Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bir Strateji Tropic Tepkisi kaloz aracılı Plasmodesmal Gating Rolü doğrulamak için

Published: April 17, 2016 doi: 10.3791/53513
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1
1Division of Applied Life Science (BK21 plus program), Plant Molecular Biology and Biotechnology Research Center, Gyeongsang National University, 2Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Bu makalede, tropik yanıtı sırasında plasmodesmal geçirgenliği ve oksin gradyanı kontrol eden genlerin taranması için yöntemler açıklanmaktadır. Bu hipokotil içinde tropik yanıtın derecesi ölçümü içerir Arabidopsis thaliana ve 8-hydroxypyrene-1,3,6-trifülfonik asit (HPTS) yükleme ve nihayet kaloz seviye değerlendirme ile plasmodesmal geçirgenliği kontrol edilmesi.

Abstract

Bitki hormonu oksin ışık ve yerçekimine tropik yanıtlar dahil olmak üzere birçok büyüme ve gelişim süreçleri, önemli bir rol oynar. Bir oksin degrade kurulması Fototropizma ve Gravitropizma giden bir anahtar olaydır. Daha önce, kutup oksin nakil aracı (PAT) farklı bitki hücre domeni bir oksin gradyanı oluşturulması gösterilmiştir. Bununla birlikte, Han ve ark., En son, uygun oksin gradyan oluşumu için, komşu hücreler plasmodesmal kaloz aracılı symplasmic bağlantısı da kritik bir faktör olduğunu göstermiştir. Bu yazıda, strateji plasmodesmal kaloz sentezini modüle yoluyla symplasmic bağlantı değiştirerek Fototropizma ve Gravitropizma etkileyebilir belirli genlerin rolünü aydınlatmak için, tartışılmıştır. İlk adım, vahşi tip ile mutantların veya bir genin aşırı ifade çizgileri 3 günlük bir soluk fidelikler gelen anormal tropik yanıtları ekrana. Bu ön elemePAT fonksiyonlu veya symplasmic bağlantı kontrol eden gen bir dizi tanımlanmasına yol açabilir. İkinci tarama symplasmic bağlantı etkileyerek değişmiş tropik tepkileri göstermek adayların sıralamasını içerir. Bu tür adayları ele almak için, bir symplasmic izleyicinin hareketi ve plasmodesmal kaloz birikimi incelendi. Bu strateji tropik tepkiler ve diğer gelişim süreçleri sırasında doğrudan ya da dolaylı symplasmic bağlantı düzenleyen yeni aday genleri keşfetmek yararlı olacaktır.

Introduction

Bitkiler, sapsız yaşam organizmalar gibi çeşitli çevresel uyaranlara yönelik hücre-hücre sinyalizasyon son derece sofistike bir ağ geliştirdi. Tropik tepkiler bitkiler çevresel uyaranlara yanıt hangi olayların biridir. Bitkiler iki tropik yanıtları Fototropizma ve Gravitropizma göstermektedir. Fotosentetik bitkiler maksimum enerji hasat bilimciler tarafından ışık kaynağına doğru bükün. Benzer şekilde, Gravitropizma yerçekimi merkezine doğru bitkilerin büyümesini sağlar. Bu tür tropik yanıtlara önde gelen temel mekanizma fitohormondur oksin 1 asimetrik gradyan oluşmasına yol açar. Yerel oksin degrade oluşumunun hareket iyi karakterize edilir; Bu mekanizmanın katılan genler hormon eylem 2-8 için bir yol haritası sunar. Oksin pimin şekillendirilmiş (PIN) ve akış taşıyıcı ve p-glikoproteinler spesifik konumu, donör hücrelerin 9,10 hücre duvarına sitoplazmadan oksinin hareketini gerçekleştirir. Furthermore, örneğin AuX1 / lax aile proteinleri gibi oksin akışı taşıyıcı, aktif H + / IAA symport aktivitesi ile, oksin son komşu Alıcı hücrelere 2,11,12 teslim edilir. oksin Bu yönlü hareket Polar oksin taşınmasının (PAT) olarak bilinir. PAT, çeşitli gelişim aşamalarında farklı çevresel uyaranlara 13,14 yanıt olarak, bir diferansiyel oksin dağılımına yol açar. Ayrıca, bu oksinin akını ve akış taşıyıcı herhangi bir lokalizasyonu ve ifade bozulması gelişim hatalara yol açan, oksin gradyanı bir aksamaya neden PAT ciddi bir değişikliğe yol açar. Son zamanlarda, Han ve ark. plasmodesmal düzenlemesi oksin gradyanı 15 korumak için de gerekli olduğu bildirilmektedir. Bugüne kadar, 30 dan fazla plasmodesmal proteinleri 16 tespit edilmiştir. Bu proteinler arasında, AtGSL8 plasmodesmata (PD) en kaloz sentezi için önemli bir enzim olarak bildirilmiştir ve bu nedenle maint önemli bir rol oynar edilmiştirPD boyut dışlama sınırı (SEL) Aining. Bastırılmış AtGSL8 sentezleme vahşi tip fide 15 aksine hiçbir tropik cevap sağlayan bozuk bir oksin gradyan modeli ile sonuçlanmıştır.

Bu yazıda, yöntemler temin edilmiştir PD düzenlenmesinde rol yeni aday genleri keşfetmek için. Bu kaloz biyosentezini PD katkıda bulunan önemli bir enzim olduğu AtGSL8, bu yöntemleri test etmek için bir model protein olarak kullanılmıştır. Nedeniyle knock-out gsl8 mutantlar 17 fide-öldürücülüğü için, deksametazon (dex) -inducible RNAi hatları, daha önce yayınlanan raporda 15 uyarınca kullanılmıştır. Burada sağlanan bir strateji PD SEL kontrol hipokotil tropik yanıt olarak implike genleri taranması için adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Değiştirilmiş phototropic ve Gravitropic Cevaplarının ile Mutants 1. Eleme

  1. Deney öncesinde% 0.8 Agar Bir Gün ile 1x Murashige ve Skoog (MS) Orta, pH 5.7, hazırlayın.
    1. 2 L'lik konik bir şişe, çift damıtılmış 800 ml su eklenir ve bir manyetik çubuk ile karıştırıldı.
    2. erlene MS tuzu 4.4 g ekleyin.
    3. 2- (N-Morfolino) etan sülfonik asit (MES), 0.5 g ekleyin ve tuzlarının tüm tamamen çözülene kadar karıştırın.
    4. 1 M KOH ile 5.7 ortamın pH ayarlayın.
    5. Bir kitle silindire orta aktarın ve GKD 2 O. ile 1 L son hacim getirmek
    6. 2 L'lik bir erlene maddeyi tekrar geri dökün ve bitki ağarı 8 g ekleyin.
    7. alüminyum folyo ile sıkıca erlene ağzını sarın.
    8. 121 ° C, 15 psi, 15 dakika boyunca MS ortamı ve GKD 2 O Otoklav ve otoklav sonrası, 60 ° C inkübatör ve oda sıcaklığında GKD 2 O orta tutmak.
    9. 60 ° C'ye soğutulduktan sonra, bir laminar akış tezgahı 125 x 125 x 20 mm3 kare plakalara orta (her plakada 50 mi) dökün.
    10. Agar plakaları kısmen açık tutarak, yaklaşık 1 saat boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin. Plakalar hemen kullanılmazsa, bir buzdolabında 4 ° C'de plastik wrap ve mağaza kullanarak bunları mühür.
  2. % 1.1 sodyum hipoklorit ile tohum yüzey sterilize ve bölüm 1.1 hazırlanmıştır 1x MS agar plaklarına tohumları nokta.
    Not:. Burada, Arabidopsis thaliana {Col-0 tohum, dsGSL8 (Col-0)} 15 tropik yanıtı, kaloz boyama ve HPTS yükleme Arabidopsis thaliana {Col-0 ve dsGSL8 (Col-0) EMS mutant} tohumlar (kullanılmaktadır ) yayınlanmamış, Şekil 2'de tropik karşılık kullanılmaktadır.
    1. Bir şişe GKD 2 O 300 ml otoklavlayın.
    2. Her arka plan yaklaşık yüz tohum ekleme, yanimutant / aşırı ifadesi hattı ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne vahşi tip (Col-0) tohumlar,.
    3. 4 ° C buzdolabından 1x MS agar çıkarın ve kısmen açık pozisyonda laminer akış bankta onları kurutun.
    4. Bir 0.2X çamaşır suyu (% 1.1 sodyum hipoklorit) 1 ml ekleyerek, tohumların yüzey sterilize edilir ve 5 dakika boyunca 250 rpm'de çalkalayıcı üzerinde mikrosantrifüj tüpleri tutun.
    5. tohumlar yerçekimi tarafından dibe ve sonra mikropipet ile çamaşır suyu kaldırmak edelim.
    6. Tohum taze GKD (otoklav) 2 O 1 ml ilave edilir ve mikrosantrifüj tüpü birkaç kez ters yüz edilerek iyice karıştırın. tohumlar yeniden yerleşmek ve ardından su çıkarmak edelim.
    7. Adımı tekrarlayın 1.2.6 5-6 kez.
    8. Son yıkamadan sonra bırakıldı tohumların su hacmi iki katı ekleyin.
    9. Nokta tohumları 200 ul ihtiva eden 1 ml'lik bir mikropipet ucunu kullanarak bir yarı kurutulmuş 1x MS agar plakası üzerine sterilize edilmiş tohumlar (bölgesindekicluding su).
      1. İki tohum ve iki tohum sıraları arasındaki 1.8 cm minimum arasında yaklaşık 0.1 cm mesafe bırakınız. Kare plaka (125 x 125 x 20 mm 3) başına beş yatay satırlardaki tohumları nokta. Su plakası üzerine kapağı yerleştirmeden önce hafifçe kurumaya bırakın.
    10. Cerrahi bant ile plakaları mühür dikey plakaların her yığını ve alüminyum folyo ile sarın.
    11. (Işık erişimi olmayan) bir karanlık kutuya sarılmış plakaları aktarın. Ardından, 3 gün boyunca 4 ° C oda / buzdolabında karanlık kutu tutmak.
    12. Bu adımdan başlayarak, değişmeden plakaların yönde tutmak. soğuk tedavi için 3 gün sonra, bir sonraki 3 gün boyunca 22 ° C'de, bir bitki kültür odası içinde karanlık kutu tutmak. 3 gün sonra, karanlık bir odada yeşil ışık altında tohumlarının çimlenme durumunu kontrol edin.
      NOT: Genellikle 3 gün eski Col-0 solmuş fidan uzunluğu 1.6 cm'ye kadar büyüyebilir.
  3. değişmiş phototropic a analizBelirli bir genin hatları mutantlar veya aşırı ekspresyonu ND gravitropic yanıt. Karanlık bir odada yeşil ışık altında sadece benzer büyüklükteki ve dikey yetiştirilen düz fide seçin. steril kürdan ucu kullanarak taze 1x MS agar plaka seçilen fidan aktarın.
    1. Yavaşça herhangi diğer parçaları dokunmadan kendi hipokotil en alt kısmında gelen fidan seçin. fide hepsi aynı kotiledon / kanca yönünü olduğundan emin olun ve aktarıldıktan sonra, fide kanca yönelimi aynı kalır. Her sırada bulunan her bir arka plan ve daha fazla analiz için her bir zaman noktası için iki levha, en az 20 fide az kullanın.
      Not: Dört farklı geçmişlere her plaka (4 satır) mukayese edilebilir.
      deksametazon (dex) -inducible RNAi / aşırı ifadesi hatları kullanırken, bir 1x MS yukarıdaki fidan aktarmak (1x MS içeren levha,% 0.8 ağar ortamı 20 uM dex ile desteklenmiş) fo + Dex MS plakası ile birlikte plaka: Opsiyonelr 3 saat ve karanlık kutu dikey plakaları tutun.
    2. phototropic yanıtı kontrol etmek için, açılan sadece bir tarafı ile birlikte bir kara kutu dikey olarak yukarıdaki plakaları aktarın. Tek taraflı beyaz ışık ile bir bitki büyüme odasına plakaları içeren kara kutu aktarın. tek taraflı ışık sağlamak için, ışık kaynağından (değil ön taraf) doğru plakanın kenarı yerleştirin. Şekil 1'de kurulum bakınız.
    3. Benzer bir şekilde, gravitropic tepki kontrol dikey transfer fide ile plakaları tutmak ve alüminyum folyo ile kaplayın. Sonra, 90 ° dikey plaka yönünü değiştirmek ve her taraftan kaplı siyah kutu içinde saklayın. Şekil 1'de kurulum bakınız.
    4. Verilen zaman noktalarında sonra (genellikle 1.5 saat, 3 saat, 6 saat ve 12 saat) bir tarayıcı ile plakaları tarama ve JPEG formatında resim kaydedin.
    5. (Şek ImageJ yazılımı (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) kullanarak fide eğilme açısını ölçmekure 2).
      1. Çift tıklayarak (Şekil 2A) tarafından ImageJ programını başlatın.
        Not: açı ölçümü kullanılan önemli araçlar Şekil 2B'de de gösterilmiştir.
      2. Alt seçeneği "açık" ImageJ araç çubuğunda ve tropik bükme açısını (Şekil 2C) ölçmek için JPEG dosya biçiminde kaydedilmiş açık resimlerin ardından "Dosya" seçeneğini tıklayın.
      3. Sol ya da sağ fare butonuna tıklayarak, sırasıyla Şekil 2B'de gösterildiği resmin üzerine yakınlaştırmak veya uzaklaştırmak için büyüteç aracını tıklatın.
      4. Resmi (Şekil 2B) .Next sürüklemek ve konumlandırmak için kaydırma aracını tıklatın (Şekil 2E) eğilme açısını ölçmek için açı aracını tıklayın.
        1. Orijinal hipokotil büyüyen yön noktası 'a', eğilme başlangıç ​​noktası 'b' (Şekil 2F), fareyi sürükleyin ve sol popo tıklayın üzerinde çift sol tıklama yapınilk satırı (Şekil 2G) çizmek için.
        2. Bükülme ucu noktasının 'c' gelin b fareyi sürükleyin ve ikinci satırı (Şekil 2H) çizmek için sol düğmesini tıklayın ve sabit bir formu açı A. Not: Gerçek bükme açısı açı 180 ° eşittir B, - açı A. (Şekil 2F).
        3. Ölçü ve kayıt açı klavyede 'M' tuşuna basarak bir. Şekil 2I gösterildiği gibi sonuç dosyası ayrı ayrı açılacaktır. Tedbir ve tek fideleri biri tüm kaydedin. Örneğin, ilk olarak mutant hatlar için daha sonra Col-0 arasından Hipokotillerin tüm bükülme açısı ölçümü ve.
    6. av yapmak için tablo dosyasına ImageJ gelen veri kümesi transferHer bir arka açıları bükülme talaması.
    7. Kantitatif analiz için, standart hata çubukları ve olasılık değerleri (Bakınız Şekil 2) de dahil olmak üzere istatistiksel test sonuçları, bir çubuk grafik şeması yapmak.
      1. Gerçek eğilme hesaplayın açı B ve, yani, tablo kullanarak bir formül tasarım açı B = 180 ° - açı Bir not: açı A ImageJ analizinden elde edilen değerdir.
      2. Ortalama eğilme açısını ölçmek açı Her arka plan kullanarak tablo araçları (Şekil 2J) B.
      3. Tablo "formüller" aracını (Şekil 2J) kullanarak her ölçüm için çoğaltır arasındaki standart sapmayı analiz eder.
      4. SIG testOrtalama eğilme açısı ve yukarıda da belirtildiği gibi hesaplanan standart sapma değerleri t-testi uygulanarak sonuçların anlamlılığını.
      5. Grafiksel tablo "insert" aracını (Şekil 2K) kullanarak iki farklı geçmişlere arasında bükülme açısı nicel farklılığı temsil için yukarıdaki değerleri kullanarak bir çubuk diyagramı çizin.
        Not: güçlü bir aday genlerin Mutant / aşırı ifadesi hatları hızlı eğilme veya yavaş eğilme gibi hiçbir eğilme olarak vahşi tip göre belirgin farklılıklar, gösterecektir.

Bir Değiştirilmiş PD kaloz Düzeyi nedeniyle PD SEL Değişiklik Arızalı Tropic Tepkilerin 2. Ekran Bitki Hatları

  1. HPTS Agaroz Blokları ile Fidan Top 8-hydroxypyrene-1,3,6-trifülfonik asit (HPTS) Boya Yükleniyor bir Hipokotil Yükleme Testi gerçekleştirmek ve Mutant Arasında Dye Hareketi karşılaştırın / Aşırı ifade Hatları ve Col-0.
    1. HPTS Agaró hazırlayınhipokotil Yükleme deneyi için se blokları.
      1. 50 ml konik bir şişe içinde GKD 2 O 10 ml alın ve bir% 1 agaroz jeli hazırlamak için 0.1 g agarozun ekleyin. arada çalkalanarak 1-2 dakika boyunca bir mikrodalga fırın içinde agaroz kaynatılır ve 5 dakika boyunca soğumaya bırakın.
      2. % 1 agaroz çözeltisi 10 ml HPTS 50 mg ekleyin ve çözelti yeşil oluncaya kadar karıştırın.
      3. 10 mm Petri kabı, yukarıda dökün ve 15 dakika boyunca katılaşmaya sağlar.
      4. Küçük agaroz blokları (0.5 x 2 cm 2) yapmak için keskin bir diseksiyon bıçak ile agaroz katılaşmış HPTS kesin.
    2. HPTS boya yükleme deneyi için bitki örneklerini hazırlayın.
      1. HPTS boya yükleme deneyi için bir platform ayarlayın; Şekil 3A'da gösterildiği gibi, yeni bir MS ortamı plaka üzerinde mikroskop kapak slayt (24 x 50 mm2) yerleştirin.
      2. Bir keskin cerrahi makas kullanarak kanca tabanından tüketim 3 gün eski solmuş fidanları.
      3. Hemeneksizyon konumundan hipokotil sadece 0.5 cm kapak slayt üzerinde kalmalıdır şekilde mikroskobik kapak cam yüzeyine yukarıdaki fideleri (her kökenli 5 fidan az) aktarmak ve hipokotil geri kalanı temas etmelidir Şekil 3B'de gösterildiği gibi, araç.
      4. eksize alanı HPTS agaroz blok temas edecek şekilde, 5 dakika boyunca (bir kesilmiş kancalı) hipokotil üstünde HPTS agaroz blok yerleştirin.
      5. Yükleme 5 dakika sonra, GKD 2 O içeren 10 mm Petri kabı hipokotiller transferi ve sürekli çalkalanarak 15 dakika boyunca GKD 2 O hipokotiller yıkama hipokotil yüzeyinden agaroz sil.
    3. Konfokal Mikroskopi için Örnekleri hazırlayın.
      1. konfokal lazer tarama mikroskobu altında gözlem her kökenli 5 fide az seçin.
      2. Lazer kanalında belirli exc 488 nm dalga boyuna ayarlanmışve yağışa band geçiren emisyonu için 500 550 nm.
      3. GKD 2 O. ile yıkandıktan sonra yeni bir mikroskopik slayt 2 takım Transfer fidanları (bir Col-0 + bir mutant) slayt çift distile su 100-150 ul ekleyin ve bir kapak slayt ile kaplayın. konfokal mikroskop aşamasına slayt Shift.
      4. Aydınlık alan (beyaz ışık) aydınlatma kullanarak (20X veya 40X objektif lens ile) hipokotil bölgesini odaklanın. Sonra, floresan için slaytlar tarayın.
      5. 10 setleri en az fotoğraf çekmek ve yükleme noktasından boya hareketinin ölçüde kontrol ederek iki arka karşılaştırın.
        Not: değişmiş symplasmic hareketi ile Mutant / aşırı ifadesi hatları yabani tip Col-0 ile karşılaştırıldığında boya yükleme farklı desenleri gösterecektir.
  2. Mutant içinde kaloz Seviye Analiz / Farklı HPTS Boya Hareketi Compar Değiştirilmiş phototropic ve Gravitropic Tepkisi gösterme ve gösterme Üzeri ifade Hatlarıed Col-0.
    1. anilin mavisi kaloz boyama boya hazırlayın.
      1. Otoklava GKD 2 O 1 M glisin, pH 9.5 ve% 0.1 (w / v) anilin hüzünlendiriyorsun
      2. 3 hacim oranları:% 0.1 anilin mavi ve 2 1 M glisin karıştırılarak boyama tampon yapın. Örneğin, lekeleme tampon maddesi, 50 ml, 20 mavi% 0.1 anilin ml ve 1 M glisin 30 ml alır. Not: boyama kullanmak ve karanlıkta saklayın öncesinde 48 saat en az tampon yapın.
    2. Leke bükülmüş ya da kaloz özgü anilin mavisi ile fidan olmayan bükülmüş.
      1. Boyama işlemi sırasında novo kaloz sentezini inhibe etmek için, lekeleme tampon maddesi, 50 ml 1.5 mM 2-deoksi-D-glukoz (DDG) nihai hacim ekleyin.
      2. (Ya da tropik yanıtı olmadan) kaloz boyama 3 günlük eski solmuş fidan alın.
      3. İnce cerrahi makas kullanarak kanca bölgeden fidan kesin.
      4. ihtiva küçük bir Petri kabındaki fidan aktarınBir kürdan ucu kullanarak boyama tamponu 2 ml ing.
      5. 30 rpm'de sürekli çalkalanarak, 2 saat boyunca karanlıkta lekeleme tampon maddesi ile fideleri inkübe edin.
      6. Boyamadan sonra, fazla boyama tampon kaldırmak için 2 dakika süreyle GKD 2 O fideleri yıkayın.
      7. konfokal lazer tarama mikroskobu altında gözlem için her bitki kökenli 5 fide az seçin.
    3. konfokal mikroskopi örnekleri hazırlamak:
      1. Mikroskop temizlemek için sette fidan aktarın (bir Col-0 + bir mutant) GKD 2 O. ile yıkandıktan sonra slaytlar
      2. GKD 2 O 100-150 ul ekleyin ve bir kapak slayt ile kaplayın. konfokal mikroskop aşamasına slayt Shift.
      3. bir lazer kanalında belirli uyarma için 405 nm'de ve anilin, mavi floresan görüntüleme için 500 nm ile 550 nm emisyon dalga boyu olarak ayarlayın.
      4. 10X ve geç ilk, odak haline hipokotil bölgesini getirparlak alan (beyaz ışık) aydınlatma kullanılarak 20X veya 40X objektif lensler r.
      5. Ardından, filtrelenmiş ışık açmak floresan slaytları taramak ve görüntüleri kaydetmek.
      6. ImageJ yazılım (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) ile kaloz sinyal yoğunluğu ölçmek (Bakınız Şekil 4).
        1. JPEG dosya formatına Olympus Görüntü İkili formatta (* .oib) den konfokal mikroskopi resim formatını değiştirin. Not: Yalnızca JPEG formatında ImageJ yazılım tarafından desteklenmektedir.
        2. Çift tıklayarak (Şekil 4A) tarafından ImageJ programını başlatın. Not: Oklar kaloz yoğunluğu ölçümü (Şekil 4B) kullanılmak üzere dikdörtgen aracı göstermektedir.
        3. Kaloz yoğunluğunu (Şekil 4C) ölçmek için JPEG dosya formatında kaydedilen ImageJ araç çubuğundaki "açık" alt seçeneği ve açık mikroskopi resimlerin ardından "Dosya" seçeneğini tıklayın.
        4. Ima dikdörtgen simgesini tıklayınGEJ araç çubuğu (Şekil 4D).
        5. , Sinyal yoğunluğu analiz resmin üzerine imleci ve alanı seçmek için muayene edilecek (Şekil 4E)
        6. Tedbir ve klavye (Şekil 4E) üzerinde 'M' tuşuna basarak sinyal yoğunluğu için sayısal değerleri kaydedin. Not: Sonuç dosyası ayrı ayrı (Şekil 4F) açılacaktır.
        7. Tedbir ve yoğunluğu her bitki kökenli fidan tüm tek tek değerleri kaydeder.
          Not: ImageJ, sonuç dosyası "Ortalama" seçilmiş "Alan" sinyal şiddetini gösterir.
      7. ImageJ sonucu dosyasından ortalama değerleri kopyalamak ve kantitatif analiz için tablo dosyasında yapıştırın.
      8. Kantitatif analiz için, standart hata çubukları ve olasılık değerleri (Şekil 4) dahil olmak üzere istatistiksel testler, bir çubuk grafik şeması yapmak.
        1. ortalama sinyal yoğunluğu ölçmektablo "formüller" aracını (Şekil 4G) kullanarak her arka plan (ImageJ itibaren ortalama).
        2. Tablo "formüller" aracını (Şekil 4G) kullanarak her ölçüm için çoğaltır arasındaki standart sapmayı analiz eder.
        3. thespreadsheet "formüller" aracını kullanarak standart hata (SE) hesaplayın.
          (Ler) nüfusu standart sapmasıdır ve (n) örnek büyüklüğü (gözlem sayısı) olduğu, SE = s / √ n edin.
        4. ortalama sinyal yoğunluğu ve yukarıda da belirtildiği gibi hesaplanan standart hata değerlerine bir t-testi uygulanarak sonuçların önemini test edin.
        5. Grafiksel tablo "insert" aracını (Şekil 4H) kullanarak iki farklı geçmişlere arasındaki kaloz düzeyinde nicel farklılığı temsil için yukarıdaki değerleri kullanarak bir çubuk grafik şema çizin.
          Not: Güçlü adayların Mutant / aşırı ifadesi hatları olacaktır sne kadar farklı örneğin hiçbir kaloz az kaloz veya hiper PD kaloz birikimi yabani tipiyle karşılaştırıldığında kaloz seviyeleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Homozigot gsl8 T-DNA sokma mutantlan öldürücü 18 fide gibi bugün de, AtGSL8 ve deksametazon (Dex) -inducible RNAi hattı kullanılmıştır [(+ Dex / -dex) dsGSL8 bundan böyle]. DsGSL8 ve ± dex vahşi tip fide üç gün eski solmuş fideler phototropic ve gravitropic uyaranlara maruz bırakıldı. Biz dsGSL8 (+ dex) fide Fototropizma ve Gravitropizma 15 kusurlu olduğu bulundu. Şekil 5 açıkça dsGSL8 (+ dex) hiçbir Fototropizma ve Gravitropizma hem etkisi altında eğilme sergilediğini göstermektedir. Ayrıca, dsGSL8 (+ Dex) ve dsGSL8 (-dex) ya da Col-0 symplasmic hareketinde değişiklik bir HPTS yükleme testi ile analiz edilmiştir. Daha önceki paralel olarak, HPTS boya dsGSL8 hareket (+ Dex), dsGSL8 (-dex) ya da Col-0 göre önemli ölçüde daha geniş Şekil 'de gösterildiği gibi> 6. kaloz PD SEL anahtar regülatörleri biridir ve AtGSL8 PD kaloz sentaz 16 olarak bilinir. Ayrıca, kaloz anilin mavi boyama gerçekleştirildi ve Şekil 7'de gösterildiği gibi dsGSL8 (+ Dex) sürekli önce ve tropik tepkiler sonra düşük PD kaloz seviyesi göstermiştir.

Şekil 1
Phototropic ve gravitropic tepkilerin uyarılması söz konusu adımları Şekil 1. Akış çizelgesi. (A) Transfer dikey farklı bitki kökenden gelen bir plaka ama ayrı hatlarda fidan yetiştirilen. (B) Fototropizma sadece bir tarafında açılan bir siyah kutu tek taraflı beyaz ışığa doğru bakan plakaları tutun. Gravitropizma, ilk döndürmek, 90 ° alüminyum folyo ile sarın tabak ve (karanlık kutuya covere aktarmakd her taraftan). Bir tarayıcı kullanarak (C), örneğin 1.5 saat, 3 saat, 6 saat ve 12 saat kadar farklı zaman aralıklarında, sonra tabak tarar. (D ve E) Bu paneller tablo dosyaları kullanarak ImageJ ve veri analizi veri nesil gösteriyor, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
ImageJ tarafından bükülme açısı Şekil 2. ölçümü. (A) çift tıklayarak Resim J programı görüntüleyin. (B) açısı ölçümünde kullanılan başlıca araçlar. (C) JPEG dosya biçiminde kaydedilmiş mikroskopi resimleri açmak için Resim J araç çubuğundaki alt seçeneği "açık" ve ardından "Dosya" seçeneğini açın. (D (F) Anahat: açı abc sabit tanımlar açı A, ve gerçek bükme açısı olarak hesaplanır açı 180 ° eşittir B, - açı A noktasından b noktasına a mesafeyi temsil eden A. (G) Hat. (H) Süreklilik hattının ab c yapma işaret açı A. (I) Görüntü J gösteren sonuçlar dosyası açı Bir değer. (J), Stan ortalama eğilme açısı ölçümleri görüntüleme Temsilcisi tablo dosyasıDard sapmalar, standart hatalar ve t-testi hesaplamaları. (K) Çubuk grafik şeması iki farklı bitki geçmişlere Col-0 ve dsGSL8 EMS mutant arasındaki bükülme açısı ölçümleri gösterilir. Hata çubukları SEM (ortalama + standart hata) ve *** T-testi (p değeri> 0.001) önemini ifade etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
HPTS yükleme deneyinde söz konusu adımları Şekil 3. Anahat. HPTS agaroz blokları hazırlanışını gösteren (A) Panel. (B) Panel eksizyonu ve fide transferini ve HPTS agaroz blok yükleme temsil eder. (C) örnek olarak söz konusu adımları gösteren panelKonfokal görüntüleme için hazırlık. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
ImageJ tarafından kaloz yoğunluğu Şekil 4. ölçümü. (A) çift tıklayarak ImageJ programı görüntüleyin. (B) kaloz yoğunluk ölçümünde kullanılan başlıca araçlar. (C) JPEG dosya biçiminde kaydedilmiş mikroskopi resimleri açmak için ImageJ araç çubuğundaki "açık" alt seçeneği ardından "Dosya" seçeneğini açın. (D) ImageJ araç çubuğundaki dikdörtgen simgesi. (E) kaloz yoğunluğunu analiz etmek için görüntünün seçilen alanı. "Ortalama" olarak kaloz yoğunluk değerini gösteren (F) ImageJ sonucu dosyası. (G)ortalama kaloz yoğunluk ölçümleri, standart sapma, standart hata ve t-testi hesaplamaları görüntüleme Temsilcisi tablo dosyası. İki bitki kökenden arasındaki kaloz yoğunluk farkı temsil eden (H) Çubuk grafik diyagramı. Hata çubukları SEM (ortalama + standart hata) ve *** T-testi (p değeri> 0.001) önemini ifade etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
AtGSL8 ifade Şekil 5. indirgenmesi tropik yanıt kusurlu yol açar. (A) phototropic yanıt (deksmedetomidin ±) dsGSL8 gösterdiği birlikte Col-0. (B) (deksmedetomidin ±) dsGSL8 gösterilen Gravitropic yanıtı ark ong Col-0. dsGSL8 (+ dex) ile. Hiçbir phototropic veya gravitropic tepkilerini gösterir dsGSL8 (+ dex) ve dsGSL8 (-dex) sırasıyla, deksametazon ile tedavi edilen ve edilmeyen dsGSL8 -inducible RNAi hatları simgelemektedir. Ölçek çubuğu 0,2 cm temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. symplasmic hareketi vahşi tip Col-0 ile birlikte dex hipokotil kesim yüzeylerine ± dsGSL8 için HPTS yüklemeden sonra alındı ​​AtGSL8. Floresan görüntülerin bastırılması sonra artmıştır. DsGSL8 (+ dex) HPTS boya daha geniş bir hareket gösterdi artış ortaya konuldu symplasmic hareketi. Ölçek çubuğu 0,2 mm temsil eder.com / files / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Çizgiler bastırılmış Şekil 7. AtGSL8 hipokotil ışıklı ve gölgeli tarafları arasında simetrik PD kaloz dağılıma sahip olduğunu göstermiştir. 0 saatte dsGSL8 (-dex) için anilin mavisi kaloz boyama gösteren (A) Floresan görüntü. Fototropizma 6 saat sonra dsGSL8 (-dex) için anilin mavisi kaloz boyama gösteren (B) Floresans görüntüsü. Fototropizma 6 saat sonra dsGSL8 (+ dex) için anilin mavisi kaloz boyama gösteren (C) Floresan görüntü. Sarı oklar hipokotil gölgeli bölgeye kaloz birikimini göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 uM temsil eder. (D) am temsil eden Çubuk grafik şemasıöncesi ve Fototropizma 3 saat ve 6 saat sonra PD (dex ±) dsGSL8 birikmiş kaloz Hipokotillerin Miktarı. Floresan odakları yoğunlukları on bağımsız hipokotillerinden ölçüldü (veri ortalama ± SD vardır; Student t-testi, * p <0.01). Bu rakam dan modifiye edilmiştir (Han ve ark., 2014) 15. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede, bir stratejisi, bu nedenle, PD SEL ayrıntılı olarak anlatılmıştır değiştirilmiş PD kaloz ve e phototropic ve gravitropic yanıtlarında arızalı mutant / aşırı ifade çizgileri ekranlanması için kullanıldı. PD kaloz sentezi ve parçalanması esas kaloz sentaz ve β-1,3-glukanaz ile gerçekleştirilir, ancak bu enzimlerin düzenlenmesi çok yukan faktörlerle kontrol edilir. Böyle yukarı faktörler veya doğrudan PD düzenlenmesinde rol adaylar aramak için, biz tarama için bu yöntemi kurdunuz. Bu kurmak PD kaloz biyosentezini (gsl8) düzenleyen bazı temel enzimlerin mutantlar 15 ölümcül ve bu kurmak sınırlı olacaktır tür mutantlar sıralamak için bazı sınırlamalar vardır. Aday gen hızlı veya açık veya kapalı PD ile birlikte yavaş tropik tepki gösterir, ancak kaloz düzeyi değişmeden kalırsa da, daha sonra detaylı analiz ayrıca, adayların karakterize etmek gereklidir. kritik faktörler ve sorun giderme ProceHer adımda D eğ de özenli vardır. İlk olarak, orta hazırlanmasında, bitki gelişimini etkileyen önemli bir faktör 5.7-5.8 aralığında olmalıdır ortam, pH'ı. İkinci olarak, agar plakaları uygun yüzey kurutma önemlidir; Yüksek su içeriğine sahip agar plakalarından zarar vermeden 3 günlük fidelerin kaldırmak zordur. Bununla birlikte, ağar plakaları çok kurutma inkübasyon sırasında ortam bazı çatlaklara neden asimetrik fide büyümesi neden olabilir. Güçlü bir ağartıcı madde olarak, sodyum hipoklorit çözeltisi kullanılarak tohum yüzey sterilizasyonu sırasında bakımı, otoklavlanmış GKD 2 O tekrarlayan yıkanarak tamamen, sodyum hipokloritin uzaklaştırılması için özen gösterilmelidir. Eski hisse senetleri, MS plakaları mantar kontaminasyona neden olabileceğinden otoklava GKD 2 O, taze hazırlanmış ve aseptik ele alınmalıdır. Sterilizasyon sonrasında, tohumlar çimlenme senkronize etmek soğuk tedavi ile tabakalı edilir. Bu işlem, transferrin yoluyla gerçekleştirilebilirg doğrudan karanlık ortamlarda ya da ilk MS plakaları üzerine tohum süsleyen ve daha sonra karanlık koşullarda soğuk bir odada plakaları aktarılmasında soğuk bir odada ıslak tohum sterilize. Bu fideler daha homojen bir büyüme sağlar Ancak, ikincisi tercih ederim. tohum dotting da çok yakından noktalı tohumlar sonraki deneylerde aktarmak çok zor olan fide, üst üste gelen büyüme ile sonuçlanacaktır, çünkü iki bitişik tohumlar arasındaki mesafenin, en az 0.1 cm olmalıdır.

Uygun phototropic ve gravitropic yanıtlar için, fidan ışığa maruz kalmamalıdır ve hasarsız kalmalıdır. bitkiler yeşil ışığa tepki yok gibi beyaz ışık arka plan etkileri önlemek için, dikkatli bir şekilde karanlık bir odada bir yeşil ışık kaynağı altında fidan seçin. Yeşil ışık kaynağı şeffaf yeşil vinil sayfaları kullanarak beyaz ışık kaynağı kaplayarak oluşturulabilir. fidan seçmek için, steril bir kürdan en iyi seçenektir. inci dokununkolayca yeni bir plaka transfer edilebilir ve böylece e kürdan ile hipokotil çok alt kısmı fidan kaldırın. Fide tüm boyut ve kanca yönde benzer olmalıdır. Bizim Deneyler sırasında, biz kanca yönü ışık kaynağının karşı tarafında ise, bitkiler ışık kaynağı ile aynı kanca yönü ile bitkilerin daha hızlı tropik tepki gösterecektir gördük. Gravitropizma durumunda, genellikle 6-12 saat sürer Normalde, Fototropizma durumunda, tek bir, 3 saat içinde gerçek adaylar ve Col-0 ile bükülme açısı açık bir fark görebilirsiniz. Son olarak, istatistiksel ilgili verileri, üç biyolojik çoğaltır ve 20 fidan, her zaman ihtiyaç vardır en az olması için.

o sofistike araçlar ve enstrümantasyon gerekmez olarak farklı bitki geçmişleri arasında symplasmic hareketin kapsamını test etmek için, HPTS boya yükleme, uygun bir tekniktir. HPTS Yükleme deneyi için, g yüzdesiçok kırılgan ya da sert jel optimum sonuçlar vermeyecektir olarak HPTS agaroz blok El, büyük önem taşımaktadır. 10 ml su ile agaroz kaynamaya büyük hacimli bir şişeyi kullanımı gevşek kauçuk ile 50 ml lik bir erlen şişesi kullanımı olup daha iyidir. 4 ° C'de alüminyum folyo ile sarılmış tutulursa HPTS agaroz blok hazırlandıktan sonra bir hafta için kullanılabilir. HPTS yükleme deneyinde bir diğer önemli faktör hipokotil kanca bölgenin çıkarılmasıdır. Eksizyon keskin diseksiyon makas ile ve fide tüm benzer bir pozisyonda yapılmalıdır. künt makas ile eksizyon fidan istenmeyen hasara neden olabilir ve HPTS yükleme engelleyebilir. kaloz birikimi sonunda boya hareketi engel oluşturan bu tür değişikliklere tepki vermeye daha eğilimli olduğu Ayrıca, fide büyüme koşulları ve gelişim dönemleri, boya hareketinde önemli bir rol oynayabilir. Bu nedenle, optimum koşullar altında fide yetiştirme gereklidir. PD de kaloz önemli bir rol oynaroksin degrade oluşumu 15 için önemli olan PD SEL, regüle ederek solmuş fide tropik yanıtları. Kaloz seviyeleri anilin mavi veya immünolojik etiketleme ile lekeleme ile tespit edilebilir. Anilin Mavisi ile boyanmadan kaloz seviyesini tespit etmek için basit ve hızlı bir yöntemdir. hipokotil hücreleri yüksek turgor basıncı ve epi-manikür katmanı vardır, çünkü boya hücreleri nüfuz için, bu kolay değil. Bu nedenle, anilin, mavi boya kolayca nüfuz etmesini sağlar kesme boyama yöntemi geliştirmiştir. Ancak, normal kaloz boyama yöntemi kısıtlamasıdır boyama sonuçları etkilemek yeni kaloz sentezinin riski vardır. Bu etkileri önlemek için, boyama protokolü boyama tampona kaloz sintaz önleyicisi 2-B-deoksi glukoz (DDG) eklenmesiyle tadil edilmektedir. Böylece, bu protokol tam bir kesme yerine altında hipokotil alt bölgesinde önceden varolan kaloz ölçülmesini içerir. Taze HAZIRLIK kullanımını önlemekEd Mavi anilin ve kullanımdan önce 48 saat en az oda sıcaklığında anilin mavi bir çözelti tutun. Biz taze anilin mavisi çözeltisi ile boyanarak Optimum kaloz boyama sonuçları vermez olduğunu fark ettim.

Genel olarak, doğrudan ya da dolaylı olarak modüle PD kaloz PD SEL değiştirilmesiyle kusurlu ya da gelişmiş tropik yanıtı olan mutantlar / aşırı ifade çizgileri süratle taranması için kullanılabilir stratejilerin bir dizi sunulmuştur. Tropik tepkiler hakkında daha önceki bir gerçektir majorly gibi PINIOD 2-14 olarak oksin taşıyıcıları ve sinyalizasyon oyuncuların eylem sınırlı kalmıştır. Buna ek olarak, aynı zamanda hipokotil sistemi 15 bir oksin gradyanı sürdürmek oksinin symplasmic hareketinin önemli bir rol kurduk. Bu yöntemin basitliği ve çok yönlülük kuşkusuz böylece tropik tepkiler de dahil olmak üzere, bitki gelişiminde hayati bir rol oynuyor, PD SEL kendi düzenlenmesi için aday genlerin araştırılması kendi programını güçlendirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir açıklama yok.

Acknowledgments

Bu araştırma Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK-2015R1A2A1A10053576) tarafından desteklenmiştir ve Nesil BIOGREEN 21 Programı'nın bir hibe ile (SSAC, PJ01137901 hibe), Kırsal Kalkınma İdaresi, Kore Cumhuriyeti. RK, WS, ABB ve DK Beyin Kore 21 Artı programında (BK21 +) tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) Sigma H1529-1G Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose Dongin-Genomic GEL001-500G Used for HPTS agarose block
Microwave oven LG-Goldstar Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask Dong Kwang A0205 Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm) SPL life sciences SPL10035 Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples 
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm) Marienfeld Laboratory Glassware 101222 Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm SPL life sciences SPL11125 Plates to make MS agar medium
Scissors Germany Stainless HSB 942-11 Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture Duchefa P10453.01 MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Bioshop 3G30212 To make MS media.
Plant agar Duchefa P1001.1000 To solidify MS media.
Autoclave ALP CL-40L
Shaker Wise Mix SHO-1D To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips Sorenson 10040
1 ml pipette BioPette L-1101-2
Surgical tape MIcropore 1530-0 To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue) Sigma M5528-25G Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine Bioshop GLN001 Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG Sigma D8375-1G Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope Olympus FV1000MPE SIM To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer  I lab  K400 To mix media solution.
Aluminium foil SW cooking foil To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite Samjin Industry To surface-sterilized seeds

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. Experimental biology monographs. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204 (1937).
  2. Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
  3. Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
  4. Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
  5. Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
  6. Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
  7. Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
  8. Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883 (2006).
  9. Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
  10. Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
  11. Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
  12. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
  13. Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
  14. Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
  15. Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
  16. Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
  17. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 110, kaloz oksin tropizm hipokotil symplasmic hareketi mavi anilin 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisülfonik asit (HPTS) mutant
Bir Strateji Tropic Tepkisi kaloz aracılı Plasmodesmal Gating Rolü doğrulamak için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, R., Wu, S. W., Iswanto, A. B. … More

Kumar, R., Wu, S. W., Iswanto, A. B. B., Kumar, D., Han, X., Kim, J. Y. A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response. J. Vis. Exp. (110), e53513, doi:10.3791/53513 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter