Una estrategia para validar el papel de callosa mediada Plasmodesmal de apertura de puerta en la respuesta Tropic

Summary

En este artículo se describen los métodos para seleccionar los genes que controlan la permeabilidad plasmodesmal y el gradiente de ahí auxina durante la respuesta trópico. Esto incluye la medición del grado de respuesta trópico en hipocotilo de Arabidopsis thaliana y comprobar la permeabilidad plasmodesmal por el ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico carga (HPTS) y la evaluación del nivel de fin de callosa.

Abstract

La hormona vegetal auxina juega un papel importante en muchos procesos de crecimiento y desarrollo, incluyendo las respuestas trópico a la luz y la gravedad. El establecimiento de un gradiente de auxina es un evento clave que conduce a phototropism y gravitropismo. Anteriormente, se demostró que el transporte de auxina polar (PAT) para establecer un gradiente de auxina en diferentes dominios celulares de las plantas. Sin embargo, Han et al. Demostró recientemente que para la formación adecuada gradiente de auxina, plasmodesmal conectividad symplasmic callose mediada entre las células adyacentes es también un factor crítico. En este manuscrito, la estrategia para dilucidar el papel de determinados genes, que pueden afectar phototropism y gravitropismo alterando la conectividad symplasmic través de la modulación de la síntesis de callosa plasmodesmal, se discute. El primer paso es para detectar respuestas trópico aberrantes de 3 días de edad, las plántulas etioladas de mutantes o sobre-expresión líneas de un gen junto con el tipo salvaje. Esta selección preliminarpuede conducir a la identificación de una serie de genes que funcionan en PAT o controlan la conectividad symplasmic. La segunda selección implica la clasificación de los candidatos que muestran respuestas alteradas trópico al afectar la conectividad symplasmic. Para hacer frente a estos candidatos, se examinaron el movimiento de un trazador symplasmic y la deposición de callosa plasmodesmal. Esta estrategia sería útil explorar nuevos genes candidatos que pueden regular la conectividad symplasmic directa o indirectamente durante las respuestas tropicales y otros procesos de desarrollo.

Introduction

Las plantas, como organismos vivos sésiles, han desarrollado una red altamente sofisticada de señalización célula a célula para hacer frente a diversos estímulos ambientales. respuestas Tropic son uno de los fenómenos por los que las plantas responden a los estímulos ambientales. Las plantas muestran dos principales respuestas trópico, phototropism y gravitropismo. plantas fotosintéticas se doblan hacia la fuente de luz por phototropism para cosechar el máximo de energía. Del mismo modo, gravitropismo hace que las plantas a crecer hacia el centro de gravedad. El mecanismo fundamental que lleva a este tipo de respuestas trópico implica la formación del gradiente asimétrica de la auxina de fitohormonas ^1. El acto de la formación del gradiente auxina local está bien caracterizada; los genes que están involucrados en este mecanismo proporciona una hoja de ruta para la acción de la hormona ^2-8. La posición específica de los portadores de auxina eflujo, como la formada PIN (PIN) y las glicoproteínas P, ejecuta el movimiento de auxina desde el citoplasma a la pared celular de las células del donante ^9,10. Furthermore, por el H ⁺ actividad activo / IAA simporte de portadores de afluencia de auxinas, tales como proteínas de la familia LAX AUX1 / auxina es finalmente entregado a las células receptoras adyacentes ^2,11,12. Este movimiento direccional de la auxina se conoce como el transporte de auxina polares (PAT). PAT conduce a una distribución diferencial de auxina durante las diversas etapas de desarrollo y en respuesta a diferentes estímulos del medio ambiente ^13,14. Por otra parte, la interrupción en la localización o la expresión de cualquiera de estos portadores de afluencia o de flujo de salida de auxina conduce a la alteración severa en PAT, lo que provoca una interrupción del gradiente de la auxina, lo que conduce a defectos en el desarrollo. Recientemente, Han et al. informó de que la regulación plasmodesmal también es necesario para mantener el gradiente de auxina ^15. Hasta la fecha, más de 30 proteínas plasmodesmal se han identificado ^16. Entre estas proteínas, AtGSL8 ha sido reportado como una enzima clave para la síntesis de callosa en plasmodesmas (PD) y por lo tanto juega un papel vital en maintaining el límite de tamaño de exclusión PD (SEL). AtGSL8 expresión reprimida dio lugar a un patrón de gradiente de auxina distorsionada que conduce a ninguna respuesta trópico en contraste con las plántulas de tipo salvaje ^15.

En este manuscrito, métodos para explorar nuevos genes candidatos que están involucrados en la regulación del PD se proporcionan. AtGSL8 se usó como una proteína modelo para probar estos métodos, ya que es una enzima clave que contribuye a la biosíntesis de PD callose. Debido a la planta de semillero de letalidad de mutantes gsl8 knock-out ^17, se utilizaron dexametasona (DEX) inducible líneas de ARNi de acuerdo con un informe publicado anteriormente ^15. La estrategia aquí proporcionada puede ser adaptado para detectar los genes que están implicados en la respuesta hipocotilo trópico controlado por PD SEL.

Protocol

1. La selección de mutantes con alteración de las respuestas Phototropic y gravitrópica

1. Preparar 1x Murashige y Skoog (MS), pH 5,7, con 0,8% de agar Un día antes del experimento.
   1. Añadir 800 ml de agua doblemente destilada a un matraz cónico de 2 litros y se agita con una barra magnética.
   2. Añadir 4,4 g de sal de MS al matraz cónico.
   3. Añadir 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) y se agita hasta que todas las sales se disuelven completamente.
   4. Se ajusta el pH del medio a 5,7 con 1 M de KOH.
   5. Pasar el medio de un cilindro de masa y llevar a un volumen final de 1 litro con _ddH2O
   6. Verter de nuevo el medio en un matraz cónico de 2 litros y se añaden 8 g de agar planta.
   7. Envuelve la boca del frasco cónico herméticamente con papel de aluminio.
   8. Esterilizar en autoclave el medio MS y ddH ₂ O durante 15 minutos a 121 ° C, 15 psi, y después de la esterilización en autoclave, mantener el medio en una incubadora a 60 ° y el ddH ₂ O a TA.
   9. Después de enfriar a 60 ° C, se vierte el medio en 125 x 125 x 20 mm ³ placas cuadradas en un banco de flujo laminar (50 ml en cada placa).
   10. Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora, manteniendo las placas parcialmente abierta. Si las placas no se utilizan inmediatamente, sellarlos mediante el uso de una envoltura de plástico y se almacena a 4 ° C en un refrigerador.
2. Superficie-esterilizar las semillas con hipoclorito de sodio al 1,1% y salpican las semillas en placas de agar 1x MS que se prepararon en el apartado 1.1.
   Nota: En este caso, la Arabidopsis thaliana {Col-0 semillas, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ se utilizan para la respuesta trópico, tinción de callosa y HPTS carga Arabidopsis thaliana semillas {Col-0 y dsGSL8 (Col-0) EMS mutante} (. sin publicar) se utilizan para la respuesta trópico en la Figura 2.
   1. Autoclave de 300 ml de ddH ₂ O en una botella.
   2. Añadir aproximadamente cien semillas para cada fondo, es decir,mutante línea de / sobre-expresión y de tipo silvestre (Col-0) semillas, a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   3. Sacar las placas de agar MS 1x de un refrigerador de 4 ° C y secarlos en un banco de flujo laminar en una posición parcialmente abierta.
   4. Surface-esterilizar las semillas mediante la adición de 1 ml de una solución de 0,2x lejía (1,1% de hipoclorito de sodio) y mantener los tubos de microcentrífuga en un agitador a 250 rpm durante 5 min.
   5. Deje que las semillas se depositan en la parte inferior por gravedad y retire la solución de cloro por micropipeta.
   6. Añadir 1 ml de ddH fresco ₂ O (tratado en autoclave) a las semillas y mezclar bien invirtiendo el tubo de microcentrífuga varias veces. Deje que las semillas se depositan de nuevo y luego eliminar el agua.
   7. Repita el paso 1.2.6 5-6 veces.
   8. Añadir el doble de la cantidad de agua para el volumen de las semillas que quedaron después del lavado final.
   9. Dot las semillas esterilizadas en una placa de agar 1x MS semi-seca usando una punta de micropipeta de 1 ml que contiene 200 l de semillas (enINCLUYENDO agua).
      1. Mantener una distancia de aproximadamente 0,1 cm entre dos semillas y un mínimo de 1,8 cm entre dos filas de semillas. El punto sobre la semillas en cinco filas horizontales por placa cuadrada (125 x 125 x 20 mm ^3). Deje que el agua se seque ligeramente antes de colocar la tapa sobre la placa.
   10. Sellar las placas con cinta quirúrgica, apilar todas las planchas verticalmente, y se envuelve con papel de aluminio.
   11. La transferencia de las placas envueltas en una caja oscura (que no tienen acceso a la luz). A continuación, mantener la caja oscura en una habitación de 4 ° C / refrigerador durante 3 días.
   12. A partir de este paso, mantener la dirección de placas sin cambios. Después de 3 días de tratamiento en frío, mantener la caja en una habitación oscura cultivo de plantas a 22 ° C durante los próximos 3 días. Después de 3 días, comprobar el estado de germinación de las semillas bajo luz verde en un cuarto oscuro.
       NOTA: Casi siempre 3 días de edad, Col-0 plántulas ahiladas pueden crecer hasta 1,6 cm de longitud.
3. Analizar la alterado un phototropicnd respuesta gravitrópica en mutantes o sobre-expresión líneas de un gen específico. Seleccione plántulas rectas de tamaño similar y solamente crecido verticalmente bajo la luz verde en un cuarto oscuro. Transferir las plántulas seleccionadas a una nueva placa de agar 1x MS utilizando la punta de un palillo de dientes esterilizado.
   1. seleccionar con cuidado las plantas de semillero de la parte más baja de su hipocotilo sin tocar ninguna otra parte. Asegúrese de que todas las plantas tienen la misma orientación de cotiledones / gancho, y después de la transferencia, que la orientación de los ganchos de plántulas siguen siendo los mismos. Use un mínimo de 20 plántulas de cada fondo en cada fila y un mínimo de dos placas para cada punto de tiempo para el análisis adicional.
      Nota: Cuatro fondos diferentes se pueden comparar en cada placa (4 filas).
      Opcional: Durante el uso de la dexametasona (DEX) inducible RNAi / sobre-expresión de líneas, transfiera las plántulas anteriores a un 1x MS plato junto con la placa de Des + MS (MS placa que contiene 1x, 0,8% medio de agar suplementado con Dex 20 M) for 3 horas y mantener las placas verticalmente en la caja oscura.
   2. Para comprobar la respuesta phototropic, transferir las placas anteriores verticalmente a un cuadro negro de un solo lado abierto. Transferir el cuadro negro que contiene las placas a una cámara de crecimiento de las plantas con luz blanca unilateral. Para asegurarse de luz unilaterales, coloque el borde de la placa hacia la fuente de luz (no el lado frontal). Consulte la configuración en la Figura 1.
   3. Del mismo modo, para comprobar la respuesta gravitrópica, mantener las placas con plántulas transferidas verticales, y cubrir con papel de aluminio. A continuación, cambiar la orientación de la placa vertical de 90 ° y mantenerlo dentro de la caja de negro cubierto por todos los lados. Consulte la configuración en la Figura 1.
   4. Después de que los puntos de tiempo dados, (por lo general de 1,5 horas, 3 horas, 6 horas y 12 horas) escanear las placas con un escáner, y guardar las imágenes en formato JPEG.
   5. Medir el ángulo de flexión de las plántulas utilizando el software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2).
      1. Iniciar el programa ImageJ haciendo doble clic (Figura 2A).
         Nota: Las principales herramientas que se utilizaron en la medición de ángulos se muestran en la Figura 2B.
      2. Haga clic en la opción "archivo", seguido de la sub-opción "abierta" en la barra de herramientas ImageJ, y las imágenes abiertas guardados en formato de archivo JPEG para medir el ángulo de flexión trópico (Figura 2C).
      3. Haga clic en la herramienta de ampliación para acercar o alejar la imagen haciendo clic en el botón izquierdo o derecho del ratón, respectivamente, como se muestra en la Figura 2B.
      4. Haga clic en la herramienta de desplazamiento para arrastrar y posicionar la imagen (Figura 2D) .A continuación, haga clic en la herramienta de ángulo para medir el ángulo de flexión (Figura 2E).
         1. Hacer un doble clic izquierdo sobre el hipocotilo originales creciente punto de dirección "a", arrastrar el ratón hasta el punto de iniciación de flexión "B" (Figura 2F), y haga clic en el trasero izquierdopara dibujar en la primera línea (Figura 2G).
         2. Arrastre el ratón desde el punto B hasta el punto final de doblado 'c', y haga clic en el botón izquierdo para dibujar la segunda línea (Figura 2H) y formar un fijo A. Nota: El verdadero ángulo de flexión es B, que es igual a 180 ° - A. (Figura 2F).
         3. Medir y registrar Un pulsando la tecla 'M' en el teclado. El archivo de resultados se abrirá por separado como se muestra en la Figura 2I. Medir y registrar todas las plantas de semillero de uno en uno. Por ejemplo, medir primero el ángulo de flexión para todos los hipocotilos de Col-0 y luego para las líneas mutantes.
   6. Transferir el conjunto de datos de ImageJ al archivo de hoja de cálculo para realizar la avtura de ángulos de cada fondo de flexión.
   7. Para el análisis cuantitativo, hacer un diagrama de gráfico de barras con los resultados de pruebas estadísticas, así como barras de error estándar y los valores de probabilidad (Ver Figura 2).
      1. Calcular el verdadero flexión B, y diseñar una fórmula que utiliza una hoja de cálculo, es decir, B = 180 ° - Una nota: A es el valor que se deriva de análisis ImageJ.
      2. Medir el ángulo de flexión media B para cada fondo el uso de herramientas de hojas de cálculo (Figura 2J).
      3. Analizar la desviación estándar entre repeticiones para cada medición con la función "fórmulas" hoja de cálculo (Figura 2J).
      4. Prueba de la sigsignifi- de los resultados mediante la aplicación de una prueba t con el ángulo de flexión media y los valores de desviación estándar calculados como se ha mencionado anteriormente.
      5. Dibuje un diagrama de barras utilizando los valores anteriores para representar gráficamente la diferencia cuantitativa en el ángulo de flexión entre dos orígenes diferentes con la función "inserto" hoja de cálculo (Figura 2K).
         Nota: Mutante / sobre-expresión de líneas fuertes genes candidatos mostrarían diferencias claras con respecto a su forma natural, como ninguna flexión, flexión rápida o lenta flexión.

2. Las líneas de la planta de la pantalla con las respuestas defectuoso Tropic debido a los cambios en la EP SEL con un alterada PD callosa Nivel

1. Realizar un ensayo Cargando Hipocótilo por 8-hidroxipireno-1,3,6-ácido trisulfónico (HPTS) colorante de carga en la parte superior de las plantas de semillero con HPTS agarosa Bloques y comparar el movimiento de tinte Entre Mutante / La sobreexpresión de líneas y de Col-0.
   1. Preparar HPTS agaroSE bloques para el ensayo de hipocotilo de carga.
      1. Tomar 10 ml de ddH ₂ O en un matraz cónico de 50 ml y añadir 0,1 g de agarosa para preparar un gel de agarosa al 1%. Hervir la agarosa en un horno de microondas durante 1-2 minutos con agitación intermitente, y deje que se enfríe durante 5 minutos.
      2. Se añaden 50 mg de HPTS a 10 ml de solución de agarosa al 1%, y mezclar bien hasta que la solución se vuelve verde.
      3. Se vierte la mezcla anterior a una placa de Petri de 10 mm, y dejar que se solidifique durante 15 minutos.
      4. Cortar las HPTS solidificadas de agarosa con una cuchilla de disección cortante para hacer bloques de agarosa pequeños (0,5 x 2 cm ^2).
   2. Preparar muestras de plantas para el ensayo de tinte de carga HPTS.
      1. Establecer una plataforma para el ensayo de HPTS colorante de carga; colocar un portaobjetos de cubierta de microscopio (24 x 50 mm ²⁾ en una nueva placa de medio MS como se muestra en la Figura 3A.
      2. Impuestos Especiales 3 días de edad, las plántulas ahiladas desde la base del gancho utilizando una tijera quirúrgica aguda.
      3. Inmediatamentetransferir las plántulas anteriores (un mínimo de 5 plantas de semillero de cada fondo) a la superficie de una cubierta de vidrio microscópico de tal manera que sólo 0,5 cm de hipocotilo de la posición de escisión deben permanecer en tapa deslizante, y el resto del hipocotilo debe tocar el medio como se muestra en la Figura 3B.
      4. Coloque el bloque de agarosa HPTS en la parte superior del hipocotilo (con un gancho extirpado) de 5 min de una manera tal que el área extirpada toque el bloque de agarosa HPTS.
      5. Después de 5 min de la carga, retirar el bloque de agarosa de la superficie del hipocotilo, transferir los hipocotilos para el 10 mm placa de Petri que contiene ddH ₂ O y lavar hipocotilos en ddH ₂ O durante 15 min con agitación continua.
   3. Preparar muestras para microscopía confocal.
      1. Seleccionar un mínimo de 5 plántulas de cada fondo para la observación bajo el microscopio confocal de barrido láser.
      2. En el canal de láser, ajuste la longitud de onda de 488 nm para exc específicasanea- y de 500 a 550 nm para la emisión de paso de banda.
      3. Plántulas de transferencia en 2 juegos (uno Col-0 + un mutante) a una nueva lámina de microscopio, después de lavar con _ddH2O Añadir 100-150 l de agua bidestilada a la diapositiva, y cubrir con una tapa deslizante. Desplazar la corredera a la platina del microscopio confocal.
      4. Enfoque la región de hipocótilo (con una lente objetivo de 20X o 40X) usando iluminación de campo brillante (luz blanca). A continuación, escanear las diapositivas de fluorescencia.
      5. Tomar imágenes durante un mínimo de 10 juegos, y para comparar los dos fondos marcando la extensión del movimiento de tinte desde el punto de carga.
         Nota: Mutante / sobre-expresión de líneas con movimiento alterado symplasmic mostrarán diferentes patrones de carga de colorante en comparación con el tipo salvaje Col-0.
2. Analizar el nivel de callosa en el mutante / Líneas sobre-expresión alterada Mostrando Phototropic y gravitrópica de respuesta y mostrando Distinto HPTS tinte Movimiento Compared de Col-0.
   1. Preparar tinción con colorante azul de anilina callosa.
      1. Hacer 1 M de glicina, pH 9,5 y 0,1% (W / V) azul de anilina en autoclave ddH ₂ O.
      2. Hacer que el tampón de tinción mezclando 0,1% de azul de anilina y 1 M de glicina en 2: 3 relaciones de volumen. Por ejemplo, para 50 ml de tampón de tinción, tomar 20 ml de 0,1% de azul de anilina y 30 ml de 1 M de glicina. Nota: Hacer que el tampón de tinción un mínimo de 48 horas antes de su uso y almacenarla en la oscuridad.
   2. Mancha doblado o plántulas con colorante azul de anilina-callose específica no doblado.
      1. Para inhibir la síntesis de novo callose durante el proceso de tinción, añadir el volumen final de 1,5 mM 2-desoxi-D-glucosa (DDG) a 50 ml de tampón de tinción.
      2. Tomar 3 días de edad, las plántulas ahiladas para la tinción de callosa (con o sin respuesta trópico).
      3. Cortar las plántulas de su región gancho utilizando tijeras quirúrgicas finas.
      4. La transferencia de las plantas de semillero en una pequeña placa de Petri contieneing 2 ml de tampón de tinción utilizando la punta de un palillo de dientes.
      5. Se incuban las plántulas con tampón de tinción en la oscuridad durante 2 h con agitación continua a 30 rpm.
      6. Después de la tinción, se lavan los plántulas con ddH ₂ O durante 2 minutos para eliminar el exceso de tampón de tinción.
      7. Seleccionar un mínimo de 5 plantas de semillero para cada fondo de la planta para su observación al microscopio confocal de barrido láser.
   3. Preparar muestras para microscopía confocal:
      1. La transferencia de las plantas de semillero en el conjunto (uno Col-0 + un mutante) para limpiar el portaobjetos después de lavar con _ddH2O
      2. Añadir 100-150 l de _ddH2O y cubrir con una tapa deslizante. Desplazar la corredera a la platina del microscopio confocal.
      3. En un canal de láser, ajuste la longitud de onda de 405 nm para la excitación específica y de 500 a 550 nm de emisión para la obtención de imágenes de fluorescencia azul de anilina.
      4. Llevar la región de hipocótilo de relieve, en primer lugar con 10 veces y tardíaR con 20X o 40X lentes del objetivo utilizando campo brillante (luz blanca) de iluminación.
      5. A continuación, encienda la luz filtrada, escanear las diapositivas para la fluorescencia, y guardar las imágenes.
      6. Medir la intensidad de la señal de callosa con el software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Ver Figura 4).
         1. Cambiar el formato de imágenes de microscopía confocal Olympus de imagen de formato binario (* .oib) al formato de archivo JPEG. Nota: Sólo el formato JPEG es compatible con el software ImageJ.
         2. Iniciar el programa ImageJ haciendo doble clic (Figura 4A). Nota: Las flechas indican la herramienta de rectángulo para ser utilizado en la medida de intensidad callose (Figura 4B).
         3. Haga clic en la opción "archivo" seguido de la sub-opción "abierta" en la barra de herramientas ImageJ y abiertas microscopía imágenes que se guardan en formato de archivo JPEG para medir la intensidad de callosa (Figura 4C).
         4. Haga clic en el icono rectangular en el Imabarra de herramientas de la UGE (Figura 4D).
         5. Para analizar la intensidad de la señal, arrastrar el cursor sobre la imagen y seleccionar la zona a examinar (Figura 4E)
         6. Medir y registrar los valores numéricos para la intensidad de la señal pulsando "M" en el teclado (Figura 4E). Nota: El archivo de resultados se abrirá por separado (Figura 4F).
         7. Medir y registrar la intensidad de los valores de uno en uno para todas las plantas de semillero de cada fondo de la planta.
            Nota: En ImageJ, el archivo de resultados "Mean" indica la intensidad de la señal de la "zona" seleccionado.
      7. Copiar los valores medios del archivo de resultados ImageJ, y pegar en el archivo de hoja de cálculo para el análisis cuantitativo.
      8. Para el análisis cuantitativo, hacer un diagrama de gráfico de barras con las pruebas estadísticas, incluidas las barras de error estándar y los valores de probabilidad (Figura 4).
         1. Medir la intensidad media de la señal(media de ImageJ) para cada fondo con la función "fórmulas" hoja de cálculo (Figura 4G).
         2. Analizar la desviación estándar entre repeticiones para cada medición con la función "fórmulas" hoja de cálculo (Figura 4G).
         3. Calcular el error estándar (SE) usando thespreadsheet herramienta de "fórmulas".
            Nota: Se = s / √ n, donde (s) es la desviación estándar de la población, y (n) es el tamaño (número de observaciones) de la muestra.
         4. Prueba de la importancia de los resultados mediante la aplicación de una prueba t de la intensidad media de la señal y los valores de error estándar calculados como se ha mencionado anteriormente.
         5. Dibuje un diagrama gráfico de barras utilizando los valores arriba para representar gráficamente la diferencia cuantitativa en el nivel de callosa entre dos orígenes diferentes con la función "inserto" hoja de cálculo (Figura 4H).
            Nota: Mutante / sobre-expresión de los candidatos fuertes líneas se scómo los diferentes niveles de callosa en comparación con el tipo salvaje, como ninguna de callosa, poco callose o la acumulación PD callose hiper.

Representative Results

En la configuración actual, dexametasona (DEX) inducible RNAi líneas de AtGSL8 [en adelante dsGSL8 (+ dex / -DEX)] se utilizaron, como gsl8 homocigotos mutantes de inserción de T-ADN son de plántulas letal ^18. Tres días de edad, las plántulas de ahiladas dsGSL8 y plántulas de tipo salvaje con Dex ± fueron expuestos a estímulos phototropic y gravitrópica. Se encontró que dsGSL8 (+ DEX) plántulas eran defectuosas en phototropism y gravitropismo ^15. Figura 5 muestra claramente que dsGSL8 (+ dex) no exhibe la flexión bajo la influencia de ambos phototropism y gravitropismo. Por otra parte, la alteración en el movimiento symplasmic en dsGSL8 (+ DEX) y dsGSL8 (-DEX) o Col-0 se analizó mediante un ensayo de carga HPTS. En consonancia con nuestra anterior conclusión, el movimiento HPTS colorante en dsGSL8 (+ DEX) fue sustancialmente mayor que en dsGSL8 (-DEX) o Col-0, Figura 6. calosa es uno de los reguladores clave de la PD SEL, y AtGSL8 se conoce como un callose sintasa PD ^16. Además, callose azul de anilina tinción se llevó a cabo, y dsGSL8 (+ dex) han demostrado persistentemente un nivel callose PD bajo antes y después de las respuestas trópico, como se muestra en la Figura 7.

Figura 1. Diagrama de flujo de los pasos que están involucrados en la estimulación de respuestas fototrópicos y gravitrópica. (A) Transferencia cultivan verticalmente plántulas de diferentes orígenes de plantas a una placa pero en líneas separadas. (B) Para phototropism, mantener las placas orientadas hacia la luz blanca unilateral en una caja oscura que se abre en un lado. Para gravitropismo, envuelva en primer lugar las placas con papel de aluminio, girar 90 °, y la transferencia a una caja oscura (coverere desde todos los lados). (C) El uso de un escáner, escanear las placas después de diferentes intervalos de tiempo, tales como 1,5 horas, 3 horas, 6 horas y 12 horas. (D y E) Estos paneles muestran la generación de datos a partir del análisis de datos usando ImageJ y hojas de cálculo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Medición del ángulo de doblado por ImageJ. (A) ver el programa Image J haciendo doble clic. (B) Las principales herramientas que se utilizaron en la medición del ángulo. (C) Abra la opción "File", seguido de la sub-opción "abierta" en la barra de herramientas para abrir J Imagen de microscopía de imágenes que se guardaron en formato de archivo JPEG. (D (F) Esquema de la medida del ángulo: abc define un fijo A, y el verdadero ángulo de flexión se calcula como B, que es igual a 180 ° - A. (G) Línea que representa la distancia del punto a al punto b. (H) La continuidad de la línea ab al punto donde haya que c A. (I) Resultado de archivo que muestra la imagen J Un valor. (J) Representante hoja de cálculo donde se presentan las mediciones promedio del ángulo de flexión, Standesviaciones estándar, errores estándar y los cálculos de la prueba t. (K) Bar diagrama gráfico que muestra las medidas del ángulo de flexión entre dos plantas diferentes orígenes Col-0 y mutantes dsGSL8 EMS. Las barras de error son SEM (error estándar de la media +) y *** representa el significado de T-test (valor de p> 0,001). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Esquema de los pasos que están involucrados en el ensayo de carga HPTS. (A) Panel que muestra la preparación de bloques de agarosa HPTS. (B) Panel que representa la escisión y la transferencia de las plantas de semillero y la carga de bloques de agarosa HPTS. (C) Panel se presentan los pasos que están involucrados en la muestrapreparación para la imagen confocal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Medición de la intensidad de callosa por ImageJ. (A) ver el programa ImageJ haciendo doble clic. (B) Las principales herramientas que se utilizaron en la medida de intensidad de callosa. (C) Abra la opción "File", seguido de la sub-opción "abierta" en la barra de herramientas para abrir ImageJ microscopía de imágenes que se guardaron en formato de archivo JPEG. (D) El icono rectangular en la barra de herramientas ImageJ. (E) El área seleccionada de la imagen para el análisis de la intensidad callose. Archivo de resultados (F) ImageJ que muestra el valor de la intensidad de callosa como "Mean". (G)hoja de cálculo representativo se presentan las mediciones promedio callose intensidad, desviaciones estándar, errores estándar y los cálculos de la prueba t. Diagrama del gráfico (H) de barras que representa la diferencia de intensidad de callosa entre los dos fondos de plantas. Las barras de error son SEM (error estándar de la media +) y *** representa el significado de T-test (valor de p> 0,001). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Reducción de expresión AtGSL8 conduce a respuestas defectuosas trópico. (A) Respuesta de Phototropic mostró por dsGSL8 (± dex) junto con Col-0. (B) gravitrópica respuesta mostrada por dsGSL8 (± dex) al ong con Col-0. dsGSL8 (+ DEX) no muestra respuestas phototropic o gravitrópica. dsGSL8 (+ DEX) y dsGSL8 (-DEX) simbolizan inducible líneas RNAi tratados con dexametasona y sin tratar dsGSL8, respectivamente. La barra de escala representa 0,2 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. El movimiento symplasmic aumentó después de la supresión de AtGSL8. Las imágenes de fluorescencia fueron tomadas después de HPTS carga a dsGSL8 ± superficies Dex hipocotilo de corte junto con el tipo salvaje Col-0. DsGSL8 (+ DEX) mostró más amplio movimiento de tinte HPTS, que demuestren un aumento symplasmic movimiento. La barra de escala representa 0,2 mm.com / archivos / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. AtGSL8 líneas suprimidas mostraron distribución PD callose simétrica entre los lados iluminados y sombreadas del hipocotilo. (A) Imagen de fluorescencia que muestra la tinción con azul de anilina callose para dsGSL8 (-DEX) a 0 h. (B) Imagen de fluorescencia que muestra la tinción con azul de anilina callose para dsGSL8 (-DEX) después de 6 h de phototropism. (C) Fluorescencia imagen que muestra la tinción con azul de anilina callose para dsGSL8 (+ DEX) después de 6 h de phototropism. Las flechas amarillas indican la acumulación de calosa en región sombreada de hipocotilo. La barra de escala representa 50 micras. (D) Diagrama gráfico de barras que representa la mañanaporte de callose PD que se acumuló en dsGSL8 (± dex) hipocotilos antes y después de 3 horas y 6 horas de phototropism. intensidades focos de fluorescencia se miden a partir de diez hipocotilos independientes (datos son la media ± SD; prueba t de Student, * p <0,01). Esta cifra se ha modificado a partir de (Han et al., 2014) ^15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En este manuscrito, una estrategia para la pantalla líneas mutantes / sobre-expresión que son defectuosos en las respuestas fototrópicos y gravitrópica debido a la alteración de callose PD y, por lo tanto, PD SEL se describe en detalle. la síntesis y la degradación de callosa PD se lleva a cabo principalmente por sintasas callose y β-1,3-glucanasas, pero la regulación de estas enzimas es controlada por muchos factores aguas arriba. Para buscar estos factores corriente arriba o candidatos que están directamente involucrados en la regulación de la EP, hemos puesto en marcha este método para el cribado. Esto se instale tiene algunas limitaciones como mutantes de algunas enzimas clave que regulan la biosíntesis PD callose (gsl8) son letales ¹⁵ y para encontrar estaría limitado por esta configuración tales mutantes. Además, si el gen candidato muestra rápida o más lenta respuesta trópico junto con EP abierto o cerrado, pero el nivel de callosa se mantiene sin cambios, entonces se necesita un análisis detallado para caracterizar mejor estos candidatos. Los factores críticos y proce solución de problemasEPE en cada paso son también elaboró. En primer lugar, en preparación del medio, un factor crítico que puede afectar el crecimiento de las plantas es el pH de los medios, que debe oscilar desde 5,7 hasta 5,8. En segundo lugar, secado de la superficie de placas de agar apropiado es importante; sería difícil de levantar los 3 días de edad, las plántulas sin ningún daño a partir de placas de agar con alto contenido de agua. Sin embargo, demasiado secado de placas de agar puede causar algunas grietas en los medios de comunicación durante la incubación y el resultado en el crecimiento de plántulas asimétrica. Durante la esterilización de la superficie de las semillas utilizando solución de hipoclorito de sodio, se debe tener cuidado para eliminar el hipoclorito de sodio completamente por lavado repetido con ddH autoclave ₂ O, ya que es un agente de blanqueo fuerte. En autoclave _ddH2O Debe prepararse y manipularse de forma aséptica, como las antiguas existencias podrían causar la contaminación fúngica en placas de EM. Después de la esterilización, las semillas se estratifican por tratamiento en frío para sincronizar la germinación. Este proceso se puede realizar ya sea por la transferrinag esterilizar las semillas húmedas directamente a una cámara frigorífica en condiciones de oscuridad o primera salpican las semillas en placas de EM y luego transferir las placas a una habitación fría en condiciones de oscuridad. Sin embargo, preferimos esta última, ya que da un crecimiento más uniforme de las plantas de semillero. Mientras que salpican las semillas, la distancia entre dos semillas adyacentes debe ser al menos de 0,1 cm porque las semillas muy de cerca de puntos se traduciría en el crecimiento de las plántulas, que son muy difíciles de transferir en experimentos posteriores superpuestos.

Para las respuestas phototropic y gravitrópica adecuadas, las plántulas no deben ser expuestos a la luz y deben permanecer en buen estado. Para evitar los efectos de fondo de luz blanca, seleccionar cuidadosamente las plántulas bajo una fuente de luz verde en el cuarto oscuro como las plantas no responden a la luz verde. Fuente de luz verde se puede generar cubriendo la fuente de luz blanca utilizando hojas de vinilo verde transparente. Para la selección de las plantas de semillero, un palillo de dientes esterilizado es la mejor opción. touch the parte muy inferior del hipocótilo con el palillo de dientes para levantar las plantas de semillero de modo que puedan ser fácilmente transferidos a una nueva placa. Todas las plantas de semillero debe ser similar en tamaño y la orientación del gancho. Durante nuestros experimentos, hemos visto que si la orientación de gancho está en el lado opuesto de la fuente de luz, las plantas muestran una respuesta más rápida trópico que las plantas con la misma orientación de gancho como la fuente de luz. Normalmente, en el caso de phototropism, se puede ver una clara diferencia en el ángulo de flexión entre los verdaderos candidatos y Col-0 a menos de 3 horas, mientras que en el caso de gravitropismo, por lo general toma 6-12 horas. Por último, para tener datos estadísticamente relevantes, un mínimo de tres réplicas biológicas y 20 plántulas se necesitan cada vez.

Para probar la extensión del movimiento symplasmic entre diferentes orígenes vegetales, HPTS colorante de carga es una técnica conveniente, ya que no necesita herramientas sofisticadas e instrumentación. Para el ensayo de carga HPTS, el porcentaje de gEL en HPTS bloques de agarosa es de gran importancia, como un gel muy frágil o duro no dará resultados óptimos. Es mejor utilizar un erlenmeyer de 50 ml con caucho suelto y no utilizar un matraz de gran volumen para la ebullición de agarosa con 10 ml de agua. bloques de agarosa HPTS se pueden utilizar durante una semana después de la preparación si se mantiene envuelto con papel de aluminio a 4 ° C. Otro factor clave en el ensayo de carga HPTS es la escisión de la región gancho del hipocotilo. La escisión se debe realizar con tijeras de disección afilados y en una posición similar para todas las plantas de semillero. La escisión con tijeras de punta roma puede causar daños no deseados a las plántulas y puede obstaculizar HPTS carga. Además, las condiciones de crecimiento de las plántulas y etapas de desarrollo pueden jugar un papel crucial en el movimiento de tinte, como la acumulación de callosa es más propenso a responder a tales cambios, que finalmente se dan cuenta de la obstáculo en el movimiento de tinte. Por lo tanto, el crecimiento de las plántulas en condiciones óptimas es necesario. Callosa en la EP desempeña un papel clave en elrespuestas Trópico de plántulas ahiladas mediante la regulación de la EP SEL, lo cual es importante para la formación del gradiente de auxina ^15. niveles callose pueden detectarse por tinción con azul etiquetado o inmunoelectrónica anilina. La tinción con azul de anilina es un método sencillo y rápido para detectar el nivel callose. Dado que las células del hipocótilo tienen alta presión de turgencia y una capa epi-cutícula, no es fácil para que el colorante penetre las células. Por lo tanto, hemos desarrollado el método de tinción de corte para permitir que el colorante azul de anilina para penetrar fácilmente. Sin embargo, existe el riesgo de la síntesis de nuevo callose que puede influir en los resultados de la tinción, que es una limitación del método normal de tinción callose. Para evitar tales efectos, el protocolo de tinción se modifica mediante la adición del inhibidor de la sintasa callose glucosa 2-D-desoxi (DDG) para el tampón de tinción. Por lo tanto, este protocolo implica la medición de callose pre-existente sólo en la región inferior del hipocótilo que es exactamente por debajo del sitio de corte. Evitar el uso de prepar reciéned azul de anilina, y mantener la solución de azul de anilina a temperatura ambiente durante un mínimo de 48 horas antes de su uso. Nos dimos cuenta de que la tinción con solución de azul de anilina fresco no da resultados óptimos de tinción de callosa.

En general, hemos presentado un conjunto de estrategias que se pueden utilizar para la detección rápida de mutantes / líneas sobre-expresión con una respuesta trópico defectuoso o mejorada mediante la alteración de SEL PD mediante la modulación directa o indirectamente callose PD. Un hecho anteriormente acerca de las respuestas trópico fue restringido mayormente a la acción de los transportistas de auxina y reproductores de señalización, tales como PINIOD ^2-14. Además, también hemos establecido un papel crítico de movimiento symplasmic de auxina en el mantenimiento de un gradiente de auxina en el sistema de hipocotilo ^15. La simplicidad y versatilidad de este método, sin duda, refuerzan su utilidad en la investigación de genes candidatos para su regulación de la EP SEL, por lo tanto juega un papel vital en el desarrollo de la planta, incluyendo las respuestas trópico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds