En strategi for å validere rolle Callose-mediert Plasmodesmal gating i Tropic Response

Summary

Denne artikkelen beskriver metoder for screening av gener som kontrollerer plasmodesmal permeabilitet og dermed auxin gradient i løpet av tropisk respons. Dette omfatter måling av graden av tropisk respons i hypocotyl av vårskrinneblom og sjekke plasmodesmal permeabilitet ved 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonsyre (HPTS) lasting og endelig callose nivå vurdering.

Abstract

Anlegget hormon auxin spiller en viktig rolle i mange vekst- og utviklingsmessige prosesser, inkludert tropisk respons på lys og tyngdekraft. Etableringen av en auxin gradient er en viktig hendelse som fører til fototropisme og gravitropism. Tidligere ble polar auxin transport (PAT) vist seg å etablere en auxin-gradient i forskjellige cellulære domener av planter. Imidlertid Han et al., Nylig vist at for riktig auxin-gradient i formasjonen, er plasmodesmal callose-mediert symplasmic tilkobling mellom de tilstøtende cellene også en kritisk faktor. I dette manuskriptet, med strategien belyse rollen som bestemte gener som kan påvirke fototropisme og gravitropism ved å endre symplasmic tilkobling gjennom moduler plasmodesmal callose syntese, er diskutert. Det første trinnet er å skjerme avvikende tropic svar fra tre dager gamle etiolated frøplanter av mutanter eller over-uttrykk linjer av et gen sammen med villtypen. Denne foreløpige screeningkan føre til identifisering av en rekke gener fungerer i PAT eller kontrollerende symplasmic tilkobling. Den andre screening innebærer sortering av kandidater som viser endrede tropiske svar ved å påvirke symplasmic tilkobling. For å løse slike kandidater, ble bevegelsen av en symplasmic tracer og deponering av plasmodesmal callose undersøkt. Denne strategien vil være nyttig for å utforske nye kandidatgener som kan regulere symplasmic tilkobling direkte eller indirekte under tropiske svar og andre utviklingsprosesser.

Introduction

Planter, som fastsittende levende organismer, har utviklet et meget sofistikert nettverk av celle-til-celle-signalisering for å håndtere ulike miljømessige stimuli. Tropiske reaksjoner er en av de fenomener ved hvilke planter reagerer på miljømessige stimuli. Planter viser to hoved tropiske svar, fototropisme og gravitropism. Fotosyntese planter bøye mot lyskilden ved fototropisme å høste maksimal energi. Tilsvarende gravitropism gjør plantene til å vokse mot tyngdepunkt. Den grunnleggende mekanisme som fører til slike tropiske responser omfatter asymmetrisk gradient dannelse av auxin phytohormone ^1. Det å lokal auxin gradient formasjonen er vel preget; gener som er involvert i denne mekanismen gir et veikart for hormon handling ^2-8. Den spesifikke stilling av auxin-effluks-bærere, som for eksempel PIN-FORMED (PIN), og P-glykoproteiner, utfører bevegelsen av auxin fra cytoplasma til celleveggen av donorceller ^9,10. Furthermore, av den aktive H ⁺ / IAA symport aktivitet av auxin-tilstrømnings bærere som AUX1 / LAX familieproteiner, auxin blir til slutt levert til de tilstøtende mottakercellene ^2,11,12. Denne retningsbestemt bevegelse av auxin er kjent som polar auxin transport (PAT). PAT fører til en differensial auxin fordeling ved forskjellige utviklingsstadier, og som respons på forskjellige miljømessige stimuli ^13,14. Videre er det avbrudd i lokalisering eller ekspresjon av hvilken som helst av disse auxin-tilstrømningen eller efflux bærere fører til alvorlig endring i PAT, noe som fører til en forstyrrelse av auxin gradient, som fører til utviklingsdefekter. Nylig, Han et al. rapportert at plasmodesmal regulering er også nødvendig for å opprettholde auxin gradient ^15. Hittil har mer enn 30 plasmodesmal proteiner blitt identifisert ^16. Blant disse proteinene har AtGSL8 blitt rapportert som et viktig enzym for callose syntese på plasmodesmata (PD) og dermed spiller en viktig rolle i maintinnelukker PD størrelse utelukkelse grense (SEL). Trykt AtGSL8 uttrykk resulterte i en forvrengt auxin gradient mønster som fører til ingen tropisk respons i motsetning til villtype frøplanter ^15.

I dette manuskriptet, til metoder utforske nye kandidat gener som er involvert i PD regulering er gitt. AtGSL8 ble anvendt som en modell for å teste protein disse metodene, fordi det er et viktig enzym som bidrar til PD callose biosyntese. På grunn av den frøplante-dødelighet av gsl8 knock-out mutanter ^17, ble deksametason (dex) -inducible RNAi linjer brukes i samsvar med en tidligere utgitt rapport ^15. Strategien gitt her kan tilpasses for å screene gener som er involvert i hypocotyl tropisk reaksjon styres av PD SEL.

Protocol

1. Screening av mutanter med endret phototropic og Gravitropic Responses

1. Forbered 1x Murashige og Skoog (MS) Medium, pH 5,7, med 0,8% Agar One Day før forsøket.
   1. Legg 800 ml dobbeltdestillert vann i en 2 liters konisk kolbe og omrørt med en magnetstav.
   2. Legg 4,4 g MS-salt til den koniske kolben.
   3. Tilsett 0,5 g 2- (N-morfolino) etan-sulfonsyre (MES) og omrør inntil alle saltene er fullstendig oppløst.
   4. Juster pH i mediet til 5,7 med 1 M KOH.
   5. Overfør medium til en masse sylinder og bringe sluttvolumet til 1 liter med DDH ₂ O.
   6. Hell tilbake det medium i en 2 liters konisk kolbe og tilsett 8 g av plante agar.
   7. Vikle munningen av den koniske kolben tett med aluminiumsfolie.
   8. Autoklaver MS medium og DDH ₂ O i 15 minutter ved 121 ° C, 15 psi, og etter autoklavering, holder mediet i en 60 ° C inkubator og DDH ₂ O ved RT.
   9. Etter avkjøling til 60 ° C, helles mediet i 125 x 125 x 20 mm ³ firkantede plater på en laminær strømning benk (50 ml i hver plate).
   10. Tillat agar å stivne ved romtemperatur i ca. 1 time ved å holde platene delvis åpen. Hvis platene ikke brukes umiddelbart, forsegle dem ved hjelp av plastfolie og oppbevar ved 4 ° C i kjøleskap.
2. Surface-sterilisere frøene med 1,1% natriumhypokloritt og prikk frøene på 1x MS agar plater som ble utarbeidet i avsnitt 1.1.
   Merk: Her vårskrinneblom {Col-0 seeds, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ brukes til tropisk respons, callose farging og HPTS Arabidopsis thaliana {Col-0 og dsGSL8 (Col-0) EMS mutant} frø (lasting. upublisert) brukes for tropisk respons på figur 2.
   1. Autoklav 300 ml DDH ₂ O i en flaske.
   2. Tilsett ca ett hundre frø for hver bakgrunn, dvs.mutant / overekspresjon linje og villtype (Col-0) frø, til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
   3. Ta ut 1x MS agar plater fra en 4 ° C kjøleskap og tørke dem på en laminær benk i en delvis åpen posisjon.
   4. Overflate-sterilisere frøene ved å tilsette 1 ml av en 0,2 x blekemiddel (1,1% natriumhypokloritt) og holde mikrosentrifugerør på risteapparat ved 250 rpm i 5 min.
   5. La frøene bosette til bunnen av tyngdekraften, og deretter fjerne blekemiddel løsning ved mikropipette.
   6. Tilsett 1 ml friskt DDH ₂ O (autoklavert) til frøene og bland godt ved å snu mikrosentrifugerør flere ganger. La frøene bosette igjen og deretter fjerne vannet.
   7. Gjenta trinn 1.2.6 5-6 ganger.
   8. Legg doble mengden av vann til volumet av frøene som var igjen etter siste vask.
   9. Dot de steriliserte frø på en semi-tørket 1x MS agar plate med en 1 ml mikropipette tips som inneholder 200 mL av frø (ikludert vann).
      1. Hold ca 0,1 cm avstand mellom to frø og minst 1,8 cm mellom to frø rader. Dot frøene i fem horisontale rader per firkantet plate (125 x 125 x 20 mm ^3). La vannet for å tørke litt før plassering av lokket på platen.
   10. Forsegle platene med kirurgisk tape, stables alle platene vertikalt, og vikle med aluminiumsfolie.
   11. Overfør innpakket platene til en mørk boks (uten tilgang til lys). Deretter holder den mørke boksen i et 4 ° C rom / kjøleskap i 3 dager.
   12. Med utgangspunkt i dette trinn holde retningen av platene uendret. Etter 3 dager med kulde behandling, holde den mørke boksen i et anlegg kultur rom ved 22 ° C for de neste 3 dagene. Etter 3 dager, sjekk spiring status av frøene i henhold grønt lys i et mørkt rom.
       MERK: Vanligvis tre dager gamle Col-0 etiolated frøplanter kan vokse opp til 1,6 cm i lengde.
3. Analyser endret phototropic ennd gravitropic respons i mutanter eller over-uttrykk linjer av et bestemt gen. Velg bare tilsvarende størrelse og vertikalt vokst rette frøplanter henhold grønt lys i et mørkt rom. Overfør valgte frøplanter til en frisk 1x MS agar plate med spissen av en sterilisert tannpirker.
   1. Velg forsiktig frøplantene fra den laveste delen av deres hypocotyl uten å berøre andre deler. Sørg for at alle spirene har samme cotyledon / krok orientering, og etter overføring, at orienteringen av frøplante kroker forblir den samme. Bruker et minimum av 20 stiklinger for hver bakgrunn i hver rad, og et minimum av to plater for hvert tidspunkt for videre analyse.
      Merk: Fire forskjellige bakgrunner kan sammenlignes i hver plate (4 rader).
      Valgfritt: Mens du bruker deksametason (dex) -inducible RNAi / over-uttrykk linjer, overføre de ovennevnte spirene til en 1x MS plate sammen med + Dex MS plate (plate som inneholder 1x MS, 0,8% agar medium supplert med 20 mikrometer dex) for 3 timer og holde platene vertikalt i mørk boks.
   2. For å sjekke phototropic respons, overføre de ovennevnte platene vertikalt til en svart boks med bare én side åpnet. Overfør den sorte boksen som inneholder plater til et plantevekstkammer med unilateral hvitt lys. For å sikre ensidig lys, plassere kanten av platen mot lyskilden (ikke forsiden). Se oppsett i figur 1.
   3. Tilsvarende, for å sjekke gravitropic respons, holde platene med overførte frøplanter vertikale, og dekk med aluminiumsfolie. Deretter endrer plate orientering vertikalt til 90 ° og holde den inne i svart boks dekket fra alle kanter. Se oppsett i figur 1.
   4. Etter de gitte tidspunkter, (vanligvis 1,5 time, 3 timer, 6 timer, og 12 timer) skanne platene med en skanner, og lagre bilder i JPEG format.
   5. Mål bøyevinkel av frøplanter ved hjelp ImageJ programvare (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2).
      1. Start ImageJ programmet ved å dobbeltklikke (figur 2A).
         Merk: De store verktøyene som ble brukt i vinkelmålingen er vist i figur 2B.
      2. Klikk på "fil" alternativet etterfulgt av sub-alternativ "åpne" i verktøylinjen ImageJ, og åpne bilder som er lagret i JPEG-format for å måle tropic bøyevinkel (figur 2C).
      3. Klikk på forstørrelsesglasset for å zoome inn eller ut på bildet ved å klikke på venstre eller høyre museknapp, henholdsvis som vist i figur 2B.
      4. Klikk rulleverktøyet til å dra og plassere bildet (figur 2D) .Neste, klikker vinkel verktøy for å måle vinkelen på bøying (figur 2E).
         1. Lag en dobbel venstre klikk på den opprinnelige hypocotyl voksende retning punkt 'a', dra musen til å bøye initiering punktet "b" (figur 2F), og klikk venstre rumpepå å trekke den første linje (figur 2G).
         2. Dra musen fra punkt b for å bøye endepunktet 'c', og klikk på venstre knapp for å trekke den andre linjen (figur 2 H) og danner en fast A. Merk: Den sanne bøyevinkelen er B, som er lik 180 ° - A. (figur 2F).
         3. Mål og rekord En ved å trykke 'M' på tastaturet. Resultatet Filen åpnes separat som vist i Figur 2I. Mål og registrere alt av frøplanter én etter én. For eksempel, først måle bøyevinkel for alle de hypocotyls fra Col-0 og deretter for mutante linjer.
   6. Overfør datasett fra ImageJ til regneark fil for å gjøre det avnomsnittlig av bøyevinkler for hver bakgrunn.
   7. For kvantitativ analyse, lage et søylediagram diagram med statistiske testresultater, inkludert standard feilfelt og sannsynlighetsverdier (se figur 2).
      1. Beregn den sanne bøying B, og utforme en formel ved hjelp av regneark, dvs. B = 180 ° - En lapp: A er den verdi som ble avledet fra ImageJ analyse.
      2. Mål gjennomsnittlig bøyevinkel B for hver bakgrunns bruker regnearkverktøy (Figur 2J).
      3. Analyser standardavviket mellom replikater for hver måling ved hjelp av regnearket "formler" -verktøyet (figur 2J).
      4. Test signing av resultatene ved å anvende en t-test for den gjennomsnittlige bøyningsvinkel og standardavvik verdier beregnet som nevnt ovenfor.
      5. Tegn et søylediagram ved hjelp av de ovennevnte verdiene til grafisk representere kvantitativ forskjell i bøye vinkelen mellom to forskjellige bakgrunner ved hjelp av regnearket "insert" -verktøyet (figur 2K).
         Merk: Mutant / over-uttrykk linjer med sterke kandidat gener ville vise klare forskjeller med hensyn til villtype, for eksempel ingen bøying, rask bøye eller langsom bøying.

2. Skjermplante Lines med defekt Tropic Responses grunn av endringer i PD SEL med en Altered PD Callose nivå

1. Utfør en hypocotyl Laster analyse av åtte-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonsyre (HPTS) Dye Loading på toppen av frøplanter med HPTS Agarose blokker og sammenlign Bevegelsen av Dye Mellom Mutant / Over-uttrykk linjer og Col-0.
   1. Forbered HPTS AgaroSE blokker for hypocotyl lasting analysen.
      1. Ta 10 ml DDH ₂ O i en 50 ml konisk kolbe og tilsett 0,1 g agarose for å fremstille en 1% agarosegel. Kok agarose i en mikrobølgeovn i 1-2 min med periodisk risting, og la den avkjøles i 5 min.
      2. Tilsett 50 mg HPTS til 10 ml av 1% agarose-løsning, og blande godt inntil løsningen blir grønn.
      3. Hell blandingen over i en 10 mm petriskål, og la den stivne i 15 minutter.
      4. Skjær størknede HPTS agarose med en skarp disseksjon kniv for å gjøre små agarose blokker (0,5 x 2 cm ^2).
   2. Forbered planteprøver for HPTS dye-lasting analysen.
      1. Sett en plattform for HPTS fargestoff lasting analysen; plassere et mikroskop deksel glider (24 x 50 mm ²⁾ på en ny MS-medium plate som vist i figur 3A.
      2. Avgifts tre dager gamle etiolated frøplanter fra bunnen av kroken ved hjelp av en skarp kirurgisk saks.
      3. Med en gangoverføre de ovennevnte planter (minimum 5 frøplanter fra hver bakgrunn) til overflaten av en mikroskopisk dekkglass på en slik måte at bare 0,5 cm hypocotyl fra excision stillingen bør forbli på dekselet lysbilde, og resten av hypocotyl skal berøre det medium som vist i figur 3B.
      4. Plasser HPTS agarose blokken på toppen av hypocotyl (med en spaltet krok) i 5 minutter på en slik måte at det utskårede området berører HPTS agarose blokken.
      5. Etter 5 min av lasting, fjerner agarose blokk fra hypocotyl overflaten, overføre hypocotyls til 10 mm petriskål inneholdende DDH ₂ O og vask hypocotyls i DDH ₂ O i 15 minutter med kontinuerlig risting.
   3. Forbered Prøver for konfokalmikroskopi.
      1. Velg minst 5 frøplanter fra hver bakgrunn for observasjon under konfokal laser scanning mikroskop.
      2. I laser kanal, setter bølgelengde til 488 nm for spesifikke exc-utfelling og 500-550 nm for band-pass utslipp.
      3. Overfør frøplanter i 2 sett (ett Col-0 + en mutant) til en ny mikroskopisk lysbilde etter vask med DDH ₂ O. Legg 100-150 mL av dobbelt-destillert vann til raset, og dekk med lokk sklie. Skift lysbildet til scenen av konfokal mikroskop.
      4. Fokuser hypocotyl regionen (med en 20X eller 40X objektiv) med lyse-feltet (hvitt lys) belysning. Deretter skanne lysbilder for fluorescens.
      5. Ta bilder i minimum 10 sett, og sammenligne de to bakgrunn ved å sjekke omfanget av fargestoff bevegelse fra det punktet av lasting.
         Merk: Mutant / over-uttrykk linjer med endret symplasmic bevegelsen vil vise ulike mønstre av fargestoff lasting sammenlignet med villtype Col-0.
2. Analyser Callose nivå i Mutant / Over uttrykk Lines Viser Altered phototropic og Gravitropic Response og viser tydelige HPTS Dye Movement Compared Col-0.
   1. Forbered anilin blå callose farging fargestoff.
      1. Lag 1 M glysin, pH 9,5 og 0,1% (v / v) anilin blå i autoklaveres DDH ₂ O.
      2. Gjør flekker buffer ved å blande 0,1% anilin blå og en M glysin i 2: 3 volumforhold. For eksempel, i 50 ml flekker buffer, ta 20 ml av 0,1% anilin blå og 30 ml 1 M glycin. Merk: Kontroller flekker buffer på minimum 48 timer før bruk og oppbevar den i mørket.
   2. Stain bøyd eller ikke-bøyd frøplanter med callose spesifikke anilin blå farge.
      1. Til å inhibere de novo syntese callose under fargeprosessen, legge til sluttvolumet på 1,5 mM 2-deoksy-D-glukose (DDG) til 50 ml av flekker buffer.
      2. Ta tre dager gamle etiolated frøplanter for callose farging (med eller uten tropisk respons).
      3. Skjær spirene fra sin krok region ved hjelp av tynne kirurgiske saks.
      4. Overfør spirene i en liten petriskål inneholdeing 2 ml buffer flekker ved hjelp av spissen på en tannpirker.
      5. Inkuber frøplantene med flekker buffer i mørket i 2 timer med kontinuerlig rysting ved 30 rpm.
      6. Etter farging, vaske spirene med DDH ₂ O i 2 min for å fjerne overflødig flekker buffer.
      7. Velg minst 5 frøplanter for hver plante bakgrunnen for observasjon under konfokal laser scanning mikroskop.
   3. Forbered prøver for konfokalmikroskopi:
      1. Overfør spirene i sett (ett Col-0 + en mutant) for å rengjøre objektglass etter vask med DDH ₂ O.
      2. Legg 100-150 mL av DDH ₂ O og dekk med lokk sklie. Skift lysbildet til scenen av konfokal mikroskop.
      3. I en laser kanal, angir bølgelengden til 405 nm for spesifikk eksitasjon og 500-550 nm emisjon for avbildning av anilin blå fluorescens.
      4. Bring hypocotyl regionen i fokus, først med 10X og sentr med 20X eller 40X objektiv bruker lyse-feltet (hvitt lys) belysning.
      5. Deretter slå på filtrert lys, skanne lysbilder for fluorescens, og lagre bildene.
      6. Mål callose signalintensitet med ImageJ programvare (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (se figur 4).
         1. Endre formatet på konfokalmikroskopi bilder fra Olympus Bilde Binary format (* .oib) til JPEG filformat. Merk: Bare JPEG-format støttes av ImageJ programvare.
         2. Start ImageJ programmet ved å dobbeltklikke (Figur 4A). Merk: Piler indikerer rektangelet verktøy som skal brukes i den callose intensitetsmåling (figur 4B).
         3. Klikk på "fil" alternativet etterfulgt av sub-alternativet "åpne" i verktøylinjen ImageJ, og åpne mikroskopi bilder som ble lagret i JPEG-format for å måle callose intensitet (figur 4C).
         4. Klikk den rektangulære ikonet på ImaGEJ verktøylinjen (Figur 4D).
         5. For å analysere signalintensitet, dra markøren over bildet, og velg det området som skal undersøkes (figur 4E)
         6. Mål og registrere de numeriske verdiene for signalintensitet ved å trykke på "M" på tastaturet (figur 4E). Merk: Resultatet filen vil åpne seg (Figur 4F).
         7. Måle og registrere intensitetsverdiene en etter en for samtlige planter fra hver plante bakgrunn.
            Merk: I ImageJ, resultatet filen "Mean" indikerer signalstyrken for valgt "Area".
      7. Kopier middelverdiene fra ImageJ resultatfilen, og lime inn i regnearkfilen for kvantitativ analyse.
      8. For kvantitativ analyse, lage et søylediagram diagram med statistiske tester, inkludert standard feilfelt og sannsynlighetsverdier (figur 4).
         1. Måle den gjennomsnittlige signalintensiteten(mener fra ImageJ) for hver bakgrunnen ved hjelp av regnearket "formler" -verktøyet (figur 4G).
         2. Analyser standardavviket mellom replikater for hver måling ved hjelp av regnearket "formler" -verktøyet (figur 4G).
         3. Beregn standardfeil (SE) med thespreadsheet "formler" -verktøyet.
            Bemerk: SE = s / √ n, der (e) er standardavviket av befolkningen, og (n) er den størrelse (antall observasjoner) av prøven.
         4. Test signifikans av resultatene ved å anvende en t-test for den gjennomsnittlige signalintensitet og standardfeilverdiene beregnet som nevnt ovenfor.
         5. Tegn et søylediagram diagram ved hjelp av de ovennevnte verdiene til grafisk representere den kvantitative forskjellen i callose nivået mellom to forskjellige bakgrunner ved hjelp av regnearket "insert" -verktøyet (figur 4H).
            Merk: Mutant / over-uttrykk linjer av sterke kandidater vil shvordan ulike nivåer av callose sammenlignet med villtype, for eksempel ingen callose, lite callose eller hyper PD callose akkumulering.

Representative Results

I dagens oppsett, deksametason (dex) -inducible RNAi linjer AtGSL8 [heretter dsGSL8 (+ dex / -dex)] ble brukt, som homozygot gsl8 T-DNA innsetting mutanter er frøplante dødelig ^18. Tre dager gamle etiolated frøplanter av dsGSL8 og villtype frøplanter med ± dex ble utsatt for phototropic og gravitropic stimuli. Vi fant ut at dsGSL8 (+ dex) frøplanter var defekt i fototropisme og gravitropism ^15. Figur 5 viser tydelig at dsGSL8 (+ dex) viser ingen bøying under påvirkning av både fototropisme og gravitropism. Videre endring i symplasmic bevegelse i dsGSL8 (+ dex) og dsGSL8 (-dex) eller Col-0 ble analysert ved en HPTS lasting analysen. I samsvar med vår tidligere funn, det HPTS fargestoff bevegelse i dsGSL8 (+ dex) var vesentlig mer omfattende enn i dsGSL8 (-dex) eller Col-0, Figur 6. Callose er en av de viktigste regulatorer av PD SEL, og AtGSL8 er kjent som en PD callose syntase ^16. Videre ble callose anilin blåfarging utført, og dsGSL8 (+ dex) har vedvarende vist en lav PD callose nivå før og etter tropiske respons, som vist i figur 7.

Figur 1. Flytskjema av trinnene som er involvert i stimulering av phototropic og gravitropic svar. (A) Transfer vertikalt vokst frøplanter fra forskjellige plante bakgrunn til en plate, men på egne linjer. (B) For fototropisme, holde platene som vender mot ensidig hvitt lys i en mørk boks som åpnes på den ene siden. For gravitropism, først vikle platene med aluminiumsfolie, rotere 90 °, og overføre til en mørk boks (covered fra alle sider). (C) Ved hjelp av en skanner, skanne platene etter ulike tidsintervaller, for eksempel 1,5 timer, 3 timer, 6 timer og 12 timer. (D og E) Disse panelene viser datagenerering fra ImageJ og dataanalyse ved hjelp av regnearkfiler, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Måling av bøyevinkel ved ImageJ. (A) Se bilde J programmet ved å dobbeltklikke. (B) De viktigste verktøy som ble brukt i vinkelmålingen. (C) Åpne "File" etterfulgt av sub-alternativet "åpen" i Image J verktøylinjen for å åpne mikroskopi bilder som ble lagret i JPEG-format. (D (F) omriss av vinkelmålingen: abc definerer en fast A, og den egentlige bøyevinkelen blir beregnet som B, som er lik 180 ° - A. (G) Linje representerer avstanden fra punkt a til punkt b. (H) Kontinuitet av linjen ab å peke c making A. (I) Resultat fil av bilde J viser En verdi. (J) Representant regneark som viser gjennomsnitts bøyning vinkelmålinger, stanDard avvik, standardfeil og t-test beregninger. (K) Bar graf diagram som viser bøyevinkelmåling mellom to forskjellige plante bakgrunn Col-0 og dsGSL8 EMS mutant. Feilfelt er SEM (standard feil av gjennomsnittet +) og *** representerer betydningen av T-test (p-verdi> 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Oversikt over trinnene som er involvert i HPTS lasting analysen. (A) Panel som viser utarbeidelse av HPTS agarose blokker. (B) Panel representerer eksisjon og overføring av frøplanter og lasting av HPTS agarose blokker. (C) Panel som viser trinnene som er involvert i prøvenforberedelse for confocal bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Måling av callose intensitet av ImageJ. (A) Se ImageJ programmet ved å dobbeltklikke. (B) De viktigste verktøyene som ble brukt i callose intensitet målingen. (C) Åpne "File" etterfulgt av sub-alternativet "åpne" i verktøylinjen ImageJ å åpne mikroskopi bilder som ble lagret i JPEG-format. (D) Den rektangulære ikonet på ImageJ verktøylinjen. (E) Den valgte område av bildet for å analysere callose intensitet. (F) ImageJ resultatfilen viser callose intensitetsverdi som "Mean". (G)Representant regneark som viser gjennomsnitts callose intensitetsmålinger, standardavvik, standard feil og t-test beregninger. (H) Søylediagrammets skjema som representerer den callose intensitetsforskjell mellom de to plante bakgrunn. Feilfelt er SEM (standard feil av gjennomsnittet +) og *** representerer betydningen av T-test (p-verdi> 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Reduksjon av AtGSL8 uttrykk fører til defekt tropic svar. (A) phototropic respons viste ved dsGSL8 (± dex) sammen med (B) Gravitropic respons vist ved dsGSL8 (± dex) al Col-0. ong med Col-0. dsGSL8 (+ dex) viser ingen phototropic eller gravitropic svar. dsGSL8 (+ dex) og dsGSL8 (-dex) symboliserer deksametason-behandlet og ubehandlet dsGSL8 -inducible RNAi linjer, henholdsvis. Scale bar representerer 0,2 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. symplasmic bevegelsen økt etter undertrykkelsen av AtGSL8. Fluorescens bildene ble tatt etter HPTS lasting til dsGSL8 ± dex hypocotyl snittflatene sammen med villtype Col-0. DsGSL8 (+ dex) viste mer omfattende bevegelse av HPTS fargestoff, viser økt symplasmic bevegelse. Scale bar representerer 0,2 mm.com / filer / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. AtGSL8 undertrykte linjer viste symmetrisk PD callose fordeling mellom opplyste og skyggefulle sider av hypocotyl. (A) Fluorescens bilde som viser anilin blå callose farging for dsGSL8 (-dex) ved 0 hr. (B) Fluorescens bilde som viser anilin blå callose farging for dsGSL8 (-dex) etter 6 timer av fototropisme. (C) Fluorescens bilde som viser anilin blå callose farging for dsGSL8 (+ dex) etter 6 timer av fototropisme. Gule piler indikerer callose opphopning på skyggefulle delen av hypocotyl. Scale bar representerer 50 mikrometer. (D) Søylediagrammets diagram som viser amount av PD callose at akkumulert i dsGSL8 (± dex) hypocotyls før og etter 3 timer og 6 timer av fototropisme. Fluorescens foci intensiteter ble målt fra ti uavhengige hypocotyls (data er gjennomsnitt ± SD, t-test, * p <0,01). Dette tallet har blitt forandret fra (Han et al., 2014) ^15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

I dette manuskriptet, til en strategi screene mutant / over-ekspresjon linjer som er defekte i phototropic og gravitropic responser på grunn av endret PD callose og, følgelig, er PD SEL beskrevet i detalj. PD callose syntese og nedbrytning er i hovedsak oppnådd ved callose synthases og β-1,3-glukanaser, men regulering av disse enzymene bestemmes av mange faktorer oppstrøms. For å søke etter slike oppstrøms faktorer eller kandidater som er direkte involvert i PD regulering, har vi satt opp denne metoden for screening. Dette oppsettet har noen begrensninger som mutanter av noen viktige enzymer som regulerer PD callose biosyntese (gsl8) er dødelige ¹⁵ og til å sortere ut slike mutanter ville bli begrenset av dette satt opp. Også, hvis kandidaten genet viser raskere eller langsommere tropisk respons sammen med åpen eller lukket PD, men callose nivået forblir uendret, så detaljert analyse er nødvendig for å ytterligere karakterisere slike kandidater. De kritiske faktorer og feilsøking processes i hvert trinn er også utarbeidet. Først, i medium fremstilling, en kritisk faktor som kan påvirke plantevekst er pH-verdien i mediet, som bør ligge i området 5,7 til 5,8. For det andre er passende overflate tørking av agarplater viktig; det ville være vanskelig å løfte de tre dager gamle frøplanter uten skade fra agarplater med høyt vanninnhold. Imidlertid kan for mye tørking av agarplater føre til noen sprekker i media under inkubering og føre til usymmetrisk frøplante vekst. Under overflaten steriliseringen av frøene ved hjelp av natrium-hypokloritt-løsning, må man sørge for å fjerne natriumhypokloritt fullstendig ved gjentatt vasking med Autoclaved DDH ₂ O, da det er en sterk blekemiddel. Autoclaved DDH ₂ O bør være forberedt ferske og behandles aseptisk, som gamle aksjer kan føre til soppsporer i MS plater. Etter sterilisering, er frøene stratifisert etter kuldebehandling for å synkronisere spiring. Denne fremgangsmåte kan utføres enten ved transferring sterilisert våte frø direkte til et kaldt rom i mørke forhold eller første punktere frøene på MS plater og deretter overføre platene til et kaldt rom i mørke forhold. Imidlertid foretrekkes sistnevnte fordi det gir en mer jevn vekst av frøplanter. Mens punktere frø, bør avstanden mellom to tilstøtende frø være minst 0,1 cm, fordi meget tett prikket frø vil resultere i vekst av overlappende frøplante, noe som er meget vanskelig å overføre i de etterfølgende eksperimenter.

For riktig phototropic og gravitropic svar, bør frøplanter ikke utsettes for lys og bør forbli uskadet. For å unngå bakgrunn effekter av hvitt lys, nøye velge spirene under ett grønt lys kilde i det mørke rommet som plantene ikke svare på grønt lys. Grønt lys kilde kan genereres ved å dekke den hvite lyskilden bruker gjennomsiktige grønne vinylplater. For å velge frøplanter, er en sterilisert tannpirker det beste alternativet. Trykk the veldig nedre delen av hypocotyl med tannpirker til å løfte spirene slik at de lett kan overføres til en ny plate. Alle av frøplantene bør være lik i størrelse og orientering kroken. I løpet av våre forsøk har vi sett at hvis kroken retning er på motsatt side av lyskilden, vil plantene viser en hurtigere respons enn tropiske planter med den samme krok retning som lyskilde. Vanligvis, i tilfellet av fototropisme, kan man se en tydelig forskjell i den bøyevinkel mellom ekte kandidater og Col-0 i løpet av 3 timer, mens i tilfelle av gravitropism, tar det vanligvis 6-12 timer. Til slutt, for å få statistisk relevante data, et minimum på tre biologiske replikater og 20 stiklinger for hver gang.

For å teste omfanget av symplasmic bevegelse mellom forskjellige plante bakgrunn, er HPTS fargestoff lasting en praktisk teknikk, som den ikke trenger avanserte verktøy og instrumentering. For HPTS lasting analysen, hvor mange prosent av gel i HPTS agarose blokker er av stor betydning, da en meget sprø eller hard gel ikke vil gi optimale resultater. Det er bedre å bruke en 50 ml konisk kolbe med løs gummi og ikke å bruke et stort volum kolbe for koking agarose med 10 ml vann. HPTS agarose blokker kan brukes i en uke etter fremstillingen om holdt pakket i aluminiumsfolie ved 4 ° C. En annen viktig faktor i HPTS lasting analysen er excision av hypocotyl kroken regionen. Excision skal utføres med skarp disseksjon saks og ved en tilsvarende stilling for alle av frøplantene. Eksisjon med sløv saks kan føre til uønsket skade på planter og kan hindre HPTS lasting. I tillegg kan de frøplante vekstbetingelser og utviklingsstadier spille en avgjørende rolle i fargestoff bevegelse, som callose akkumulering er mer tilbøyelige til å svare på slike endringer, som til slutt står for hindring i fargestoff bevegelse. Således vokser plantene under optimale forhold er nødvendig. Callose på PD spiller en nøkkelrolle iTropic reaksjoner fra etiolated frøplanter ved å regulere PD SEL, noe som er viktig for auxin gradient dannelse ^15. Callose nivåer kan oppdages ved farging med anilin blå eller immunogold merking. Farging med anilin blått er en enkel og rask metode for å detektere callose nivå. Fordi hypocotyl celler har høyt trykk og turgor en epi-skjellaget, er det ikke lett for fargestoffet for å trenge inn i cellene. Derfor har vi utviklet cut-farging metode for å tillate anilin blått fargestoff til å trenge gjennom lett. Det er imidlertid en risiko for syntese av ny callose som kan påvirke fargingsresultater, noe som er en begrensning av den normale callose fargemetoden. For å unngå slike virkninger, er fargingen protokoll modifisert ved å legge til callose syntase inhibitor 2-D-deoksy glukose (DDG) til farging buffer. Således omfatter denne protokollen måling av pre-eksisterende callose bare i det nedre område av den hypocotyl det er akkurat under cut-området. Unngå bruk av ferske FORBEREDELSERed anilin blå, og holde anilin blå løsning ved romtemperatur i minst 48 timer før bruk. Vi la merke til at flekker med frisk anilin blå løsning ikke gir optimale callose flekker resultater.

Total, vi har presentert et sett av strategier som kan brukes for rask screening av mutanter / over-uttrykk linjer med en defekt eller forsterket tropic respons ved å endre PD SEL ved direkte eller indirekte moduler PD callose. En tidligere faktum om tropiske responser ble majorly begrenset til handling av auxin bærere og signalspillere, som PINIOD ^2-14. I tillegg har vi også etablert en viktig rolle for symplasmic bevegelse av auxin i å opprettholde en auxin-gradient i den hypocotyl systemet ^15. Enkelheten og allsidigheten til denne metoden utvilsomt forsterke sin nytteverdi i å undersøke kandidatgener for sin regulering av PD SEL, og dermed spille en viktig rolle i anlegget utvikling, herunder tropiske svar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds