाह बेंच पर (प्रत्येक थाली में 50 मिलीलीटर) डालना।
    10. अगर प्लेटें आंशिक रूप से खुला रखने से लगभग 1 घंटे के लिए आरटी पर जमना करने की अनुमति दें। प्लेटों तुरंत इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, तो उन्हें एक फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक की चादर और स्टोर का उपयोग करके सील।
  2. 1.1% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ बीज सतह बाँझ और उस खंड 1.1 में तैयार किए गए 1x एमएस अगर प्लेटों पर बीज डॉट।
    नोट:। इधर, Arabidopsis thaliana {कर्नल-0 बीज, dsGSL8 (कर्नल-0)} 15 रेखा प्रतिक्रिया, callose धुंधला और HPTS लोड हो रहा है Arabidopsis thaliana {कर्नल -0 और dsGSL8 (कर्नल-0) ईएमएस उत्परिवर्ती} बीज (के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं अप्रकाशित) चित्रा 2 में रेखा प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किया जाता है।
    1. एक बोतल में DDH 2 हे की 300 मिलीलीटर आटोक्लेव।
    2. प्रत्येक पृष्ठभूमि के लिए लगभग एक सौ बीज जोड़ें, यानी,उत्परिवर्ती / अधिक अभिव्यक्ति लाइन और जंगली प्रकार (कर्नल-0) के बीज, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब।
    3. एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से 1x एमएस अगर प्लेट बाहर ले जाओ और एक आंशिक रूप से खुले स्थान में एक लामिना का प्रवाह बेंच पर उन्हें सूखी।
    4. बीज सतह बाँझ एक 0.2X ब्लीच समाधान (1.1% सोडियम हाइपोक्लोराइट) के 1 मिलीलीटर जोड़कर और 5 मिनट के लिए 250 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर microcentrifuge ट्यूबों रहते हैं।
    5. बीज गंभीरता से नीचे के लिए व्यवस्थित और फिर micropipette द्वारा ब्लीच समाधान दूर करते हैं।
    6. ताजा DDH 2 हे (autoclaved) बीज के 1 मिलीलीटर जोड़ें और microcentrifuge ट्यूब कई बार inverting द्वारा अच्छी तरह मिला लें। बीज फिर से बसने और फिर पानी को दूर करते हैं।
    7. दोहराएँ कदम 1.2.6 5-6 बार।
    8. बीज कि अंतिम धोने के बाद छोड़ दिया गया की मात्रा के लिए पानी की मात्रा दोगुनी जोड़ें।
    9. डॉट एक अर्द्ध सूखे 1x एमएस अगर 1 मिलीलीटर micropipette बीज के 200 μl युक्त टिप का उपयोग कर प्लेट पर निष्फल बीज (मेंसमेत पानी)।
      1. दो बीज और दो पंक्तियों के बीच बीज 1.8 सेमी की एक न्यूनतम के बीच लगभग एक 0.1 सेमी की दूरी रखें। वर्ग प्लेट (125 x 125 x 20 मिमी 3) प्रति पांच क्षैतिज पंक्तियों में बीज डॉट। पानी थाली पर ढक्कन रखने से पहले थोड़ा शुष्क करने की अनुमति दें।
    10. सर्जिकल टेप के साथ प्लेटें सील, प्लेटों के सभी खड़ी हो चुकी है, और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटो।
    11. (प्रकाश के लिए पहुँच नहीं) के साथ एक अंधेरे बॉक्स में लिपटे प्लेटों स्थानांतरण। फिर, 3 दिनों के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस कमरा / फ्रिज में अंधेरे बॉक्स रखने के लिए।
    12. इस कदम से शुरू, अपरिवर्तित प्लेटों की दिशा में रहते हैं। ठंडे उपचार के 3 दिन बाद, अगले 3 दिनों के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर एक संयंत्र संस्कृति के कमरे में अंधेरा बॉक्स रखने के लिए। 3 दिनों के बाद, एक अंधेरे कमरे में हरे रंग की रोशनी के तहत बीज के अंकुरण की स्थिति की जांच।
      नोट: आमतौर पर 3 दिन पुरानी कर्नल -0 etiolated पौध लंबाई में 1.6 सेमी तक बढ़ सकता है।
  3. बदल phototropic एक विश्लेषणम्यूटेंट में या एक विशेष जीन की तर्ज अधिक अभिव्यक्ति एन डी gravitropic प्रतिक्रिया। एक अंधेरे कमरे में हरे रंग की रोशनी के तहत सीधे पौध ही समान आकार और खड़ी उगाया का चयन करें। एक ताजा 1x एमएस अगर एक निष्फल दंर्तखोदनी के टिप का उपयोग करने के लिए चयनित प्लेट पौध स्थानांतरण।
    1. धीरे किसी भी अन्य भागों को छूने के बिना उनकी hypocotyl के निम्नतम भाग से पौध का चयन करें। सुनिश्चित करें कि पौध के सभी एक ही गर्भदल / हुक उन्मुखीकरण है सुनिश्चित करें, और स्थानांतरित होने के बाद, अंकुर हुक के उन्मुखीकरण ही रहते है। प्रत्येक पंक्ति में प्रत्येक पृष्ठभूमि और आगे के विश्लेषण के लिए हर समय बिंदु के लिए दो प्लेटों की एक न्यूनतम के 20 पौध की एक न्यूनतम का प्रयोग करें।
      नोट: चार अलग अलग पृष्ठभूमि प्रत्येक प्लेट (4 पंक्तियों) में तुलना की जा सकती।
      वैकल्पिक: dexamethasone का उपयोग करते हैं (डेक्स) -inducible आरएनएआई / अधिक अभिव्यक्ति लाइनों, एक 1x एमएस करने के लिए ऊपर पौध हस्तांतरण (1x एमएस युक्त थाली, 0.8% अगर मध्यम 20 माइक्रोन के डेक्स के साथ पूरक) के लिए + डेक्स एमएस प्लेट के साथ थालीआर 3 घंटा और अंधेरे बॉक्स में खड़ी प्लेटों रहते हैं।
    2. phototropic प्रतिक्रिया की जाँच करने के लिए, केवल एक ही पक्ष खोला साथ एक ब्लैक बॉक्स के ऊपर करने के लिए खड़ी प्लेटों हस्तांतरण। एकतरफा सफेद रोशनी के साथ एक संयंत्र के विकास के चैम्बर के लिए प्लेटों युक्त ब्लैक बॉक्स स्थानांतरण। एकतरफा प्रकाश सुनिश्चित करने के लिए, प्रकाश स्रोत (नहीं सामने की ओर) की ओर प्लेट के किनारे जगह है। चित्रा 1 में सेटअप का संदर्भ लें।
    3. इसी तरह, gravitropic प्रतिक्रिया की जाँच करने के लिए खड़ी स्थानांतरित कर पौध के साथ प्लेट रखने के लिए, और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर। इसके बाद, 90 डिग्री करने के लिए खड़ी की थाली की ओर रुख बदल सकते हैं और यह सभी पक्षों से कवर किया ब्लैक बॉक्स के अंदर रखने के लिए। चित्रा 1 में सेटअप का संदर्भ लें।
    4. दिए गए समय के अंक के बाद, (आमतौर पर 1.5 घंटे, 3 घंटा, 6 घंटा, और 12 घंटा) प्लेटें एक स्कैनर के साथ स्कैन, और जेपीईजी प्रारूप में चित्रों को बचाने के।
    5. उपाय ImageJ सॉफ्टवेयर (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) का उपयोग पौध के झुकने कोण (छविUre 2)।
      1. डबल क्लिक (2A चित्रा) द्वारा ImageJ प्रोग्राम प्रारंभ करें।
        नोट: प्रमुख उपकरण है कि कोण माप में इस्तेमाल किया गया चित्रा 2 बी में दिखाया जाता है।
      2. "फाइल" विकल्प उप विकल्प "खुले" ImageJ उपकरण पट्टी में, और खुले चित्रों जेपीईजी फ़ाइल स्वरूप में सहेजा रेखा झुकने कोण (चित्रा -2) को मापने के द्वारा पीछा किया पर क्लिक करें।
      3. , छोड़ दिया है या सही माउस बटन पर क्लिक क्रमशः के रूप में चित्रा 2 बी में दिखाया द्वारा चित्र पर में या बाहर ज़ूम करने के लिए आवर्धक उपकरण पर क्लिक करें।
      4. खींचें और चित्र (चित्रा 2 डी) .Next की स्थिति के लिए स्क्रॉल उपकरण क्लिक करें, झुकने (चित्रा 2 ई) के कोण को मापने के लिए कोण उपकरण पर क्लिक करें।
        1. मूल hypocotyl बढ़ रही दिशा बिंदु 'ए', झुकने दीक्षा बिंदु 'बी' (चित्रा 2 एफ), के लिए माउस खींचें और बाएं बट क्लिक पर एक डबल क्लिक करें छोड़ दिया बनाओपर पहली पंक्ति (चित्रा 2 जी) आकर्षित करने के लिए।
        2. झुकने अंत बिंदु 'सी' के लिए बिंदु बी से माउस खींचें, और दूसरी लाइन (चित्रा 2H) आकर्षित करने के लिए छोड़ दिया बटन पर क्लिक करें और एक निश्चित फार्म कोण ए नोट: यह सच है झुकने कोण है कोण बी, जो 180 डिग्री के बराबर है - कोण ए (चित्रा 2 एफ)।
        3. उपाय और रिकॉर्ड कोण कीबोर्ड पर 'एम' दबाने से एक। के रूप में चित्रा 2I में दिखाया परिणाम फ़ाइल अलग से खुल जाएगा। उपाय और एक एक करके पौध एक के सभी रिकॉर्ड है। उदाहरण के लिए, पहली उत्परिवर्ती लाइनों के लिए कर्नल-0 से hypocotyls के सभी के लिए झुकने के कोण को मापने के लिए और फिर।
    6. स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए ImageJ से डाटासेट स्थानांतरण ए वी बनाने के लिएप्रत्येक पृष्ठभूमि के कोण झुकने की erage।
    7. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, सांख्यिकीय परीक्षण के परिणाम, मानक त्रुटि सलाखों और संभावना मूल्यों (चित्रा 2 देखें) सहित के साथ एक बार ग्राफ चित्र बनाने।
      1. सच झुकने की गणना कोण बी, और एक सूत्र डिजाइन स्प्रेडशीट का उपयोग कर, यानी, कोण बी = 180 ° - कोण एक नोट: कोण एक मूल्य है कि ImageJ विश्लेषण से प्राप्त किया गया है।
      2. औसत झुकने कोण को मापने कोण प्रत्येक पृष्ठभूमि का उपयोग स्प्रेडशीट उपकरण (चित्रा 2J) के लिए बी।
      3. स्प्रेडशीट "सूत्र" उपकरण (चित्रा 2J) का उपयोग कर प्रत्येक माप के लिए प्रतिकृति के बीच मानक विचलन का विश्लेषण।
      4. हस्ताक्षर टेस्टऔसत झुकने कोण और गणना के रूप में उपर्युक्त मानक विचलन मूल्यों के लिए एक टी परीक्षण को लागू करने से परिणाम की nificance।
      5. एक बार आरेख ड्रा ऊपर मूल्यों का उपयोग रेखांकन स्प्रेडशीट "डालें" उपकरण (चित्रा 2K) का उपयोग कर दो अलग अलग पृष्ठभूमि के बीच झुकने कोण में मात्रात्मक अंतर का प्रतिनिधित्व करने के लिए।
        नोट: मजबूत उम्मीदवार जीन की उत्परिवर्ती / अधिक अभिव्यक्ति लाइनों, ऐसी कोई झुकने के रूप में जंगली प्रकार के संबंध में स्पष्ट मतभेद, दिखा सकते हैं तेजी से झुकने या धीमी गति से झुका।

2. स्क्रीन संयंत्र एक बदल पीडी callose स्तर के साथ पीडी एसईएल में परिवर्तन के कारण के साथ दोषपूर्ण रेखा जवाब लाइन्स

  1. 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic पर HPTS agarose ब्लॉक के साथ पौध की शीर्ष एसिड (HPTS) डाई लोड करके एक hypocotyl लोड हो रहा है परख प्रदर्शन और तुलना डाई का आंदोलन उत्परिवर्ती के बीच / अधिक अभिव्यक्ति लाइन्स और कर्नल -0।
    1. HPTS agaro तैयारhypocotyl लोड हो रहा है परख के लिए एसई ब्लॉकों।
      1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में DDH 2 हे के 10 मिलीलीटर ले लो और agarose की 0.1 ग्राम जोड़ने के लिए एक 1% agarose जेल तैयार करने के लिए। रुक-रुक कर झटकों के साथ 1-2 मिनट के लिए एक माइक्रोवेव ओवन में agarose उबाल लें, और इसे 5 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
      2. HPTS के 50 मिलीग्राम 1% agarose समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें, और मिश्रण अच्छी तरह से जब तक समाधान हरे रंग बदल जाता।
      3. एक 10 मिमी पेट्री डिश के लिए ऊपर मिश्रण डालो, और यह 15 मिनट के लिए जमना करने की अनुमति।
      4. एक तेज विच्छेदन ब्लेड के साथ agarose जम HPTS कट छोटे agarose ब्लॉक (0.5 x 2 सेमी 2) बनाने के लिए।
    2. HPTS डाई लोड हो रहा है परख के लिए संयंत्र के नमूने तैयार करें।
      1. HPTS डाई लोड परख के लिए एक मंच सेट करें; एक खुर्दबीन के कवर स्लाइड (24 x 50 मिमी 2) एक नए एमएस मध्यम प्लेट पर जगह के रूप में चित्रा 3 ए में दिखाया गया है।
      2. आबकारी हुक के आधार से 3 दिन पुरानी पौध etiolated एक तेज शल्य कैंची का उपयोग कर।
      3. तुरंत हीइस तरह है कि छांटना स्थिति से hypocotyl का केवल 0.5 सेमी कवर स्लाइड पर रहना चाहिए में एक सूक्ष्म कवर कांच की सतह के ऊपर पौध (प्रत्येक पृष्ठभूमि से 5 पौध की एक न्यूनतम) हस्तांतरण, और hypocotyl के बाकी को छूना चाहिए माध्यम के रूप में चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।
      4. इस तरह है कि excised क्षेत्र HPTS agarose ब्लॉक छू में 5 मिनट के लिए (एक excised हुक के साथ) hypocotyl के शीर्ष पर HPTS agarose ब्लॉक रखें।
      5. लोडिंग के 5 मिनट के बाद, hypocotyl सतह से agarose ब्लॉक को हटाने, 10 मिमी पेट्री डिश के लिए DDH 2 हे युक्त hypocotyls हस्तांतरण और निरंतर झटकों के साथ 15 मिनट के लिए DDH 2 हे में hypocotyls धो लें।
    3. Confocal माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने तैयार।
      1. लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के तहत निगरानी के लिए प्रत्येक पृष्ठभूमि से 5 पौध की एक न्यूनतम का चयन करें।
      2. लेजर चैनल में, विशिष्ट exc के लिए 488 एनएम के तरंग दैर्ध्य सेटitation और बैंड पास उत्सर्जन के लिए 500 से 550 एनएम।
      3. DDH 2 ओ से धोने के बाद एक नया सूक्ष्म स्लाइड करने के लिए 2 सेट में स्थानांतरण पौध (एक कर्नल-0 + एक उत्परिवर्ती) स्लाइड करने के लिए डबल आसुत जल के 100-150 μl जोड़ें, और एक कवर स्लाइड के साथ कवर किया। confocal खुर्दबीन के मंच करने के लिए स्लाइड Shift।
      4. hypocotyl क्षेत्र (एक 20X या 40X उद्देश्य लेंस के साथ) फोकस उज्ज्वल क्षेत्र (सफेद प्रकाश) रोशनी का उपयोग कर। फिर, प्रतिदीप्ति के लिए स्लाइड स्कैन।
      5. 10 सेट की एक न्यूनतम के लिए छवियों को ले लो, और लदान की बात से डाई आंदोलन की हद तक की जाँच करके दो पृष्ठभूमि की तुलना करें।
        नोट: बदल symplasmic आंदोलन के साथ उत्परिवर्ती / अधिक अभिव्यक्ति लाइनों जंगली प्रकार कर्नल-0 की तुलना में डाई लोड के विभिन्न पैटर्न में दिखाई देंगे।
  2. विश्लेषण उत्परिवर्ती में callose स्तर / अधिक अभिव्यक्ति लाइन्स बदल Phototropic और Gravitropic रिस्पांस दिखा और दिखा अलग HPTS डाई आंदोलन comparएड कर्नल -0 करने के लिए।
    1. एनिलिन नीले callose धुंधला डाई तैयार करें।
      1. Autoclaved DDH 2 ओ में 1 एम ग्लाइसिन, पीएच 9.5 और 0.1% (डब्ल्यू / वी) एनिलिन नीले बनाओ
      2. 3 मात्रा अनुपात: 0.1% एनिलिन नीले और 1 एम 2 में ग्लाइसिन के मिश्रण से धुंधला बफर बनाओ। उदाहरण के लिए, धुंधला बफर के 50 मिलीलीटर के लिए, 1 एम ग्लाइसिन की 30 मिलीलीटर 20 0.1% एनिलिन नीले रंग की मिलीलीटर और ले। नोट: धुंधला 48 घंटा का उपयोग करें और अंधेरे में यह स्टोर करने के लिए पहले की एक न्यूनतम बफर बनाओ।
    2. दाग मुड़ा हुआ या गैर मुड़ा हुआ callose विशेष एनिलिन नीले रंग के साथ पौध।
      1. धुंधला प्रक्रिया के दौरान नए सिरे से callose संश्लेषण को बाधित करने के लिए, धुंधला बफर के 50 मिलीलीटर 1.5 मिमी 2-Deoxy-डी ग्लूकोज (डीडीजी) के अंतिम मात्रा में जोड़ें।
      2. callose धुंधला के साथ (या रेखा प्रतिक्रिया के बिना) के लिए 3 दिन पुरानी पौध etiolated ले लो।
      3. पतली शल्य कैंची का उपयोग कर अपने हुक क्षेत्र से पौध कट।
      4. एक छोटे से पेट्री डिश में पौध स्थानांतरण शामिलएक दंर्तखोदनी के टिप का उपयोग कर धुंधला बफर के 2 मिलीलीटर हैैं।
      5. 30 rpm पर निरंतर झटकों के साथ 2 घंटे के लिए अंधेरे में धुंधला बफर के साथ पौध सेते हैं।
      6. धुंधला के बाद, अतिरिक्त बफर धुंधला दूर करने के लिए 2 मिनट के लिए DDH 2 हे के साथ पौध धो लें।
      7. लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के तहत निगरानी के लिए प्रत्येक संयंत्र पृष्ठभूमि के लिए 5 पौध की एक न्यूनतम का चयन करें।
    3. confocal माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने तैयार:
      1. सेट में पौध स्थानांतरण (एक कर्नल-0 + एक उत्परिवर्ती) माइक्रोस्कोप साफ करने के लिए DDH 2 ओ से धोने के बाद स्लाइड
      2. DDH 2 हे के 100-150 μl जोड़ें और एक कवर स्लाइड के साथ कवर। confocal खुर्दबीन के मंच करने के लिए स्लाइड Shift।
      3. एक लेजर चैनल में, विशिष्ट उत्तेजना के लिए 405 एनएम और एनिलिन नीली रोशनी की इमेजिंग के लिए 500 से 550 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य निर्धारित किया है।
      4. 10X और देर से ध्यान में hypocotyl क्षेत्र लाओ, पहले20X या 40x उद्देश्य उज्ज्वल क्षेत्र (सफेद प्रकाश) रोशनी का उपयोग कर लेंस के साथ आर।
      5. फिर, प्रकाश फ़िल्टर पर स्विच प्रतिदीप्ति के लिए स्लाइड स्कैन, और छवियों को बचाने के लिए।
      6. ImageJ सॉफ्टवेयर (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) के साथ callose संकेत तीव्रता को मापने (चित्रा 4 देखें)।
        1. जेपीईजी फ़ाइल स्वरूप के लिए ओलिंप छवि बाइनरी स्वरूप (* .oib) से confocal माइक्रोस्कोपी चित्रों का स्वरूप परिवर्तित। नोट: केवल जेपीईजी प्रारूप ImageJ सॉफ्टवेयर के द्वारा समर्थित है।
        2. डबल क्लिक (चित्रा 4 ए) द्वारा ImageJ प्रोग्राम प्रारंभ करें। नोट: तीर आयत उपकरण का संकेत callose तीव्रता माप (चित्रा 4 बी) में इस्तेमाल किया जाएगा।
        3. "फाइल" विकल्प उप विकल्प "खुले" ImageJ उपकरण पट्टी में, और खुले माइक्रोस्कोपी चित्रों है कि जेपीईजी फ़ाइल स्वरूप में बच गए callose तीव्रता (चित्रा 4C) को मापने के लिए के द्वारा पीछा किया पर क्लिक करें।
        4. भारतीय सैन्य अकादमी पर आयताकार आइकन पर क्लिक करेंGej उपकरण पट्टी (चित्रा 4D)।
        5. , संकेत तीव्रता का विश्लेषण चित्र पर कर्सर खींचें और क्षेत्र का चयन करने के लिए जांच की जानी (चित्रा 4E)
        6. उपाय और कीबोर्ड (चित्रा 4E) पर 'एम' दबाने से संकेत तीव्रता के लिए संख्यात्मक मान रिकॉर्ड है। नोट: परिणाम फ़ाइल अलग (चित्रा 4F) खुल जाएगा।
        7. उपाय और रिकॉर्ड तीव्रता प्रत्येक संयंत्र पृष्ठभूमि से पौध के सभी के लिए एक के बाद एक महत्व देता है।
          नोट: ImageJ में, परिणाम फ़ाइल "मीन" चयनित "क्षेत्र" का संकेत तीव्रता इंगित करता है।
      7. ImageJ परिणाम फ़ाइल से मतलब मूल्यों की प्रतिलिपि बनाएँ, और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट फ़ाइल में पेस्ट करें।
      8. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, मानक त्रुटि सलाखों और संभावना मूल्यों (चित्रा 4) सहित सांख्यिकीय परीक्षण के साथ एक बार ग्राफ चित्र बनाने।
        1. औसत संकेत तीव्रता को मापनेस्प्रेडशीट "सूत्र" उपकरण (चित्रा 4 जी) का उपयोग कर प्रत्येक पृष्ठभूमि के लिए (ImageJ से मतलब है)।
        2. स्प्रेडशीट "सूत्र" उपकरण (चित्रा 4 जी) का उपयोग कर प्रत्येक माप के लिए प्रतिकृति के बीच मानक विचलन का विश्लेषण।
        3. मानक त्रुटि (एसई) thespreadsheet "सूत्र" उपकरण का उपयोग कर की गणना।
          नोट: एसई = एस / √ n, जहां (एस) की आबादी का मानक विचलन है, और (एन) नमूने का आकार (टिप्पणियों की संख्या) है।
        4. औसत संकेत तीव्रता और गणना के रूप में उपर्युक्त मानक त्रुटि मूल्यों के लिए एक टी परीक्षण को लागू करने से परिणाम के महत्व का परीक्षण करें।
        5. एक बार ग्राफ आरेख ड्रा ऊपर मूल्यों का उपयोग रेखांकन स्प्रेडशीट "डालें" उपकरण (चित्रा 4H) का उपयोग कर दो अलग अलग पृष्ठभूमि के बीच callose स्तर में मात्रात्मक अंतर का प्रतिनिधित्व करने के लिए।
          नोट: मजबूत उम्मीदवारों की उत्परिवर्ती / अधिक अभिव्यक्ति लाइनों जाएगा रोंकैसे अलग ऐसी कोई callose, थोड़ा callose या हाइपर पीडी callose संचय के रूप में जंगली प्रकार की तुलना में callose का स्तर।

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Representative Results

मौजूदा सेटअप में, dexamethasone (डेक्स) -inducible आरएनएआई AtGSL8 की तर्ज [इसके बाद dsGSL8 (+ डेक्स / -dex)] का इस्तेमाल किया गया है, के रूप homozygous gsl8 टी डीएनए प्रविष्टि म्यूटेंट घातक 18 अंकुर रहे हैं। DsGSL8 और ± डेक्स के साथ जंगली प्रकार पौध की तीन दिन पुरानी पौध etiolated phototropic और gravitropic उत्तेजनाओं से अवगत कराया गया। हमने पाया है कि dsGSL8 (+ डेक्स) पौध phototropism और Gravitropism 15 में दोषपूर्ण थे। चित्रा 5 स्पष्ट रूप से पता चलता है कि dsGSL8 (+ डेक्स) कोई दोनों phototropism और Gravitropism के प्रभाव में झुकने को दर्शाती है। इसके अलावा, dsGSL8 (+ डेक्स) और dsGSL8 (-dex) या कर्नल-0 में symplasmic आंदोलन में परिवर्तन एक HPTS लोड हो रहा है परख द्वारा विश्लेषण किया गया था। हमारे पिछले निष्कर्ष के अनुरूप, dsGSL8 में HPTS डाई आंदोलन (+ डेक्स) dsGSL8 (-dex) या कर्नल-0 की तुलना में काफी अधिक व्यापक था, के रूप में चित्र में दिखाया गया है 6. callose पीडी एसईएल के प्रमुख नियामकों से एक है, और AtGSL8 एक पीडी callose synthase 16 के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, callose एनिलिन नीले धुंधला बाहर किया गया था, और dsGSL8 (+ डेक्स) लगातार रूप में चित्रा 7 में दिखाया गया है, पहले और रेखा प्रतिक्रियाओं के बाद एक कम पीडी callose स्तर से पता चला है।

आकृति 1
चित्रा 1 फ्लो कदम है कि phototropic और gravitropic प्रतिक्रियाओं की उत्तेजना में शामिल हैं के चार्ट। (ए) स्थानांतरण खड़ी विभिन्न संयंत्र पृष्ठभूमि से एक थाली करने के लिए, लेकिन अलग लाइनों में पौध उगाई। (बी) phototropism के लिए, एक अंधेरे बॉक्स है कि एक तरफ खोला जाता है में एकतरफा सफेद प्रकाश की ओर का सामना करना पड़ प्लेटों रहते हैं। Gravitropism के लिए, पहली एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों को कपड़े में लपेटकर 90 डिग्री बारी बारी से, और (covere एक अंधेरे बॉक्स के लिए स्थानांतरणघ सभी पक्षों से)। (सी) एक स्कैनर का उपयोग करते हुए, इस तरह के 1.5 घंटे, 3 घंटा, 6 घंटा और 12 घंटा के रूप में अलग-अलग समय के अंतराल के बाद प्लेटों स्कैन। (डी और ई) इन पैनलों स्प्रेडशीट फ़ाइलों का उपयोग ImageJ और डेटा विश्लेषण से डाटा बनाने दिखाने के लिए, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. ImageJ द्वारा झुकने कोण की माप। (ए) डबल क्लिक करके छवि जम्मू कार्यक्रम देखें। (बी) के प्रमुख उपकरण है कि कोण माप में इस्तेमाल किया गया। (सी) "फ़ाइल" विकल्प है कि जेपीईजी फ़ाइल स्वरूप में बच गए माइक्रोस्कोपी चित्रों को खोलने के लिए उप-विकल्प छवि जम्मू उपकरण पट्टी में "खुले" के बाद खोलें। (डी (एफ) कोण की माप की रूपरेखा: कोण एबीसी एक निश्चित परिभाषित करता है कोण ए, और सच झुकने कोण के रूप में गणना की जाती है कोण बी, जो 180 डिग्री के बराबर है - कोण ए (G) लाइन बिंदु बी बिंदु से दूरी का प्रतिनिधित्व। लाइन की (एच) निरंतरता एबी बात करने के लिए ग बनाने कोण ए (आई) छवि जम्मू दिखाने का परिणाम फ़ाइल कोण एक कीमत। (जम्मू) प्रतिनिधि स्प्रेडशीट फ़ाइल स्टेन औसत झुकने कोण माप प्रदर्शितदर्द विचलन, मानक त्रुटियों और टी परीक्षण गणना। (कश्मीर) बार ग्राफ आरेख दो अलग अलग पृष्ठभूमि संयंत्र कर्नल -0 और dsGSL8 ईएमएस उत्परिवर्ती बीच झुकने कोण माप प्रदर्शित। त्रुटि सलाखों SEM (मतलब + की मानक त्रुटि) कर रहे हैं और *** टी परीक्षण (पी मूल्य> 0.001) द्वारा महत्व को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. कदम है कि HPTS लोड हो रहा है परख में शामिल कर रहे हैं की रूपरेखा। (ए) HPTS agarose ब्लॉक की तैयारी दिखा कक्ष। (बी) के पैनल छांटना और पौध के हस्तांतरण और HPTS agarose ब्लॉकों की लोडिंग का प्रतिनिधित्व। (सी) पैनल कदम है कि नमूने में शामिल कर रहे हैं प्रदर्शितconfocal इमेजिंग के लिए तैयार करना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. ImageJ द्वारा callose तीव्रता का मापन। (ए) डबल क्लिक करके ImageJ कार्यक्रम देखें। (बी) के प्रमुख उपकरण है कि callose तीव्रता माप में इस्तेमाल किया गया। (सी) "फ़ाइल" विकल्प है कि जेपीईजी फ़ाइल स्वरूप में बच गए माइक्रोस्कोपी चित्रों को खोलने के लिए उप-विकल्प ImageJ उपकरण पट्टी में "खुले" के बाद खोलें। (डी) ImageJ उपकरण पट्टी पर आयताकार आइकन। (ई) callose तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए छवि के चयनित क्षेत्र। (एफ) ImageJ परिणाम फ़ाइल "मीन" के रूप में callose तीव्रता मूल्य प्रदर्शित। (G)प्रतिनिधि स्प्रेडशीट फ़ाइल औसत callose तीव्रता माप, मानक विचलन, मानक त्रुटियों और टी परीक्षण गणना प्रदर्शित। (एच) बार ग्राफ आरेख दो संयंत्र पृष्ठभूमि के बीच callose तीव्रता अंतर को दर्शाता है। त्रुटि सलाखों SEM (मतलब + की मानक त्रुटि) कर रहे हैं और *** टी परीक्षण (पी मूल्य> 0.001) द्वारा महत्व को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. AtGSL8 अभिव्यक्ति की कमी रेखा प्रतिक्रियाओं दोषपूर्ण हो जाती है। (ए) Phototropic प्रतिक्रिया dsGSL8 से पता चला है (डेक्स ±) के साथ कर्नल-0। (बी) Gravitropic प्रतिक्रिया dsGSL8 (डेक्स ±) द्वारा दिखाए गए अल ओंग कर्नल -0। dsGSL8 (+ डेक्स) के साथ कोई phototropic या gravitropic प्रतिक्रियाओं से पता चलता है। dsGSL8 (+ डेक्स) और dsGSL8 (-dex) का प्रतीक है dexamethasone का इलाज और इलाज dsGSL8 -inducible आरएनएआई लाइनों, क्रमशः। स्केल पट्टी 0.2 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 symplasmic आंदोलन AtGSL8। प्रतिदीप्ति छवियों जंगली प्रकार कर्नल-0 के साथ ± डेक्स hypocotyl कटौती सतहों dsGSL8 को HPTS लदान के बाद लिया गया था के दमन के बाद वृद्धि हुई है। DsGSL8 (+ डेक्स) HPTS डाई की अधिक व्यापक आंदोलन से पता चला है, प्रदर्शन में वृद्धि हुई symplasmic आंदोलन। स्केल पट्टी 0.2 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है।com / फ़ाइलें / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. AtGSL8 दबा लाइनों hypocotyl के प्रबुद्ध और छायांकित पक्षों के बीच सममित पीडी callose वितरण दिखाया। (ए) प्रतिदीप्ति 0 घंटा पर dsGSL8 (-dex) के लिए एनिलिन नीले callose धुंधला दिखा छवि। (बी) प्रतिदीप्ति phototropism के 6 घंटे के बाद dsGSL8 (-dex) के लिए एनिलिन नीले callose धुंधला दिखा छवि। (सी) प्रतिदीप्ति छवि phototropism के 6 घंटे के बाद dsGSL8 (+ डेक्स) के लिए एनिलिन नीले callose धुंधला दिखा। पीले तीर hypocotyl की छायांकित क्षेत्र पर callose संचय संकेत मिलता है। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) बार ग्राफ आरेख बजे का प्रतिनिधित्वपीडी callose कि dsGSL8 में जमा (डेक्स ±) पहले और phototropism के 3 घंटा और 6 घंटे के बाद hypocotyls के ount। प्रतिदीप्ति तीव्रता foci दस स्वतंत्र hypocotyls से मापा गया (;, छात्र की टी परीक्षण * पी <0.01 डेटा ± एसडी मतलब कर रहे हैं)। यह आंकड़ा से संशोधित किया गया है (हान एट अल।, 2014) 15। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, एक रणनीति उत्परिवर्ती / अधिक अभिव्यक्ति लाइनों बदल पीडी callose और इसलिए, पीडी एसईएल विस्तार से वर्णन किया गया है, के कारण phototropic और gravitropic प्रतिक्रिया में खराब कर रहे हैं स्क्रीन करने के लिए। पीडी callose संश्लेषण और गिरावट मुख्य रूप से callose synthases और β-1,3-Glucanases द्वारा पूरा किया है, लेकिन इन एंजाइमों के नियमन के कई अपस्ट्रीम कारकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इस तरह के अपस्ट्रीम कारकों या उम्मीदवारों जो सीधे पीडी नियमन में शामिल कर रहे हैं खोजने के लिए, हम स्क्रीनिंग के लिए इस विधि का गठन किया है। इस सेट अप के रूप में कुछ सीमाएं हैं विनियमित करने पीडी callose जैवसंश्लेषण (gsl8) कुछ प्रमुख एंजाइमों की म्यूटेंट घातक 15 कर रहे हैं और इस तरह के म्यूटेंट इस सेट अप के द्वारा सीमित किया जाएगा सुलझाने के लिए। इसके अलावा, अगर उम्मीदवार जीन तेज या खुली या बंद पीडी के साथ धीमी रेखा प्रतिक्रिया से पता चलता है, लेकिन callose स्तर अपरिवर्तित रहता है, तो विस्तृत विश्लेषण के आगे इस तरह के उम्मीदवारों को चिह्नित करने की जरूरत है। महत्वपूर्ण कारक है और समस्या निवारण प्रक्रियाप्रत्येक चरण में sses भी सविस्तार हैं। सबसे पहले, मध्यम तैयार करने में एक महत्वपूर्ण कारक है कि संयंत्र के विकास को प्रभावित कर सकते हैं मीडिया, जो 5.7-5.8 से लेकर चाहिए की पीएच है। दूसरा, अगर प्लेट की उचित सतह सुखाने महत्वपूर्ण है; यह उच्च पानी सामग्री के साथ अगर प्लेट से किसी भी क्षति के बिना 3 दिन पुरानी पौध उठाने के लिए मुश्किल होगा। हालांकि, अगर प्लेट की बहुत ज्यादा सुखाने ऊष्मायन के दौरान मीडिया में कुछ दरारें कारण और विषम अंकुर विकास में हो सकता है। सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान का उपयोग बीज की सतह नसबंदी के दौरान, देखभाल, autoclaved DDH 2 हे के साथ दोहराव धोने से पूरी तरह से सोडियम हाइपोक्लोराइट दूर करने के लिए लिया जाना चाहिए, क्योंकि यह एक मजबूत विरंजन एजेंट है। Autoclaved DDH 2 हे हौसले से तैयार किया जाना चाहिए और aseptically संभाला, के रूप में पुराने शेयरों एमएस प्लेटों में फंगल संक्रमण का कारण बन सकता है। नसबंदी के बाद, बीज उपचार ठंड से स्तरीकृत रहे हैं अंकुरण सिंक्रनाइज़ करने के लिए। इस प्रक्रिया transferrin द्वारा या तो किया जा सकता हैजी सीधे अंधेरे की स्थिति या पहले एमएस प्लेटों पर बीज इलाके और फिर अंधेरे की स्थिति में एक ठंडे कमरे के लिए प्लेटों के हस्तांतरण में एक ठंडे कमरे को गीला बीज निष्फल। हालांकि, हम उत्तरार्द्ध क्योंकि यह पौध की एक और अधिक समान विकास देता है पसंद करते हैं। बीज इलाके जबकि, दो आसन्न बीज के बीच की दूरी की वजह से बहुत बारीकी से अटे बीज अंकुर, जो बाद के प्रयोगों में स्थानांतरण करने के लिए बहुत मुश्किल हो जाता है ओवरलैपिंग के विकास में नतीजा होगा कम से कम 0.1 सेमी की होनी चाहिए।

उचित phototropic और gravitropic प्रतिक्रियाओं के लिए, पौध प्रकाश के संपर्क में नहीं किया जाना चाहिए और undamaged रहना चाहिए। सफेद रोशनी की पृष्ठभूमि के प्रभाव से बचने के लिए सावधानी से अंधेरे कमरे में एक हरे रंग का प्रकाश स्रोत के तहत पौध का चयन पौधों हरी बत्ती का जवाब नहीं है। ग्रीन प्रकाश स्रोत पारदर्शी हरी विनाइल शीट का उपयोग कर सफेद प्रकाश स्रोत को कवर द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। पौध के चयन के लिए, एक निष्फल दंर्तखोदनी सबसे अच्छा विकल्प है। को स्पर्श वेंई दंर्तखोदनी के साथ hypocotyl का बहुत कम हिस्सा पौध उठाने के लिए इतना है कि वे आसानी से एक नई प्लेट को हस्तांतरित किया जा सकता है। पौध के सभी आकार और हुक अभिविन्यास में समान होना चाहिए। हमारे प्रयोगों के दौरान हमने देखा है कि अगर हुक दिशा प्रकाश स्रोत के विपरीत दिशा में है, पौधों प्रकाश स्रोत के रूप में एक ही हुक दिशा के साथ पौधों की तुलना में तेजी रेखा प्रतिक्रिया दिखाएगा। आम तौर पर, phototropism के मामले में, एक सच्चे उम्मीदवारों और कर्नल-0 के बीच झुकने कोण में एक स्पष्ट अंतर 3 घंटा के भीतर देख सकते हैं, जबकि Gravitropism के मामले में, यह आमतौर पर 6-12 मानव संसाधन लेता है। अंत में, सांख्यिकीय प्रासंगिक डेटा, तीन जैविक प्रतिकृति और 20 पौध हर बार की जरूरत है की एक न्यूनतम है।

विभिन्न संयंत्र पृष्ठभूमि के बीच symplasmic आंदोलन की हद तक का परीक्षण करने के लिए, HPTS डाई लोड हो रहा है यह अत्याधुनिक उपकरणों और इंस्ट्रूमेंटेशन की जरूरत नहीं है के रूप में, एक सुविधाजनक तकनीक है। HPTS लोड हो रहा है परख के लिए, जी का प्रतिशतके रूप में एक बहुत भंगुर या हार्ड जेल इष्टतम परिणाम नहीं दे HPTS agarose ब्लॉक में ईएल, बहुत महत्व का है। यह ढीला रबर के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क का उपयोग करें और पानी की 10 मिलीलीटर के साथ agarose उबलते के लिए एक बड़ी मात्रा कुप्पी का उपयोग नहीं करने के लिए बेहतर है। HPTS agarose ब्लॉक तैयारी के बाद एक सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे रखा। HPTS लोड हो रहा है परख में एक अन्य महत्वपूर्ण कारक hypocotyl हुक क्षेत्र के छांटना है। छांटना तेज विच्छेदन कैंची के साथ और पौध सभी के लिए एक समान स्थिति में किया जाना चाहिए। कुंद कैंची से काटना पौध को अवांछित नुकसान हो सकता है और HPTS लोडिंग बाधा कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, अंकुर विकास की स्थिति और विकास के चरणों, डाई आंदोलन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है के रूप में callose संचय अधिक इस तरह के बदलाव, जो अंत में डाई आंदोलन में बाधा के लिए खाते में करने के लिए प्रतिक्रिया की संभावना है। इस प्रकार, इष्टतम स्थितियों के तहत पौध से बढ़ आवश्यक है। पीडी पर callose में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता हैपीडी एसईएल, जो auxin ढाल गठन 15 के लिए महत्वपूर्ण है विनियमन द्वारा etiolated पौध की रेखा के हिमायती हैं। Callose स्तरों एनिलिन नीले या immunogold लेबलिंग के साथ धुंधला द्वारा पता लगाया जा सकता है। एनिलिन नीले रंग के साथ धुंधला callose स्तर का पता लगाने के लिए एक सरल और तेजी से विधि है। क्योंकि hypocotyl कोशिकाओं उच्च स्फीत दाब और एक महामारी छल्ली परत है, यह डाई कोशिकाओं घुसना करने के लिए आसान नहीं है। इसलिए, हम एनिलिन नीले रंग की डाई आसानी से घुसना करने के लिए अनुमति देने के लिए कट-धुंधला विधि विकसित की है। हालांकि, वहाँ नए callose कि धुंधला परिणाम है, जो सामान्य callose धुंधला विधि की एक सीमा है प्रभावित कर सकते हैं के संश्लेषण के लिए एक खतरा है। इस तरह के प्रभाव से बचने के लिए, धुंधला प्रोटोकॉल धुंधला बफर callose synthase अवरोध 2-डी-डिओक्सी ग्लूकोज (डीडीजी) जोड़कर संशोधित किया गया है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल केवल hypocotyl है कि वास्तव में कटौती साइट नीचे के निचले क्षेत्र में पूर्व मौजूदा callose की माप शामिल है। हौसले prepar के प्रयोग से बचेंएड एनिलिन नीले, और 48 घंटा पहले का उपयोग करने का एक न्यूनतम के लिए आरटी पर एनिलिन नीले समाधान रखें। हमने देखा है कि ताजा एनिलिन नीले समाधान साथ धुंधला इष्टतम callose धुंधला परिणाम देना नहीं है।

कुल मिलाकर, हम रणनीति है कि प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप नियमन पीडी callose द्वारा पीडी एसईएल बदलकर एक दोषपूर्ण या बढ़ाया रेखा प्रतिक्रिया के साथ म्यूटेंट / अधिक अभिव्यक्ति लाइनों की तेजी से जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक सेट प्रस्तुत किया है। रेखा प्रतिक्रियाओं के बारे में पहले तथ्य यह मुख्यत: ऐसे PINIOD 2-14 के रूप में auxin वाहक और संकेत खिलाड़ियों की कार्रवाई करने के लिए प्रतिबंधित किया गया था। इसके अलावा, हम भी hypocotyl प्रणाली 15 में एक auxin ढाल बनाए रखने में auxin की symplasmic आंदोलन का एक महत्वपूर्ण भूमिका की स्थापना की है। सादगी और इस विधि की चंचलता निस्संदेह पीडी एसईएल के अपने नियमन के लिए उम्मीदवार जीन की जांच कर रही है, जिससे रेखा प्रतिक्रियाओं सहित संयंत्र के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका, खेलने में इसकी उपयोगिता को सुदृढ़।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रकटीकरण है।

Acknowledgments

इस शोध कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ-2015R1A2A1A10053576) द्वारा समर्थित किया गया था, और अगली पीढ़ी के Biogreen 21 कार्यक्रम से अनुदान द्वारा (SSAC, PJ01137901 अनुदान), ग्रामीण विकास प्रशासन, कोरिया गणराज्य। आरके, था, एबीबी और डीके ब्रेन कोरिया 21 प्लस कार्यक्रम (BK21 +) द्वारा समर्थित थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) Sigma H1529-1G Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose Dongin-Genomic GEL001-500G Used for HPTS agarose block
Microwave oven LG-Goldstar Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask Dong Kwang A0205 Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm) SPL life sciences SPL10035 Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples 
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm) Marienfeld Laboratory Glassware 101222 Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm SPL life sciences SPL11125 Plates to make MS agar medium
Scissors Germany Stainless HSB 942-11 Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture Duchefa P10453.01 MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Bioshop 3G30212 To make MS media.
Plant agar Duchefa P1001.1000 To solidify MS media.
Autoclave ALP CL-40L
Shaker Wise Mix SHO-1D To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips Sorenson 10040
1 ml pipette BioPette L-1101-2
Surgical tape MIcropore 1530-0 To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue) Sigma M5528-25G Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine Bioshop GLN001 Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG Sigma D8375-1G Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope Olympus FV1000MPE SIM To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer  I lab  K400 To mix media solution.
Aluminium foil SW cooking foil To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite Samjin Industry To surface-sterilized seeds

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 110, Plasmodesmata (पीडी) callose auxin tropism hypocotyl symplasmic आंदोलन एनिलिन नीले 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic एसिड (HPTS) उत्परिवर्ती
एक रणनीति रेखा प्रतिक्रिया में callose की मध्यस्थता Plasmodesmal गेटिंग की भूमिका को मान्य करने के लिए
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Kumar, R., Wu, S. W., Iswanto, A. B. B., Kumar, D., Han, X., Kim, J. Y. A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response. J. Vis. Exp. (110), e53513, doi:10.3791/53513 (2016).

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